基于高效液相色譜指紋圖譜和量值傳遞的化痰解郁合劑質(zhì)量研究*

吳俊洪，梁少瑜，吳升偉，于 林，吳正治，曾永長△

（1. 深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，廣東 深圳 518035； 2. 廣東省深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所，廣東 深圳 518035； 3. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院，廣東 廣州 510370）

化痰解郁合劑由《備急千金要方》中的溫膽湯［1］加減而來，由法半夏、枳實、陳皮、白芍、竹茹、甘草、遠(yuǎn)志、香附、茯苓、郁金等藥材組方，具有理氣化痰、開竅解郁之功，臨床多用于痰濕內(nèi)阻之癲病的治療［2］。該方以煎劑形式應(yīng)用多年，療效確切，但由于服用量大，味苦、麻舌感強(qiáng)，影響患者的用藥依從性。本課題組在前期研究中優(yōu)化了復(fù)方的提取和制備工藝，開發(fā)出化痰解郁合劑，并制訂出相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［3］。本研究中建立了中試復(fù)方煎液的指紋圖譜，利用相似度軟件評價方中物質(zhì)成分群在小試、中試及中試不同工序間的差異；探討合劑生產(chǎn)過程中多種成分的轉(zhuǎn)移率和固形物含量的變化，為產(chǎn)品質(zhì)量控制和工藝放大評價提供理論支持?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 2030C 3D 型高效液相色譜儀及工作站、AP125WD 型電子天平（日本Shimadzu 公司，精度為0.01 mg）；BSA224S型電子天平（德國Sartorius公司，精度為0.1 mg）；GENIUS 16K型高速離心機(jī)（長沙市鑫奧儀器儀表有限公司）；SY-5000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TC-15型套式恒溫器（海寧市新華醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號為110736 - 201943，含量95.1%），橙皮苷對照品（批號為110721-201818，含量96.2%），辛弗林對照品（批號為110727-201809，含量99.5%），甘草苷對照品（批號為111610-201607，含量93.1%），甘草酸銨對照品（批號為110731-201720，含量97.7%），3，6' - 二芥子?；崽菍φ掌罚ㄅ枮?11848 - 201805，含量96.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；遠(yuǎn)志酸對照品（批號為151127，含量≥98%），西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6對照品（批號為151015，含量≥95%），遠(yuǎn)志皂苷B 對照品（批號為150629，含量≥98%），均來源于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。小試試驗使用藥材均收集于3 個產(chǎn)地（見表1），經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院中醫(yī)科于林教授鑒定均為正品?；岛蟿┲性嚿a(chǎn)3 批，在廣州市某符合GMP 要求的藥品生產(chǎn)企業(yè)內(nèi)開展，所用藥材飲片均購自廣州至信中藥飲片有限公司。

表1 藥材產(chǎn)地信息Tab.1 Information of producing areas of medicinal materials

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

復(fù)方煎液：利用Excel 軟件的RANDBETWEEN 函數(shù)生成隨機(jī)數(shù)［4］，將表1中不同產(chǎn)地的藥材隨機(jī)組合成10 批方劑（編號分別為S1 - S10）。取各批方劑藥材166 g，加水15 倍，煎煮2 次，各1.5 h，200 目篩濾過，合并濾液，混勻，即得。

單味藥材煎液：取表1 中不同產(chǎn)地的單味藥材，同復(fù)方煎液制備方法煎煮2次，合并煎液，混勻，即得。

合劑：取復(fù)方煎液，減壓濃縮至適當(dāng)體積，得濃縮液；15 000 r/ min 離心10 min，取上清液；加入輔料，攪拌使溶解，補(bǔ)足水分，混勻，即得。

2.2 指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件

色譜柱：依利特Supersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min 時5%A→9%A，8～70 min 時9%A→30%A，70～90 min 時30%A→45%A，90～95 min 時45%A→80%A，95～100 min 時80%A，100～105 min 時80%A→5%A，105～110 min時5%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 溶液制備

取橙皮苷、芍藥苷、辛弗林、3，6' - 二芥子?；崽?、遠(yuǎn)志酸、遠(yuǎn)志皂苷B、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、甘草苷、甘草酸銨對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇制成單一對照品溶液；各取適量，加甲醇制成每1 mL 分別含21.93，32.87，15.92，9.00，73.02，33.63，4.89，18.77，50.09 μg 的混合對照品溶液。取2.1 項下復(fù)方煎液（或單味藥材煎液）10 mL，加水稀釋至25 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取2.1項下分別缺枳實和陳皮，白芍的復(fù)方煎液，按供試品溶液方法制備，即得陰性對照溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察［5］

