基于Raf-MEK-ERK 信號通路探究梓醇對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠腦組織損傷的影響*

孟艷舉，王路，王獻清，郝志勇

（1.濮陽市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，濮陽 457005；2.濮陽市人民醫(yī)院麻醉科，濮陽 457005）

蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）是一種破壞性的腦卒中，病死率和致殘率較高，并伴有腦組織損傷和神經(jīng)功能障礙，SAH 后發(fā)生的早期腦損傷（EBI）被認為是導致SAH 患者預后不良的關(guān)鍵因素[1]。在EBI的各種病理過程中，自噬、細胞凋亡、神經(jīng)元直接死亡和壞死性凋亡是主要參與過程，其中自噬作為維持細胞和組織穩(wěn)態(tài)的一個重要分解代謝過程，是缺血性細胞損傷中防止細胞凋亡的重要保護機制[2]。已有研究證明，SAH 后激活自噬可抑制EBI 中的神經(jīng)元凋亡，具有神經(jīng)保護作用[3]。梓醇具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化和抗細胞凋亡等多種藥理作用，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有較好的治療作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，梓醇對創(chuàng)傷性腦損傷后大鼠的氧化應激和神經(jīng)炎癥具有改善作用[5]，且梓醇可以改善炎癥并促進自噬[6]，但梓醇對SAH 腦組織損傷的改善作用與自噬是否有關(guān)尚不完全明確。絲裂原活化激酶（MAPK）通過調(diào)節(jié)絲/蘇氨酸蛋白激酶（Raf）-絲裂原活化蛋白激酶（MEK）-細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）級聯(lián)信號通路，激活ERK 磷酸化，在細胞增殖、凋亡和自噬中起關(guān)鍵作用[7]。由于自噬受Ras/Raf/MEK/ERK信號通路調(diào)節(jié)，且Raf-MEK-ERK 信號通路參與創(chuàng)傷性腦損傷后海馬神經(jīng)發(fā)生[8-9]，由此推測Ras/Raf/MEK/ERK 信號通路可能通過調(diào)節(jié)自噬改善SAH 后腦組織損傷。而梓醇對SAH 大鼠腦組織損傷的影響與Raf-MEK-ERK 信號通路是否有關(guān)尚未有相關(guān)報道，研究通過建立SAH 大鼠模型，對其進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級SD 雄性大鼠60 只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2022-0004，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ℃左右，濕度55%，12 h 光暗循環(huán)，不禁水食。

1.2 主要試劑與儀器 梓醇（純度≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；二抗辣根酶標記山羊抗兔IgG、伊文思藍（EB，北京索萊寶公司）；原位末端標（TUNEL）試劑盒、U0126（美國Sigma 公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色液、Triton X-100（上海源葉生物公司）；牛血清白蛋白（BSA）、DAPI（上海愛必信生物公司）；一抗Raf、MEK、磷酸化MEK（p-MEK）、ERK1/2、p-ERK1/2、B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X 蛋白（Bax）、自噬基因Beclin-1、微管連接蛋白輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）和β-actin 抗體（美國賽默飛公司）。光學顯微鏡，德國徠卡公司；分光光度計，奧地利TECAN 公司。

1.3 模型分組、制備和給藥 將大鼠隨機分為假手術(shù)組、SAH 組、梓醇組、梓醇+U0126 組（梓醇+Raf-MEK-ERK 信號通路抑制劑U0126），每組15 只。采用血管內(nèi)穿孔法[10]構(gòu)建大鼠SAH 模型：麻醉大鼠，從頸外動脈殘端將鋒利的4-0 單絲尼龍縫合線插入右內(nèi)動脈，刺穿大腦前、中動脈分叉。造模大鼠出現(xiàn)呼吸急促、心率加快等癥狀，且剝離腦組織可見血性液體散在分布在腦底基底池部位，即為造模成功。假手術(shù)組與SAH 大鼠接受相同的手術(shù)，但未對血管進行穿孔。造模術(shù)后1 h，對各組大鼠進行干預，梓醇組大鼠靜脈注射10 mg/kg 的梓醇[5]，梓醇+U0126 組在梓醇組的基礎上注射0.05 mg/kg U0126[11]，假手術(shù)組和SAH 組注射相同劑量的生理鹽水。每天1 次，直至實驗結(jié)束。

