尼羅羅非魚Rab11-FIP5的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

宋漫玲　潘傳燕　王則奮　馮鵬霏　張永德　羅洪林　

尼羅羅非魚Rab11-FIP5的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

宋漫玲1潘傳燕2王則奮1馮鵬霏2張永德2羅洪林2

（1.廣西產(chǎn)研院生物制造技術(shù)研究所有限公司，廣西 南寧 530201；2.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021）

為研究尼羅羅非魚Rab11效應(yīng)因子FIP5（Rab11-FIP5）的基因功能，試驗(yàn)設(shè)計(jì)了Rab11-FIP5基因序列用于原核表達(dá)載體，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-B2m-Rab11-FIP5，隨后誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白Rab11-FIP5，表達(dá)產(chǎn)物純化后免疫日本大耳兔制備Rab11-FIP5多克隆抗體，采用ELISA和Western Blot方法分析鑒定目的蛋白。結(jié)果：Western Blot檢測結(jié)果顯示有清晰目的條帶，且條帶單一，分子量約為62 KD，與預(yù)期分子量一致；ELISA檢測抗體效價為1：2 048 000，說明效價符合抗體標(biāo)準(zhǔn)，性能良好。結(jié)論：成功制備了Rab11-FIP5多克隆抗體，為開展Nt-Rab11-FIP5的定位和功能研究提供了基礎(chǔ)工具。

尼羅羅非魚；原核表達(dá)；多克隆抗體

引言

羅非魚是我國優(yōu)勢水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，具有蛋白含量高、生長快、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，羅非魚相關(guān)產(chǎn)業(yè)在沿海地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和帶動農(nóng)民增收、脫貧致富方面做出了重要貢獻(xiàn)。近年羅非魚養(yǎng)殖頻發(fā)的病害制約著相關(guān)產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，造成的經(jīng)濟(jì)損失無可計(jì)數(shù)。Rab11家族相互作用蛋白（Rab11-FIPs，也被稱為FIPs）是一個進(jìn)化保守的蛋白家族，研究確認(rèn)FIPs在調(diào)控真核細(xì)胞內(nèi)吞循環(huán)中扮演著關(guān)鍵角色[1,2]。至今為止，魚類Rab11基因相關(guān)功能研究鮮有報(bào)道。Rab11基因被發(fā)現(xiàn)在斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起著重要但截然不同的作用，該研究結(jié)果為Rab11基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中起功能作用提供了新的證據(jù)[3]。張宇等[4]發(fā)現(xiàn)大黃魚全身組織均有Rab11蛋白表達(dá)，溶藻弧菌刺激后大黃魚的肝臟、腎臟和脾臟組織中Rab11蛋白水平均明顯上升，表明了Rab11基因在大黃魚的抗病免疫反應(yīng)中存在重要作用。夏正龍[5]在發(fā)掘羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）免疫相關(guān)基因時，發(fā)現(xiàn)了Mr Rab11基因在肝胰腺中的表達(dá)量最高，其次是肌肉和腸道；陰溝腸桿菌感染12 h后，羅氏沼蝦肝胰腺中Mr Rab11的表達(dá)量相比于對照組顯著提高，推測Mr Rab11參與羅氏沼蝦在肝胰腺中的應(yīng)激免疫過程。上述文獻(xiàn)報(bào)道均有表明Rabll基因參與了機(jī)體對細(xì)菌和病毒免疫，且Rabll基因?qū)?xì)菌和病毒的免疫機(jī)制可能存在差異。