精密度試驗：取2.2.2項下復(fù)方煎液（S1）供試品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，以橙皮苷峰為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果前者的RSD≤0.19%（n=6），后者的RSD≤2.06%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2.2項下復(fù)方煎液（S1）供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，3，6，9，12，24，36 h 時按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，以橙皮苷峰為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果前者的RSD≤0.27%（n=7），后者的RSD≤2.92%（n=7），表明供試品溶液在室溫放置36 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取2.1 項下復(fù)方煎液（S1）適量，共6 份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定。以橙皮苷峰為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果前者的RSD≤0.48%（n= 6），后者的RSD≤2.22%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4 指紋圖譜建立及特征峰標(biāo)定

指紋圖譜建立：取2.2.2 項下復(fù)方煎液（S1 - S10）供試品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，得10 批復(fù)方煎液的指紋圖譜，導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版），以S1為參照圖譜，采用平均數(shù)法［6］，時間窗為0.1 min，設(shè)置多點(diǎn)校正和峰匹配，生成疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜，詳見圖1、圖2。以對照指紋圖譜為參照，各批復(fù)方煎液的相似度均大于0.920（見表2），表明不同批次煎液中主要物質(zhì)群的差異較小。以重復(fù)性好、分離度佳為篩選原則，共標(biāo)定20 個共有峰。在10批復(fù)方煎液的指紋圖譜中，共有峰峰面積與色譜峰總面積的比值為（59.52±2.60）%。

圖1 10批復(fù)方煎液高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprints of 10 batches of compound decoction

圖2 復(fù)方煎液高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.2 HPLC reference fingerprints of compound decoction

表2 10批復(fù)方煎液指紋圖譜相似度評價結(jié)果Tab.2 Results of similarity evaluation for fingerprints of 10 batches of compound decoction

特征峰標(biāo)定：取2.2.2項下的單味藥材煎液供試品溶液及混合對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以色譜峰的保留時間和色譜圖為依據(jù)，與復(fù)方煎液的指紋圖譜進(jìn)行比對（見圖3），指認(rèn)2號色譜峰為竹茹的特征峰；3，11，13～16，18，20 號色譜峰為遠(yuǎn)志的特征峰；6 號色譜峰為白芍的特征峰；19 號色譜峰為陳皮的特征峰；1，4，7，9，10，12 號色譜峰為枳實和陳皮共有；8，17 號色譜峰為法半夏、遠(yuǎn)志、甘草共有；5 號色譜峰為枳實、陳皮、白芍共有。同時從共有峰中指認(rèn)出9 個成分，分別為1 號峰（辛弗林）、3 號峰（西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6）、6 號峰（芍藥苷）、8 號峰（甘草苷）、11 號峰（3，6'-二芥子?；崽牵?、12 號峰（橙皮苷）、17 號峰（甘草酸）、18號峰（遠(yuǎn)志皂苷B）、20號峰（遠(yuǎn)志酸）。

圖3 復(fù)方煎液、混合對照品溶液和單味藥材煎液的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of compound decoction，mixed reference solution and single medicinal material decoction

2.2.5 中試制備過程中指紋圖譜的變化

取復(fù)方煎液、濃縮液、離心液和化痰解郁合劑各3批，分別精密量取1 mL，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（見圖4）。將上述4種樣品的指紋圖譜與建立的對照指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，其中前三者的平均相似度分別為0.936，0.886，0.865，且色譜峰數(shù)目基本一致；化痰解郁合劑的圖譜中出現(xiàn)2 個新色譜峰，相似度降低，其中21號峰為抑菌劑，22號峰為矯味劑。20個共有峰穩(wěn)定存在于中間產(chǎn)品及成品中，可用于評價化痰解郁合劑在不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)的質(zhì)量變化。

圖4 高效液相色譜指紋圖譜Fig.4 HPLC fingerprints

2.3 聚類分析

將10批小試和3批復(fù)方煎液（中試）的20個共有峰的峰面積進(jìn)行歸一化處理，導(dǎo)入SPSS 25.0 分析軟件，采用組間連接法，以平方歐式距離（d）為測量，將樣品進(jìn)行分類［7］，結(jié)果見圖5。煎液間存在不同程度的差異，當(dāng)d=1 時，中試3 批聚為一類，表明生產(chǎn)工藝和藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性；當(dāng)d=10 時，中試3 批與除A1 和A5 外的8批小試煎液聚攏，提示藥材產(chǎn)地對煎液質(zhì)量的影響最大，生產(chǎn)批量及設(shè)備放大等因素次之。

圖5 小試（A1-A10）和中試（B1-B3）樣品的聚類樹狀圖Fig.5 Cluster tree of small-scale samples（A1-A10）and pilotscale samples（B1-B3）

