雞傳染性支氣管炎診斷方法的研究進(jìn)展

夏立業(yè)

摘 要：雞傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒引起的一種呼吸道傳染病。傳染性支氣管炎病毒傳染性較強(qiáng)，給養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重威脅。該病毒具有較多的血清型，且經(jīng)常出現(xiàn)變異，因此需要做好雞傳染性支氣管炎的診斷工作，能最大程度控制本病的傳播。本文綜述了病毒分離鑒定、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等幾種常用的雞傳染性支氣管炎診斷方法，以期為生產(chǎn)中該病的準(zhǔn)確診斷提供參考。

關(guān)鍵詞：雞傳染性支氣管炎病毒；病毒分離鑒定；血清學(xué)診斷；分子生物學(xué)診斷

中圖分類號(hào)：S854.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-1085（2023）08-0070-04

傳染性支氣管炎是危害雞的一種重大疾病，給世界養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。該病的病原為雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV），是一種典型的RNA病毒，具有突變率和重組率高的特點(diǎn)，在不同的國(guó)家或地區(qū)往往流行不同的血清型[2]。雞傳染性支氣管炎的臨床癥狀與其他禽類的呼吸道感染性疾病相似，很難與其他呼吸道病毒感染區(qū)分開(kāi)來(lái)[3]，這就對(duì)雞傳染性支氣管炎病毒感染的診斷方法提出了很高的要求。近年來(lái)，由于禽類養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，也給該病的防控帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。本文綜述了病毒分離鑒定、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等幾種用于雞傳染性支氣管炎診斷的主要方法，以期為該病的準(zhǔn)確診斷提供一定的參考。

1 病毒分離鑒定

病毒分離鑒定是雞傳染性支氣管炎的常見(jiàn)診斷方法。在養(yǎng)殖過(guò)程中，為了診斷雞群中是否存在感染傳染性支氣管炎病毒的雞，應(yīng)分別從健康雞和有臨床癥狀的雞體內(nèi)采集樣本。由于該病主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，通常選擇疑似感染傳染性支氣管炎的患病雞氣管組織或拭子作為待檢測(cè)的樣本，若處于急性發(fā)病期，特別是剖檢存在病變時(shí)，也可以采集患病雞的腎臟或輸卵管[4]；同時(shí)可以嘗試采集盲腸扁桃體和泄殖腔拭子，但這些部位的病毒分離率一般較低。當(dāng)試圖采取分離病毒的方法進(jìn)行該病的診斷時(shí)，應(yīng)盡早采集樣本，因?yàn)殡u傳染性支氣管炎病毒的滴度在感染后第一周即達(dá)到峰值，這時(shí)可能某些患病雞的臨床表現(xiàn)還不明顯。所采集的樣本應(yīng)小心地存放在冰上，并迅速送往實(shí)驗(yàn)室，以最大限度地保持病毒活力。雞胚腎上皮細(xì)胞和腎成纖維細(xì)胞等可用于雞傳染性支氣管炎病毒的分離，但無(wú)特定病原體雞的雞胚尿囊腔或氣管組織培養(yǎng)物接種被認(rèn)為是分離該病毒更有效的方法[5]。雞傳染性支氣管炎病毒在雞胚中培養(yǎng)時(shí)可引起尿酸鹽沉積，胚胎發(fā)育遲緩、蜷曲或死亡，而在氣管組織培養(yǎng)物中培養(yǎng)可造成纖毛停滯。當(dāng)使用雞胚接種培養(yǎng)時(shí)，通常需要連續(xù)傳代三次才能夠觀察到病變，而使用氣管組織培養(yǎng)物接種培養(yǎng)時(shí)則在第一次傳代后即可見(jiàn)。但無(wú)論采取上述哪種接種方式，不能僅僅依靠觀察到的上述病變作為確診該病的依據(jù)，還應(yīng)該采用血清學(xué)或分子生物學(xué)的方法對(duì)病毒分離株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。金娟等[6]利用雞胚培養(yǎng)、氣管環(huán)及動(dòng)物回歸試驗(yàn)、電鏡觀察、RT-PCR等多種方法相結(jié)合的方式成功從疑似患病雞組織病料中分離到1株雞傳染性支氣管炎病毒。目前，病毒分離鑒定的診斷方法耗時(shí)較長(zhǎng)且實(shí)驗(yàn)要求較高，因此在實(shí)際生產(chǎn)中并不常用，但它仍用于病毒致病性評(píng)估、疫苗保護(hù)作用評(píng)估等其他幾個(gè)領(lǐng)域。