Rab11-FIP5是FIPs家族的一種效應(yīng)蛋白分子，也被稱為Rip11或者Gaf-1/Gaf1b和pp75，其蛋白質(zhì)的N端包含與膜磷酸肌醇結(jié)合的C2結(jié)構(gòu)域，大部分位于極化的上皮細(xì)胞中，并與Rab11 GTPases發(fā)生相互作用，在細(xì)胞骨架重排、鐵攝取、胞吐等多種細(xì)胞生命活動中發(fā)揮作用。最初Rab11-FIP5是在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清中發(fā)現(xiàn)[6]，隨后發(fā)現(xiàn)其可調(diào)節(jié)內(nèi)吞蛋白的運(yùn)輸和靶向[1]。研究發(fā)現(xiàn)Rab11-FIP5在脂肪細(xì)胞對胰島素治療的反應(yīng)中負(fù)責(zé)易位，把含有GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)體的囊泡易位至細(xì)胞表面，同時也調(diào)節(jié)其他膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)蛋白的募集[7]。敲除siRNA的蛋白表明了Rab11-FIP5存在于外周核內(nèi)體，調(diào)節(jié)內(nèi)在受體的分類到緩慢的循環(huán)途徑，還發(fā)現(xiàn)了一種與Rip11/fip5結(jié)合的蛋白激肽II，這證明了Rab11-FIP5是引導(dǎo)內(nèi)吞胞內(nèi)蛋白進(jìn)入相同循環(huán)通路所必需分子[8]。文獻(xiàn)研究顯示，Rab11-FIP5與兩棲類胚胎的端腦發(fā)育密切相關(guān)，Rab11-FIP5的敲除降低了端腦的細(xì)胞增殖[9]。綜上所述，Rab11-FIP5的功能研究涉及機(jī)體發(fā)育等生命活動，但魚類Rab11-FIP5的功能研究尚未見相關(guān)報(bào)道，更缺少用于后續(xù)研究的商業(yè)化抗體。為研究尼羅羅非魚Rab11-FIP5的功能特性，本研究將尼羅羅非魚Rab11-FIP5基因克隆至原核表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-B2m-Rab11-FIP5進(jìn)行表達(dá)和純化，免疫日本大耳兔獲得Rab11-FIP5多克隆抗體，為進(jìn)一步研究尼羅羅非魚Rab11-FIP5的生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　主要材料與儀器

1.1.1 樣品

尼羅羅非魚cDNA（由廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.1.2 主要菌株及試劑

主要菌株：表達(dá)載體pET-B2m和表達(dá)宿主菌B21（購自武漢金開瑞生物工程有限公司）。

主要試劑：限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、蛋白marker和DNA聚合酶（Fermentas，美國），異丙基-β-D硫代半乳糖苷誘（IPTG）（MERCK，德國），弗式完全佐劑和弗氏不完全佐劑（Sigma，美國），PVDF膜（聚偏氟乙烯膜）（ThermoFisher，美國），羊抗兔-HRP抗體（Jackson，美國），親和層析柱料（GE Healthcare，美國）。

1.1.3 主要儀器

高速冷凍離心機(jī)Avanti J-26XP（購自貝克曼公司），恒溫?fù)u床TS-211C（購自上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司），梯度PCR儀（購自德國Biometra公司），快速蛋白純化系統(tǒng)AKTA Purifier UPC 100（購自GE Healthcare）等。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白結(jié)構(gòu)分析和抗原預(yù)測

利用在線軟件ExPASy中的ProtScale模塊（網(wǎng)址：https://web.expasy.org/protscale/）對Rab11-FIP5蛋白質(zhì)疏水性分析，TMHMM server v.2.0（網(wǎng)址：http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM-2.0/）預(yù)測蛋白序列的跨膜區(qū)間，DNAstar軟件的Protean模塊預(yù)測蛋白的親水性、抗原指數(shù)等參數(shù)。

1.2.2Rab11-FIP5基因擴(kuò)增及原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)尼羅羅非魚Rab11-FIP5基因序列（NCBI No. XP_019204508.1），使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，在引物5' 端添加一段載體同源性序列。交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列為Rab11-FIP5-F：5'-TCCACTGGGTTCTCGGACTATGTTTACCCGTGATA-3'；Rab11-FIP5-R：5'-TAAGGCCGCACTCGAGCACCACTTATT TACTACGAACCTGC-3'。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后進(jìn)行產(chǎn)物檢測。采用無縫克隆技術(shù)，構(gòu)建pET-B2m-Rab11-FIP5原核表達(dá)系統(tǒng)繼續(xù)培養(yǎng)，之后進(jìn)行產(chǎn)物測序鑒定。

