甘畢舒HPLC特征圖譜的建立及與藥材共有峰歸屬研究

王歡 李彩虹 代龍 宋景 劉朝陽 劉亞東

摘 要：本試驗采用高效液相色譜法，流動相為甲醇溶液（A）-0.1%磷酸水溶液（B），采用梯度洗脫和變波長檢測，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 mL，柱溫 30 ℃，建立甘畢舒的特征譜圖并與藥材譜峰對比。結(jié)果表明：3批甘畢舒樣品特征圖譜中共有11個共有峰，并指認(rèn)出其中10個特征峰，各批次之間的相似度均大于0.93；單味藥材共有峰歸屬中除沒食子酸、柚皮苷、芍藥苷、黃芩苷、漢黃芩苷、綠原酸、新綠原酸、黃芩素、漢黃芩素、甘草酸外，7號峰來自黃芩藥材的未知成分。綜上所述，該方法具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確性穩(wěn)定的特點，可作于甘畢舒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：甘畢舒；HPLC特征圖譜；中獸藥

中圖分類號：S853.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1673-1085（2023）08-0003-06

甘畢舒是我公司根據(jù)多年的家禽臨床用藥經(jīng)驗，由茵陳、蒲公英、黃芩、白芍、陳皮、甘草等中藥配伍而成，臨床辨證為肝氣郁結(jié)兼見濕熱，用于肝腫大、肝發(fā)黑等家禽肝病的防治。本公司已經(jīng)開展了甘畢舒的藥學(xué)研究，初步建立了其定性質(zhì)量控制的方法[1]，但制劑整體質(zhì)量控制還缺乏研究。中獸藥制劑是多組分的復(fù)雜體系，湯劑復(fù)雜的化學(xué)成分是其發(fā)揮多靶點療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是質(zhì)量評價的重點和難點[2-3]。特征圖譜具有整體性、特征性及可量化等突出優(yōu)勢[4]，已逐步應(yīng)用于中獸藥制劑的質(zhì)量控制中。本研究建立甘畢舒的高效液相特征圖譜，通過指認(rèn)圖譜中共有峰的指標(biāo)性成分，并對其藥材歸屬進(jìn)行研究，獲得了專屬性強、重復(fù)性良好、準(zhǔn)確性穩(wěn)定的特征指標(biāo)，本研究所建立的特征圖譜，可作為甘畢舒的內(nèi)控質(zhì)量方法。

1 儀器和試劑

LC-2030型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；JA5003B型電子天平【上海越平科學(xué)儀器（蘇州）制造有限公司】；H21-X8型電陶爐（杭州九陽生活電器有限公司）。

甘畢舒口服液，三批，批號分別為20220414、20220402、20220605的樣品來自石家莊市九洲獸藥有限公司。新綠原酸對照品（批號B21396），純度≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司。甘草酸銨對照品（批號110731-202122），濃度為94.4%，購自中國食品藥品檢定研究院。沒食子酸對照品（批號wkq21090111）、柚皮苷對照品（批號wkq22012906）、黃芩苷對照品（批號wkq22010409）、漢黃芩苷對照品（批號wkq22022807）、芍藥苷對照品（批號wkq22030506）、綠原酸對照品（批號wkq22032106）、黃芩素對照品（批號wkq22030204）、漢黃芩素對照品（批號wkq22012903），純度均≥98%，購自四川省維克奇生物科技有限公司。甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，其它試劑均為分析純。水為純凈水，購自杭州娃哈哈集團有限公司。

茵陳、白芍、蒲公英、黃芩、陳皮、甘草藥材均由石家莊市九洲獸藥有限公司提供。經(jīng)專家鑒定，茵陳為菊科植物濱蒿（Artemisia scoparia Waldst. et Kit.）的干燥地上部分，白芍為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根，蒲公英為菊科植物蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand. -Mazz.）的干燥全草，黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，陳皮為蕓香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根和根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的配制 精密稱取適量的各對照純品，加甲醇配制成相應(yīng)的對照品溶液：沒食子酸51.27 μg/mL，柚皮苷26.08 μg/mL，芍藥苷34.29 μg/mL，黃芩苷60.41 μg/mL，漢黃芩苷50.56 μg/mL，綠原酸459.7 μg/mL，新綠原酸191.10 μg/mL，黃芩素519.40 μg/mL，漢黃芩素28.02 μg/mL，甘草酸221.60 μg/mL。