2.4 中試生產(chǎn)的量值傳遞考察

取中試的單味藥材煎液、復(fù)方煎液、濃縮液、離心液和化痰解郁合劑各3批和小試的化痰解郁合劑10批，其中藥材按2020 年版《中國藥典（一部）》的方法測定，其余樣品按前期工作中建立的含量測定方法制備成供試品溶液［3］，進(jìn)樣分析，分別測定辛弗林、芍藥苷和橙皮苷的含量，色譜圖見圖3、圖6。計算中試不同樣品的含量和轉(zhuǎn)移率［8］，結(jié)果見表3和表4。將中試和小試的化痰解郁合劑中3 種指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率進(jìn)行對比，結(jié)果見圖7。

圖7 3種指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率Fig.7 Transfer rates of three indicator components

表3 樣品中辛弗林、芍藥苷和橙皮苷含量（%）Tab.3 Results of content determination of synephrine，paeoniflorin and hesperidin in samples（%）

表4 樣品中辛弗林、芍藥苷和橙皮苷的轉(zhuǎn)移率（%）Tab.4 Transfer rates of synephrine，paeoniflorin and hesperidin in samples（%）

2.5 出膏率、固形物含量和總質(zhì)量考察［9］

分別精密量取中試的復(fù)方煎液、濃縮液、離心液和化痰解郁合劑各25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥至恒重，置干燥器中冷卻30 min，精密稱定，計算固形物含量、總質(zhì)量及出膏率，其中固形物含量（g/ L）=M（g）/ 25 mL × 1 000，固形物總質(zhì)量（kg）= 固形物含量×V（L）÷1 000，出膏率（%）= 煎液固形物總質(zhì)量（kg）/藥材投料量（kg）×100%，其中M為25 mL 樣品中固物形的質(zhì)量，V為樣品總體積，結(jié)果見圖7和圖8。煎液體積較大，固形物含量低（7.46 g/L）；濃縮后，體積顯著減少，固形物含量提高（148.03 g/ L），但總質(zhì)量有所損耗；高速離心后，固形物的一部分以沉淀的形式被除去，導(dǎo)致其在離心液的含量（137.53 g/L）和總質(zhì)量均明顯下降；在配液步驟加入輔料，固形物含量和總質(zhì)量均增加，合劑的平均固形物含量和總質(zhì)量為141.60 g/L 和16.89 kg。3 批中試樣品的平均出膏率為（21.77±0.56）%，與小試樣品的結(jié)果一致。

圖8 固形物含量（A）和總質(zhì)量（B）的變化Fig.8 Changes of solid substance content（A）and total mass（B）

3 討論

3.1 指紋圖譜檢測波長選擇及成分指認(rèn)

本研究中采用二極管陣列檢測器全波長掃描模式檢測化痰解郁合劑在不同波長下的峰數(shù)目、響應(yīng)值和分離度，結(jié)果在230 nm 波長處圖譜基線平穩(wěn)，色譜峰響應(yīng)值較均衡，因此選擇其作為檢測波長。在指紋圖譜方法學(xué)考察時，對比各峰的出峰時間和光譜圖，明確了重復(fù)性和穩(wěn)定性較佳的色譜峰有20個，存在于復(fù)方煎液-濃縮液- 離心液- 合劑中，可用于監(jiān)測生產(chǎn)過程中樣品的質(zhì)量變化。

3.2 中試與小試的對比

在小試試驗中通過提取和配制工藝考察，確定了化痰解郁合劑初步的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，中試在此基礎(chǔ)上提高生產(chǎn)規(guī)模，根據(jù)中間產(chǎn)品和成品的質(zhì)量情況，并與小試進(jìn)行比較，對評價工藝放大的穩(wěn)定性具有重要意義。本次小試和中試生產(chǎn)主要有以下3 方面的區(qū)別，一是藥材投料量，小試為每批166 g，中試為每批83 kg；二是試驗設(shè)備，小試為電熱套、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、高速離心機(jī)等，中試為多功能提取罐、雙效濃縮器、管式離心機(jī)、全自動配液罐等；三是其他方面，包括計量工具、操作人員、生產(chǎn)場地等。指紋圖譜、轉(zhuǎn)移率及出膏率的分析結(jié)果顯示，中試煎液與對照指紋圖譜的相似度高，3 種指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率穩(wěn)定，出膏率與小試試驗結(jié)果相同，提示放大提取工藝穩(wěn)定；在不考慮輔料峰的情況下，從煎液、濃縮液、離心液到合劑，指紋圖譜中色譜峰的數(shù)目、峰形及保留時間基本一致，中試和小試的成品中各成分的轉(zhuǎn)移率相近，反映制劑工藝穩(wěn)定。