1.2.3重組蛋白的表達(dá)和純化

將重組質(zhì)粒（pET-B2m-Rab11-FIP5）轉(zhuǎn)化至大腸桿菌B21中，挑取單菌落接種于100 g·mL-1LB/Amp+培養(yǎng)基培養(yǎng)，過夜。收集過夜菌液，并超聲破碎，運(yùn)用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法分析所得上清液和沉淀。采用Ni-NTA樹脂層析柱純化重組蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳方法檢測蛋白純度。

1.2.4動物免疫和重組蛋白Rab11-FIP5多抗制備及效價檢測

用純化后的融合蛋白Rab11-FIP5作為抗原免疫兩只成年日本大耳白兔，抗原注射量為500 μg/只，首次免疫將目的蛋白乳化，和弗氏完全佐劑等體積混勻后背部皮下多點(diǎn)注射大耳白兔進(jìn)行免疫，之后每隔14天將目的蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混勻注射大耳白兔做加強(qiáng)免疫，免疫次數(shù)至少4次/只，對每次免疫1周后的大耳白兔耳靜脈采血于室溫靜置2 h，或者是放置溫度為4 ℃的冰箱中過夜，收集析出血清于-20 ℃下保存；陰性對照為日本大耳白兔免疫前血清。根據(jù)說明書使用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定分析陰性、陽性血清的效價。

1.2.5抗體特異性的Western blotting分析

將制備的蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，以免疫前血清為陰性對照，所得的抗Rab11-FIP5蛋白多克隆抗血清稀釋液（稀釋1000倍）為一抗，37 ℃孵育1小時，洗滌后再加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（稀釋10 000倍）繼續(xù)孵育30分鐘，之后進(jìn)行多克隆抗體特異性條帶檢測。

1.2.6抗體純化

根據(jù)張永德等[10]的方法對Nt-Rab11-FIP5多抗進(jìn)行純化，用2×PBS含有0.02% NaN3以及1 m M EDTA的緩沖液收集洗脫產(chǎn)物，濃縮到所需體積，置于-20 ℃環(huán)境下保存，同時對樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　Rab11-FIP5抗原預(yù)測

對Rab11-FIP5基因進(jìn)行了抗原預(yù)測（圖1）顯示，Rab11-FIP5蛋白原子數(shù)為9 261，編碼氨基酸605個，分子量為66 100.90 u，理論pI為7.25，不穩(wěn)定性指數(shù)（II）為53.00，為不穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為71.85，水溶性總平均值（GRAVIY）為-0.660，該蛋白為親水性蛋白；跨膜區(qū)以及信號肽分析結(jié)果顯示，Rab11-FIP5蛋白存在跨膜區(qū)1個為第90-113氨基酸序列，該段序列有較強(qiáng)的疏水性，無信號肽序列；Rab11-FIP5蛋白二級結(jié)構(gòu)顯示主要含有α-螺旋（Hh）、隨機(jī)線圈（Cc）和延伸鏈（Ee），三級結(jié)構(gòu)顯示蛋白序列含超家族為序列17-149aa。本研究選取了150-605aa表達(dá)蛋白進(jìn)行多抗免疫，該段抗原指數(shù)得分適中（圖1），可以引起較好的免疫。

圖1 尼羅羅非魚Rab11-FIP5抗原表位分析

2.2　重組質(zhì)粒Rab11-FIP5的構(gòu)建與鑒定

在重組質(zhì)粒pET-B2m-Rab11-FIP5目的基因片段用SalⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切和鑒定，可以清楚看到1條大小為1368 bp（圖2）的條帶，符合目的條帶預(yù)期，表明目的基因片段已成功導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)Nt-Rab11-FIP5- pET-B2m構(gòu)建成功。

M：DL2000 DNA Marker；1：Rab11-FIP5 擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3　重組蛋白Rab11-FIP5的表達(dá)與純化