1.4 檢測指標

1.4.1 神經(jīng)功能評估 造模后24 h 采用改良Garcia 法對大鼠進行神經(jīng)學評分，評估自發(fā)活動、四肢運動的對稱性、攀爬能力、觸覺反應、前爪伸展和身體本體感覺，評分范圍3～18 分，評分越高神經(jīng)功能越好。

1.4.2 SAH 分級 將大鼠腦基底池分為6 部分，其中每部分分級標準如下：0 級：無SAH；1 級：少量SAH；2 級：中度血凝，可見動脈；3 級：血凝塊阻塞節(jié)段內(nèi)的所有動脈。等級范圍從0～18。SAH 分級評分小于7 分的大鼠，沒有明顯的腦損傷。

1.4.3 腦組織含水量測定 SAH 后48 h 麻醉處死大鼠，每組取5 只大鼠采用標準干濕法測定腦含水量，取出造模側(cè)大腦稱質(zhì)量以獲得濕質(zhì)量。然后將腦組織在100 ℃干燥24 h 以獲得干質(zhì)量。腦水含量根據(jù)公式計算：（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

1.4.4 血腦屏障通透性檢測 麻醉大鼠，處死前1 h每組取5 只尾靜脈注射2% EB 溶液，體內(nèi)循環(huán)1 h后開胸，心臟灌注生理鹽水，分離取腦并稱質(zhì)量，腦組織以10 mL/kg 的比例浸入甲酰胺溶液中后勻漿，60 ℃孵育24 h，用分光光度計在620 nm 處測量滲出的EB 染料。

1.4.5 HE 染色觀察腦組織病理變化 取大鼠腦組織CA1 區(qū)，每組5 只，部分固定于4%多聚甲醛中（剩余凍存至-80 ℃），石蠟包埋，切片（5 μm）后用HE 染色，在光學顯微鏡下觀察。

1.4.6 免疫熒光染色 取上述部分腦組織CA1 區(qū)切片，用Triton X-100 處理后BSA 封閉，將樣品與TUNEL 試劑盒、一抗p-ERK1/2、LC3-Ⅱ（1∶1 000）在4 ℃孵育過夜，洗滌后與熒光二抗在37 ℃下孵育1 h。并用DAPI 進行核染，在顯微鏡下觀察拍照，使用Imagepro Plus 6.0 分析結(jié)果，并計算平均光密度（AOD）值。

1.4.7 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測蛋白表達 取上述凍存至-80 ℃的CA1 區(qū)腦組織，裂解后提取總蛋白，定量后按步驟將蛋白SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃下加入一抗Raf、MEK、p-MEK、ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、Bax、Beclin-1、LC3-Ⅱ（1∶1 000）和內(nèi)參β-actin 過夜孵育，清洗，在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000），孵育2 h。用ECL 發(fā)光顯影，觀察拍照，各條帶灰度值用Image J 軟件處理分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s），多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能評分和SAH 分級比較 與假手術(shù)組相比，SAH 組大鼠神經(jīng)功能評分減少，SAH 分級顯著增加（P＜0.05）；與SAH 組相比，梓醇組大鼠神經(jīng)功能評分增加，SAH 分級顯著減少（P＜0.05）；與梓醇組相比，梓醇+U0126 組大鼠神經(jīng)功能評分減少，SAH 分級顯著下降增加（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和SAH 分級比較（±s）Tab.1 Comparison of neurological function score and SAH grade in each group（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和SAH 分級比較（±s）Tab.1 Comparison of neurological function score and SAH grade in each group（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0．05；與SAH 組相比，#P＜0．05；與梓醇組相比，△P＜0．05。

組別動物數(shù)神經(jīng)功能評分（分） SAH 分級（級）假手術(shù)組1517．48±2．590．73±0．08 SAH 組159．72±2．24*14．06±1．59*梓醇組1515．39±2．01#5．28±0．72#梓醇+U0126 組158．31±1．55△15．65±1．63△