3.3 指標(biāo)成分的選擇

化痰解郁合劑由經(jīng)典名方溫膽湯加減化裁而來，方中以法半夏為君藥，枳實、竹茹為臣藥，陳皮、白芍、茯苓、郁金、香附、遠(yuǎn)志為佐藥；甘草為使藥。有文獻(xiàn)報道，枳實和陳皮中的辛弗林、橙皮苷為溫膽湯治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［10］。辛弗林通過調(diào)節(jié)大鼠大腦皮層內(nèi)的去甲腎上腺素水平、5 - 羥色胺水平、血清皮質(zhì)酮含量和糖皮質(zhì)激素受體（GR）表達(dá)水平，改善海馬細(xì)胞的病理變化，發(fā)揮抗抑郁作用［11］；橙皮苷可減少抑郁癥模型大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，調(diào)控海馬組織的GR、N- 甲基-D- 天冬氨酸受體（NR2B）表達(dá)［12］。而芍藥苷為白芍的主要成分之一，可改善精神分裂模型小鼠的認(rèn)知記憶功能，減輕焦慮行為，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡［13］。因此本研究中選擇上述3 種成分作為檢測指標(biāo)，考察復(fù)方在生產(chǎn)中的量值傳遞。

3.4 量值傳遞結(jié)果分析

中試生產(chǎn)的流程為藥材煎煮、濃縮、離心、配液、灌裝和外包裝，得合劑。根據(jù)在此過程中得到的辛弗林、芍藥苷和橙皮苷從藥材到合劑的總轉(zhuǎn)移率，結(jié)合各供試品溶液中的轉(zhuǎn)移率和三者的理化性質(zhì)可知，辛弗林易溶于水，熱穩(wěn)定性良好，各工序的轉(zhuǎn)移率均較高；芍藥苷在提取和濃縮中損失較多，可能與其長時間高溫加熱會發(fā)生降解有關(guān)［14］，在后續(xù)的影響因素試驗（高溫試驗）中亦出現(xiàn)了此現(xiàn)象；橙皮苷水溶性差，僅約20%從藥材轉(zhuǎn)移至煎液，經(jīng)濃縮和離心后，損失約50%。以上3 種成分在提取、濃縮、離心等工序呈現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)移特點(diǎn)，可為生產(chǎn)工藝評價和優(yōu)化提供參考。

辛弗林、芍藥苷和橙皮苷在中試樣品中的轉(zhuǎn)移率略低于小試樣品，一方面是受設(shè)備的結(jié)構(gòu)和使用方法所限，例如管式離心機(jī)腔體的“死體積”、灌裝機(jī)裝量調(diào)節(jié)等；另一方面，還與產(chǎn)品自身成分有關(guān)，由于本品含有較多的皂苷類成分，在生產(chǎn)中多個環(huán)節(jié)易混入空氣而產(chǎn)生泡沫，配液罐、濃縮罐、離心機(jī)進(jìn)料罐、儲液罐中可見大量白色泡沫，而且短時間內(nèi)不易消散，傳輸或利用困難，導(dǎo)致部分損失。

3.5 影響制劑質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

從指紋圖譜、轉(zhuǎn)移率、固形物等多方面綜合考慮，對制劑物質(zhì)基礎(chǔ)影響較大的工序有提取和離心。在前期工作中，本課題組利用信息熵賦權(quán)法結(jié)合正交試驗優(yōu)化了化痰解郁合劑的提取工藝。本研究中建立了復(fù)方煎液的指紋圖譜，考察中試復(fù)方煎液與對照指紋圖譜的相似度，結(jié)果顯示兩者的相似度高，聚類分析認(rèn)為中試3批樣品的質(zhì)量均一，工藝放大對復(fù)方煎液的質(zhì)量影響較小，為產(chǎn)品的藥效奠定了基礎(chǔ)。

離心可提高化痰解郁合劑的澄明度，并減少雜質(zhì)。在制備工藝試驗中對比了不同轉(zhuǎn)速對有效成分的影響，結(jié)果表明在8 000～16 000 r/min范圍內(nèi)無明顯差異。因此從提升制劑的澄明度角度出發(fā)，中試采用15 000 r/min進(jìn)行離心操作。濃縮液經(jīng)離心后，離心液中固形物含量和總質(zhì)量明顯減少，3 批濕沉淀的質(zhì)量為2.8～3.2 kg，約占濃縮液的2.5%。離心液的指紋圖譜和對照指紋圖譜的相似度也較高，提示藥效物質(zhì)基礎(chǔ)得以保留。

3.6 小結(jié)

本研究中建立的指紋圖譜可反映復(fù)方的整體化學(xué)成分特征，中試復(fù)方煎液的質(zhì)量與小試試驗結(jié)果一致，提取工藝可靠，為化痰解郁合劑的大規(guī)模生產(chǎn)夯實基礎(chǔ)；結(jié)合煎液、濃縮液、離心液和合劑中辛弗林、芍藥苷及橙皮苷的轉(zhuǎn)移率和固形物含量變化等數(shù)據(jù)，可為質(zhì)量和工藝控制提供參考。