將已導(dǎo)入重組質(zhì)粒pET-B2m-Rab11-FIP5的表達(dá)菌E.coli BL21置于100g·mL-1LB/Amp+培養(yǎng)基培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑IPTG）誘導(dǎo)Rab11-FIP5蛋白表達(dá)，從圖3可以看出，上清液和沉淀泳道出現(xiàn)了與Rab11-FIP5蛋白分子量大小一致的蛋白，清晰可見且蛋白條帶粗細(xì)相當(dāng)，表明目的蛋白在上清與沉淀均有表達(dá)且分子量表達(dá)接近，并且在0.5 mmol·L-1誘導(dǎo)劑、30℃下，3 h時有較高水平的表達(dá)量。同時說明pET-B2m-Rab11-FIP5重組表達(dá)載體構(gòu)建成功明，表達(dá)的重組蛋白有兩種形式，分別是包涵體蛋白和可溶性蛋白存在，分子量約為62 KD。SDS-PAGE電泳對經(jīng)收集、破碎、和純化后的誘導(dǎo)菌液進(jìn)行進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果顯示經(jīng)洗脫下來的重組蛋白的純度較好，雜蛋白明顯減少，可作為抗原用于后續(xù)多克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)材料（圖4）。

M：蛋白質(zhì)Marker；1：沉淀中的目的蛋白；2：上清中的目的蛋白

M：蛋白質(zhì)Marker；1：其他蛋白；2：純化后的重組Rab11-FIP5蛋白

2.4　抗血清效價檢測

收集經(jīng)至少4次免疫的兔源Rab11-FIP5抗血清，用間接酶聯(lián)免疫吸附方法檢測抗血清效價達(dá)到了1∶2 048 000（圖5），表明純化后的Rab11-FIP5重組白可以誘導(dǎo)日本大耳白兔產(chǎn)生效價高的多克隆抗體。

圖5 尼羅羅非魚Rab11-FIP5多肽多克隆抗體效價曲線

2.5　抗體特異性檢測結(jié)果

Western blotting結(jié)果顯示，日本大耳白兔免疫前所得抗血清為陰性對照，重組Rab11-FIP5蛋白樣品泳道檢測到蛋白分子量約62 kD蛋白（見圖6），蛋白條帶清晰，無雜帶，說明制備的抗體能夠識別并結(jié)合Rab11-FIP5蛋白，性能良好，可用于檢測尼羅羅非魚的Rab11-FIP5蛋白變化。

2.6　Rab11-FIP5多克隆抗體純化分析

將經(jīng)效價分析和抗體鑒定后的抗血清進(jìn)行純化，采用0.1 M檸檬酸液洗脫，用含有0.02% NaN3以及1 mM EDTA的PBS緩沖液收集。對純化后的抗體進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明純化效果較好，目的蛋白條帶清晰，無明顯雜帶（圖7）。