2 血清學(xué)診斷方法

目前，用于雞傳染性支氣管炎病毒診斷的血清學(xué)方法主要包括瓊脂凝膠沉淀試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、病毒中和試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn)。

瓊脂凝膠沉淀試驗(yàn)反應(yīng)快速，成本也不高，但需要制備用于沉淀反應(yīng)的IgM抗體，且其反應(yīng)的敏感性較差，只有在感染幾周后才能檢測(cè)出來(lái)，所以沒(méi)有得到廣泛的應(yīng)用。

考慮到成本和操作的便捷性等因素，ELISA是最常用于傳染性支氣管炎病毒常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)的方法，該方法還可用于監(jiān)測(cè)蛋雞和種雞中雞傳染性支氣管炎疫苗接種后的反應(yīng)情況。程旭等[7]以感染QX型雞傳染性支氣管炎的Vero細(xì)胞適應(yīng)株為包被抗原建立了一種間接ELISA抗體檢測(cè)方法，可應(yīng)用于免疫雞群后抗體水平監(jiān)測(cè)及早期感染預(yù)警。李新偉[8]針對(duì)新疆某養(yǎng)禽公司雞傳染性支氣管炎免疫情況進(jìn)行ELISA抗體監(jiān)測(cè)，通過(guò)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)為新疆雞傳染性支氣管炎免疫程序的調(diào)整提供了依據(jù)。由于抗體滴度可能會(huì)受到雞群的品種、日齡、接種計(jì)劃和時(shí)間等多種因素影響，因此，對(duì)于定期監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖場(chǎng)，需要確定基準(zhǔn)值以確保監(jiān)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性[9]?，F(xiàn)有的大多數(shù)ELISA試劑盒在設(shè)計(jì)時(shí)主要是采用的針對(duì)雞傳染性支氣管炎病毒全病毒粒子的多克隆抗體，并不能用于血清分型。近年來(lái)，研發(fā)人員已經(jīng)陸續(xù)開(kāi)發(fā)出了幾種新型的商用ELISA試劑盒，這些試劑盒采用的是基于病毒血清型或菌株特異性設(shè)計(jì)的單克隆抗體，可精準(zhǔn)檢測(cè)出病毒的血清型分類[10]。

病毒中和試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn)可以識(shí)別雞傳染性支氣管炎病毒血清型特異性抗體，因此有助于區(qū)分野毒毒株和疫苗毒株。然而，由于使用血凝抑制試驗(yàn)時(shí)容易發(fā)生交叉反應(yīng)，而病毒中和試驗(yàn)進(jìn)行常規(guī)監(jiān)測(cè)又過(guò)于費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此病毒中和試驗(yàn)更多的是作為血清分型的方法來(lái)應(yīng)用。此外，最近還開(kāi)發(fā)了其他血清學(xué)診斷方法，但這些方法的商業(yè)化和臨床使用還需要一段時(shí)間[11-12]。

3 分子生物學(xué)診斷方法

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)檢測(cè)手段的不斷發(fā)展和完善，該方法已成為雞傳染性支氣管炎病毒檢測(cè)中使用最多的工具。這類方法的靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間快，不僅能用于病毒的快速檢測(cè)，還可以從遺傳角度對(duì)檢測(cè)到的毒株特征進(jìn)行描述，從而可以合理地制定疫苗接種方案。目前，很多分子生物學(xué)的診斷方法都是基于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR），這些方法有的是針對(duì)幾乎所有雞傳染性支氣管炎病毒亞型的通用方法，有的則是針對(duì)其基因型或毒株的特異性方法。采用RT-PCR方法可對(duì)樣本中存在的病毒進(jìn)行定量，這有助于判斷疾病是否主要由雞傳染性支氣管炎病毒引起，而且定量檢測(cè)疫苗毒株滴度還可用于評(píng)估疫苗接種效果和持久性。趙秀美等[13]通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)雞傳染性支氣管炎病毒株5′端非編碼區(qū)保守區(qū)域序列的特異性引物，建立了一種能夠快速定量檢測(cè)該病原且具備良好特異性和重復(fù)性的RT-PCR方法。雞傳染性支氣管炎病毒的遺傳變異主要集中于病毒的S1基因，因此該基因也成為PCR方法最常用的靶向區(qū)域。陳淑琴等[14]根據(jù)不同基因型的雞傳染性支氣管炎病毒S1基因序列差異較大的區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針后建立的RT-PCR檢測(cè)方法，能夠快速鑒別GVI-1基因型毒株與其他基因型毒株。當(dāng)存在多個(gè)毒株同時(shí)感染的情況時(shí)，通用的RT-PCR和Sanger測(cè)序只能檢測(cè)到具有最高滴度的一個(gè)毒株。而不同引物的特異性不同也可能引起檢測(cè)結(jié)果的偏差，因此不同的檢測(cè)方法檢測(cè)到不同的毒株是很常見(jiàn)的。在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)該針對(duì)養(yǎng)殖地區(qū)流行的毒株來(lái)選擇通用或特異性的RT-PCR檢測(cè)方法。