2.1.2 供試品溶液的配制 精密量取甘畢舒口服液2.5 mL，置于50 mL容量瓶中，加水約12.0 mL，混勻，加甲醇定容至刻度，混勻后，用0.22 μm微孔濾膜過濾即得。

2.1.3 單味藥材溶液的配制 取茵陳、蒲公英、黃芩、白芍、陳皮、甘草藥材各10 g，分別加水150 mL煎煮，武火（功率2 200 W）煮沸，文火（功率400 W） 保持微沸1 h，煎液用150目濾布濾過，凍干，精密稱取黃芩凍干粉0.2 g，其余藥材凍干粉0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，超聲（250 W，40 KHZ）30 min，放冷，濾過，濾液用0.22 μm微孔濾膜過濾即得。

2.2 色譜條件

色譜柱為kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；采用梯度洗脫，流動相為甲醇溶液（A）-0.1%磷酸水溶液（B），流速1.0 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL，檢測波長變化為：0～10 min，283 nm；10～22 min，327 nm；22～37 min，283 nm；37～58 min，254 nm；流動相梯度變化為：0～10 min，10%～20% A；10～20 min，20%～40% A；20～40 min，40%～70% A；40～50 min，70%～95% A；50～52 min，95% A；52～54 min，95%～10% A；54～58 min，10% A。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗 分別精密量取上述各對照品溶液，供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣測定，色譜結(jié)果顯示，經(jīng)過與對照品色譜圖對比，在供試品色譜圖中，沒食子酸、柚皮苷、芍藥苷、黃芩苷、漢黃芩苷、綠原酸、新綠原酸、黃芩素、漢黃芩素、甘草酸對照品保留時間相對應(yīng)的色譜峰有較好的分離度。另有1個未知峰（峰7來源于黃芩）在供試品色譜峰中分離度較好，峰面積較大且穩(wěn)定，也可用于專屬性檢驗，見圖1。

2.3.2 確定參照峰 經(jīng)高效液相色譜儀分析，在供試品溶液與對照品溶液的比較中，黃芩苷的色譜峰相較其它穩(wěn)定且含量較高，故選黃芩苷作為參照峰，計算共有峰的相對保留時間。

2.3.3 精密度試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（批號20220414），按照“2.2”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行測定。結(jié)果表明，特征峰相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均不大于0.03%，結(jié)果說明了儀器的精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 精密量取樣品（批號20220414）2.5 mL，按照“2.1.2”項下的方法制備供試品溶液6份，按照“2.2”項下的色譜條件分別進(jìn)樣測定，結(jié)果表明，特征峰相對保留時間的RSD均不大于0.4%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（批號20220414），放置于室溫，分別于0、4、8、12、16、24 h時，按照“2.2”項下的色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果表明特征峰相對保留時間的RSD均不大于0.07%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.4 特征圖譜的建立及相似度評價

2.4.1 特征圖譜的建立 樣品所得的色譜數(shù)據(jù)通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版）軟件進(jìn)行分析，生成全譜峰匹配圖。供試品特征圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)與對照品色譜峰保留時間相對應(yīng)的色譜峰。其中與參照物峰（峰6，黃芩苷）保留時間對應(yīng)的峰為S峰，分別在相對保留時間為0.209（峰1，沒食子酸）、0.541（峰2，綠原酸）、0.572（峰3，新綠原酸）、0.853（峰4，柚皮苷）、0.892（峰5，芍藥苷）、1.000（峰6，黃芩苷）、1.103（峰7，未知峰，漢黃芩苷附近）、1.124（峰8，漢黃芩苷）、1.241（峰9，黃芩素）、1.356（峰10，漢黃芩素）、1.457（峰11，甘草酸）呈現(xiàn)11個共有峰，見圖2。

2.4.2 相似度評價 3批甘畢舒物質(zhì)基準(zhǔn)的特征圖譜見圖3，特征圖譜相似度結(jié)果為20220414（S1）0.97，20220402（S2）0.937，20220605（S3）0.97。從結(jié)果可知，3批甘畢舒的物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜相似度＞0.93，說明甘畢舒的物質(zhì)基準(zhǔn)不同批次間的差異較小，制備工藝穩(wěn)定。