2.2 大鼠腦組織含水量和血腦屏障檢測結(jié)果 與假手術(shù)組相比，SAH 組大鼠腦組織含水量、EB 滲出量顯著增加（P＜0．05）；與SAH 組相比，梓醇組大鼠腦組織含水量、EB 滲出量顯著減少（P＜0．05）；與梓醇組相比，梓醇+U0126 組大鼠腦組織含水量、EB滲出量顯著增加（P＜0．05）。見表2。

表2 各組大鼠腦組織含水量和血腦屏障比較（±s）Tab.2 Comparison of brain water content and blood-brain barrier in each group（±s）

表2 各組大鼠腦組織含水量和血腦屏障比較（±s）Tab.2 Comparison of brain water content and blood-brain barrier in each group（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0．05；與SAH 組相比，#P＜0．05；與梓醇組相比，△P＜0．05。

組別動物數(shù)腦組織含水量（%） EB 滲出量（μg/g）假手術(shù)組572．58±6．313．74±0．38 SAH 組582．53±7．42*13．09±1．42*梓醇組570．39±6．18#7．28±1．05#梓醇+U0126 組585．35±7．01△14．62±0．95△

2.3 大鼠腦組織HE 染色結(jié)果 假手術(shù)組海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)正常，排列整齊，未觀察到明顯變性或壞死；SAH 組神經(jīng)元細胞排列相對松散，許多核固縮和核仁消失體積較小，染色較深，細胞數(shù)目減少；梓醇組神經(jīng)元損傷明顯減輕，結(jié)構(gòu)相對整齊，細胞死亡較少；梓醇+U0126 組相比于梓醇組神經(jīng)元損傷加重。見圖1。

圖1 大鼠海馬CA1 區(qū)HE 染色圖（×400）Fig.1 HE staining of rat hippocampal CA1 region(×400)

2.4 大鼠神經(jīng)元細胞凋亡結(jié)果 與假手術(shù)組相比，SAH 組TUNEL 陽性細胞數(shù)目增加，凋亡率升高（P＜0．05）；與SAH 組相比，梓醇組TUNEL 陽性細胞數(shù)目減少，凋亡率降低（P＜0．05）；與梓醇組相比，梓醇+U0126 組TUNEL 陽性細胞數(shù)目增加，凋亡率升高（P＜0．05）。見圖2 和表3。

圖2 大鼠神經(jīng)細胞凋亡情況（×400）Fig.2 Neuronal apoptosis in rats(×400)

表3 大鼠神經(jīng)元細胞凋亡率（±s）Tab.3 Neuronal apoptosis rate in rats（±s） %

表3 大鼠神經(jīng)元細胞凋亡率（±s）Tab.3 Neuronal apoptosis rate in rats（±s） %

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0．05；與SAH 組相比，#P＜0．05；與梓醇組相比，△P＜0．05。

組別動物數(shù)凋亡率假手術(shù)組52．39±0．27 SAH 組537．42±3．84*梓醇組512．57±1．68#梓醇+U0126 組541．08±2．37△

2.5 大鼠p-ERK、LC3-Ⅱ免疫熒光表達結(jié)果 與假手術(shù)組相比，SAH 組的LC3-Ⅱ、p-ERK 神經(jīng)元陽性表達顯著增強；與SAH 組相比，梓醇組LC3-Ⅱ、p-ERK 神經(jīng)元陽性表達進一步增強；與梓醇組相比，梓醇+U0126 組LC3-Ⅱ、p-ERK 神經(jīng)元陽性表達減弱（P＜0．05）。見圖3、圖4 和表4。

圖3 大鼠腦組織CA1 區(qū)LC3-Ⅱ表達（×400）Fig.3 Expression of LC3-Ⅱin CA1 region of rat brain tissue(×400)

圖4 大鼠腦組織CA1 區(qū)p-ERK 表達（×400）Fig.4 Expression of p-ERK in CA1 region of rat brain(×400)