限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析是一種通過(guò)病毒基因限制性酶切圖譜進(jìn)行分型的方法。該方法結(jié)合了RT-PCR技術(shù)，主要原理是提取編碼病毒抗原表位基因，采用RT-PCR擴(kuò)增DNA片段，隨后用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行處理，根據(jù)酶切圖譜進(jìn)行病毒分型。Kwon等[15]采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出含S1基因、長(zhǎng)度為1 720 bp的傳染性支氣管炎病毒基因序列，隨后進(jìn)行純化及限制性內(nèi)切酶處理檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果與中和試驗(yàn)得出的病毒血清分型一致，表明限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)可用作雞傳染性支氣管炎病毒診斷。但值得注意的是，雞傳染性支氣管炎病毒會(huì)不斷發(fā)生變異和進(jìn)化，因此需要定期更新所用的限制性內(nèi)切酶。

近年來(lái)，其他的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、核酸探針技術(shù)和基因芯片技術(shù)等也已被用于雞傳染性支氣管炎病毒的檢測(cè)。Wu等[16]將RT-LAMP與橫向流動(dòng)試紙（LFD）相結(jié)合，建立了一種能同時(shí)檢測(cè)雞傳染性支氣管炎病毒和新城疫病毒的新型檢測(cè)方法。趙玉佳等[17]構(gòu)建了聯(lián)合檢測(cè)雞傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒和新城疫病毒的基因芯片，并對(duì)芯片的敏感性、特異性及穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示該檢測(cè)技術(shù)能夠用于臨床病料中上述三種病原的檢測(cè)和快速診斷。此外，下一代測(cè)序技術(shù)最近也被用于研究，盡管目前這種方法對(duì)于常規(guī)使用來(lái)說(shuō)過(guò)于昂貴和費(fèi)力，但也可實(shí)現(xiàn)特定的檢測(cè)目的[18]。

4 小結(jié)

傳染性支氣管炎嚴(yán)重影響到雞的健康生長(zhǎng)，為了降低該病的發(fā)生率，需做好日常監(jiān)測(cè)和預(yù)防，而對(duì)該病的準(zhǔn)確診斷是有效開(kāi)展防控的基本保障，具有十分重要的意義。目前，該病的診斷方法除了上述提到的病毒分離鑒定、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷三種主要方法外，免疫組織化學(xué)技術(shù)和蛋白芯片技術(shù)等也得到了探索和應(yīng)用。但無(wú)論哪種方法都有各自的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)，單一一種方法在目前都還難以完全滿足檢測(cè)所要求的快速、靈敏、特異、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和實(shí)用等。因此，在實(shí)際檢測(cè)時(shí)應(yīng)該根據(jù)需要，結(jié)合擁有的實(shí)驗(yàn)條件和操作經(jīng)驗(yàn)，選擇最適宜的檢測(cè)方法或?qū)⒉煌姆椒ńY(jié)合起來(lái)應(yīng)用，以便能夠獲得最好的效果。

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Advances in Diagnostic Methods of Avian Infectious Bronchitis

XIA Liye

（People's Government of Aoqi Town in the Suburb of Jiamusi City， Jiamusi ?154012， China）

Abstract： ?Avian infectious bronchitis is a respiratory infectious disease caused by infectious bronchitis virus. Infectious bronchitis virus （IBV） is highly infectious， which poses a serious threat to the healthy development of chicken industry. The IBV has many serotypes and often mutates， so it is necessary to do a good job in the diagnosis of infectious bronchitis in order to control the spread of the disease. In this paper， several common diagnostic methods of avian infectious bronchitis， such as virus isolation and identification， serological diagnosis and molecular biological diagnosis， were reviewed in order to provide the reference for the diagnosis of the disease.

Keywords： ?Avian infectious bronchitis virus; Virus isolation and identification; Serological diagnosis; Molecular biological diagnosis