2.5 共有峰歸屬

分別取“2.1.3”項下的藥材溶液10 μL，進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖4。通過單味藥材溶液和樣品溶液的色譜峰相對保留時間和最大吸收波長對比，將11個共有峰進(jìn)行藥味歸屬。由圖4可知，各單味藥材貢獻(xiàn)的譜峰分別為甘草1個（11號峰）、黃芩5個（6、7、8、9、10號峰）、白芍2個（1和5號峰）、茵陳2個（2和3號峰）、蒲公英2個（2和3號峰）、陳皮1個（4號峰）；其中1號峰（沒食子酸）、5號峰（芍藥苷）為白芍藥材的特有成分；2號峰（綠原酸）、3號峰（新綠原酸）為茵陳、蒲公英藥材的共有成分；4號峰（柚皮苷）為陳皮藥材的特有成分；6號峰（黃芩苷）、7號峰（未知）、8號峰（漢黃芩苷）、9號峰（黃芩素）、10號峰（漢黃芩素）為黃芩藥材的特有成分；11號峰（甘草酸）為甘草藥材的特有成分。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

通過全波長掃描發(fā)現(xiàn)當(dāng)波長為 283 nm 時，供試品沒食子酸、柚皮苷、芍藥苷、黃芩苷、漢黃芩苷圖譜峰形較好，黃芩藥材的特征圖譜文獻(xiàn)中檢測波長采用280 nm[5-6]，陳皮藥材的高效液相色譜文獻(xiàn)中檢測波長采用283 nm[7]；327 nm時，綠原酸、新綠原酸圖譜峰形和分離度較好，這與文獻(xiàn)中綠原酸和新綠原酸特征圖譜的檢測波長相似[8-9]。254 nm波長下，甘草酸、黃芩素、漢黃芩素圖譜峰峰形較好，與文獻(xiàn)報道相符[10]，能夠較全面獲得甘畢舒的物質(zhì)基準(zhǔn)中成分信息，為此采用變波長檢測方法。

3.2 相似度評價

本研究通過HPLC建立的3批甘畢舒的特征圖譜能夠全面、綜合地反映口服液及各單味藥材所含化學(xué)組方。不同批次樣品間相似度均高于0.93，體現(xiàn)了在甘畢舒制劑工藝過程中對各中藥材所含的化學(xué)組分影響較小，制劑組分整體穩(wěn)定。3.3 共有峰歸屬

本研究中采用共有峰歸屬特征圖譜手段對甘畢舒開展研究，對口服液中色譜光譜可視化成分進(jìn)行了來源辨析和歸屬，為制劑進(jìn)一步合理化綜合質(zhì)量控制和保證產(chǎn)品的臨床療效奠定基礎(chǔ)。

本研究中建立了甘畢舒的特征圖譜，峰數(shù)目、保留時間及共有峰等評價良好，可整體反映甘畢舒的物質(zhì)相關(guān)特性，同時結(jié)合甘畢舒和單味藥材特征譜圖共有峰歸屬研究，初步明確了甘畢舒組分的來源歸屬，質(zhì)控結(jié)果更加合理化。

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HPLC Specific Chromatograms and Peak Attribution Research

for Ganbishu

WANG Huan1， LI Caihong1， DAI Long2， SONG Jing2， LIU Chaoyang1， LIU Yadong1

（1. Shijiazhuang Jiuzhou Veterinary Medicine Co.，LTD， Shijiazhuang ?050000， China;

2. Binzhou Medical University， Binzhou ?256600， China）

Abstract： ?HPLC was performed using a mobile phase consisting of methanol solution （A） and 0.1% phosphoric acid solution （B） through gradient elution. The detection was carried out at variable wavelengths with a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was maintained at 30°C. A sample size of 10 μL was used. The results showed that there were 11 common peaks which 10 of them were identified in the characteristic spectrum of 3 batches of Gambishu samples. The similarity between the three batches of Ganbishu was found to be greater than 0.93. In addition to gallic acid， naringin， paeoniflorin， baicalin， wogonoside， chlorogenic acid， neochlorogenic acid， baicalein， wogonin and glycyrrhizic acid， peak No. 7 was from the unknown component peak of Scutellaria baicalensis Georgi. In conclusion， the method with good repeatability， accuracy and stability can be used for the quality control of Gambishu.

Keywords： ?Ganbishu; HPLC specific chromatograms; Veterinary traditional chinese medicine