表4 大鼠腦組織CA1 區(qū)LC3-Ⅱ、p-ERK 陽性表達情況（±s）Tab.4 Positive expression of LC3-Ⅱand p-ERK in CA1 region of rat brain tissue（±s）

表4 大鼠腦組織CA1 區(qū)LC3-Ⅱ、p-ERK 陽性表達情況（±s）Tab.4 Positive expression of LC3-Ⅱand p-ERK in CA1 region of rat brain tissue（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0．05；與SAH 組相比，#P＜0．05；與梓醇組相比，△P＜0．05。

組別動物數(shù)LC3-Ⅱp-ERK假手術(shù)組54．81±1．093．17±0．72 SAH 組516．24±1．57*15．27±1．63*梓醇組521．75±2．08#23．19±2．16#梓醇+U0126 組56．51±1．26△4．28±0．91△

2.6 大鼠自噬和凋亡蛋白表達比較 與假手術(shù)組相比，SAH 組Bax、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達升高，Bcl-2 表達降低（P＜0．05）；與SAH 組相比，梓醇組Bax 蛋白表達降低，Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ表達升高（P＜0．05）；與梓醇組相比，梓醇+U0126 組Bax蛋白表達升高，Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ表達降低（P＜0．05）。見圖5 和表5。

圖5 大鼠自噬和凋亡蛋白表達變化Fig.5 Changes of autophagy and apoptosis protein expression in rats

表5 大鼠自噬和凋亡蛋白表達比較（±s）Tab.5 Comparison of autophagy and apoptotic protein expression in rats（±s）

表5 大鼠自噬和凋亡蛋白表達比較（±s）Tab.5 Comparison of autophagy and apoptotic protein expression in rats（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0．05；與SAH 組相比，#P＜0．05；與梓醇組相比，△P＜0．05。

組別動物數(shù)BaxBcl-2Beclin-1LC3-Ⅱ假手術(shù)組50．81±0．09 1．05±0．11 0．91±0．12 1．01±0．11 SAH 組51．42±0．10* 0．58±0．08* 1．36±0．15* 1．42±0．17*梓醇組50．91±0．08# 0．92±0．09# 1．68±0．16# 1．95±0．21#梓醇+U0126 組51．55±0．11△ 0．51±0．06△ 1．08±0．14△ 1．06±0．15△

2.7 大鼠Raf-MEK-ERK 通路蛋白表達比較 與假手術(shù)組相比，SAH 組Raf、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2 蛋白表達升高（P＜0．05）；與SAH 組相比，梓醇組Raf、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2 蛋白表達進一步升高（P＜0．05）；與梓醇組相比，梓醇+U0126 組Raf、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2 蛋白表達降低（P＜0．05）。見圖6 和表6。注：A．假手術(shù)組；B．SAH 組；C．梓醇組；D．梓醇+U0126 組。

圖6 大鼠Raf-MEK-ERK 通路蛋白表達變化Fig.6 Changes of Raf-MEK-ERK pathway protein expression in rats

表6 大鼠Raf-MEK-ERK 通路蛋白比較（±s）Tab.6 Comparison of Raf-MEK-ERK pathway proteins in rats（±s）

表6 大鼠Raf-MEK-ERK 通路蛋白比較（±s）Tab.6 Comparison of Raf-MEK-ERK pathway proteins in rats（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0．05；與SAH 組相比，#P＜0．05；與梓醇組相比，△P＜0．05。

組別動物數(shù)Rafp-MEK/MEK p-ERK1/2/ERK1/2假手術(shù)組50．38±0．040．47±0．060．57±0．06 SAH 組51．25±0．13* 1．31±0．12*0．98±0．09*梓醇組51．49±0．15#1．55±0．17#1．46±0．14#梓醇+U0126 組50．54±0．10△ 0．62±0．09△0．71±0．09△

3 討論

EBI 是SAH 患者急性腦損傷和神經(jīng)功能障礙的最重要原因[12]。神經(jīng)元死亡被認為是EBI 的主要原因，可引發(fā)細胞毒性水腫和血腦屏障破壞。因此，減少神經(jīng)元死亡的數(shù)量可改善SAH 患者預后。研究發(fā)現(xiàn)，SAH 大鼠神經(jīng)元細胞數(shù)目減少，神經(jīng)功能評分下降，SAH 分級、腦組織含水量、血腦屏障通透性升高，表明SAH 后發(fā)生腦水腫，出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙和腦損傷。梓醇具有神經(jīng)保護作用，能有效改善急性腦缺血大鼠神經(jīng)功能障礙和腦水腫，減少腦細胞凋亡[13]。研究SAH 大鼠經(jīng)梓醇干預后，神經(jīng)元細胞數(shù)目增加，神經(jīng)功能評分升高，SAH 分級、腦組織含水量、血腦屏障通透性下降，表明梓醇能改善SAH后腦水腫，改善神經(jīng)功能障礙和腦損傷。

神經(jīng)元凋亡是SAH 后血腫的機械壓迫，血紅蛋白的毒性損傷和氧化應激導致的，可引發(fā)EBI 各種過程，是SAH 患者預后不良的關(guān)鍵因素。研究表明，抑制細胞凋亡，可改善SAH 后的EBI[14]。研究發(fā)現(xiàn)，SAH 大鼠神經(jīng)元細胞凋亡增加，促凋亡蛋白Bax 表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達降低，而梓醇干預后神經(jīng)元細胞凋亡減少，表明梓醇能減少SAH 大鼠神經(jīng)元凋亡。自噬是一種高度調(diào)控的細胞內(nèi)成分的降解方式，在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，在SAH 中發(fā)現(xiàn)自噬激活可以減少神經(jīng)元凋亡，而抑制自噬會加重神經(jīng)元凋亡[15]。研究發(fā)現(xiàn)，SAH 大鼠自噬標志物Beclin-1、LC3-Ⅱ表達增加，而梓醇干預后Beclin-1、LC3-Ⅱ表達進一步增加。且有研究發(fā)現(xiàn)梓醇可通過增強自噬來改善糖尿病腎病足細胞損傷[16]，表明梓醇可能通過促進SAH 大鼠自噬，減少神經(jīng)元凋亡。

MAPK 是一類廣泛存在于哺乳動物細胞中的激酶參與細胞生長、發(fā)育、分化、凋亡和細胞間功能同步等多種過程[17]。Raf/MEK/ERK 信號通路通過磷酸化上游Raf 分子激活下游分子ERK，將信號從膜傳遞到細胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)生理和病理過程中的細胞分裂、增殖、自噬和凋亡等[7]。ERK 在SAH 引發(fā)的腦損傷中發(fā)揮重要作用，通過激活MEK/ERK 通路并上調(diào)其蛋白表達增強突觸可塑性，改善SAH 后腦損傷[18]。Raf/MEK/ERK 通路在細胞凋亡和自噬中都起關(guān)鍵作用，Li 等[19]發(fā)現(xiàn)通過激活Raf/MEK/ERK 介導的細胞自噬可減輕脂多糖引起的鼠腎足細胞凋亡。此外，Sun 等[20]發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白通過黏著斑激酶（FAK）-ERK 途徑增強自噬改善大鼠SAH 后的EBI。研究中SAH 組Raf、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2 表達升高，Raf/MEK/ERK 通路激活，梓醇進一步促進Raf/MEK/ERK 通路的激活，與自噬蛋白表達趨勢一致。且ERK 抑制劑U0126 逆轉(zhuǎn)了梓醇對SAH 大鼠腦損傷的改善作用，表明梓醇可能是通過激活Raf/MEK/ERK 信號通路發(fā)揮對SAH 后腦損傷的改善作用。

綜上所述，梓醇能改善大鼠SAH 后腦損傷，減少細胞凋亡和神經(jīng)功能障礙，其作用機制可能與激活Raf/MEK/ERK 信號通路而增強自噬有關(guān)。該研究為改善SAH 后腦損傷提供了新思路，但梓醇對大鼠SAH 后腦損傷的其他分子機制仍有待闡明。