M：蛋白質(zhì)Marker；1：純化的Rab11-FIP5抗體

3　討論

3.1　Rab11-FIP5的生物功能分析

Rab11-FIPs是一種高度保守的支架蛋白家族，隨著FIP功能的分子細(xì)節(jié)研究結(jié)果的公布，Rab11-FIPs被證實(shí)是細(xì)胞內(nèi)多個內(nèi)小體循環(huán)過程的關(guān)鍵調(diào)控者。此外，隨著研究的深入，F(xiàn)IP這一系列功能不斷擴(kuò)大，Rab11-FIPs被證明在細(xì)胞分裂，細(xì)胞遷移，對胰島素、記憶過程、免疫和免疫的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、水的再吸收、生育、視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)育和各種人類癌癥等生理過程中起作用[1,11-20]。由于這些細(xì)胞過程與疾病相關(guān)，因此在未來FIPs可能被確定為潛在的目標(biāo)用于人類疾病的治療干預(yù)。弓形蟲在入侵哺乳動物細(xì)胞可自制膜結(jié)合室內(nèi)繁殖，即寄生液泡（PV），而Ⅰ類（FIP1C、FIP2、FIP5）和Ⅱ類（FIP3、FIP4）在弓形蟲PV囊泡內(nèi)存在不同含量的FIPs，說明哺乳動物Rab11參與PV蛋白形成[21]。在研究前列腺癌機(jī)制時，證據(jù)顯示Rab11-FIP5表現(xiàn)與胞質(zhì)α6β1整聯(lián)蛋白密切聯(lián)系，α6β1是參與腫瘤轉(zhuǎn)移的重要蛋白，推測α6β1整聯(lián)蛋白通過Rab11-FIP5參與前列腺癌細(xì)胞向富含層黏連蛋白組織的遷移[22]。最新證據(jù)發(fā)現(xiàn)RAB11FIP5過表達(dá)調(diào)節(jié)NK細(xì)胞參與HIV-1廣泛中和抗體的產(chǎn)生[23]。TRIM21可介導(dǎo)的多聚泛素化Rab11-FIP1和Rab11-FIP5協(xié)同促進(jìn)pIgA跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，介導(dǎo)黏膜的免疫反應(yīng)[24]。我國是羅非魚生產(chǎn)大國，其產(chǎn)業(yè)前景非常廣闊，羅非魚近年病害嚴(yán)重，本研究旨在研究Rab11-FIP5對尼羅羅非魚的生物功能關(guān)系，通過制備其多克隆抗體，進(jìn)一步研究其與尼羅羅非魚的某種生物功能是否關(guān)聯(lián)。

3.2　Rab11-FIP5的生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析是一種基于核酸和蛋白質(zhì)序列分析其表達(dá)的結(jié)構(gòu)功能的生物信息，從而進(jìn)一步了解機(jī)體的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)信息的方法。本研究從尼羅羅非魚cDNA文庫中篩選出Rab11-FIP5基因，設(shè)計(jì)合成尼羅羅非魚Rab11-FIP5基因，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。Nt-Rab11-FIP5基因具有典型的Rab結(jié)構(gòu)域，屬于Rab11蛋白家族。同時，該基因在結(jié)構(gòu)上高度保守，可能與不同物種間的某種相似功能有關(guān)。蛋白預(yù)測分析表明Rab11-FIP5蛋白編碼氨基酸有605個，存在跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域1個，為第90～113氨基酸序列段，推測Rab11-FIP5蛋白活動不局限于胞內(nèi)，其可能活躍于胞內(nèi)外參與機(jī)體的生命活動。其他抗原性分析，該基因編碼的蛋白序列無信號肽存在，局部蛋白親水性好，含17～149氨基酸序列段為超家族，綜上研究選取了150～605氨基酸序列段，用于抗原抗體的制備，抗原表位較好。因此選擇了上述基因序列進(jìn)行克隆，開展多克隆抗體制備工作。

3.3　Rab11-FIP5多克隆抗體制備分析

原核表達(dá)系統(tǒng)因其易培養(yǎng)、生長快、操作方便且能產(chǎn)生足量的目標(biāo)蛋白等優(yōu)勢，常作為外源基因融合表達(dá)。本研究通過設(shè)計(jì)并克隆出編碼尼羅羅非魚Rab11-FIP5蛋白基因序列，連接到原核表達(dá)載體pET-B2m上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以獲得Rab11-FIP5重組蛋白。在誘導(dǎo)環(huán)節(jié)中，誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)劑濃度是影響重組目的蛋白表達(dá)的重要因素，提前誘導(dǎo)菌體太少，外源蛋白產(chǎn)量低；誘導(dǎo)太遲，細(xì)菌過老，也不利于基因表達(dá)。為使得表達(dá)的外源蛋白更具備活性，產(chǎn)量高且質(zhì)量好，本次實(shí)驗(yàn)選擇確定最佳實(shí)驗(yàn)條件，即37 ℃、0.5 mmoL/L IPTG、A 600 mm=0.6時進(jìn)行誘導(dǎo)尼羅羅非魚Rab11-FIP5蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中收集并離心誘導(dǎo)后的細(xì)菌進(jìn)行裂解，獲得重組蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示加上清液和沉淀泳道均約有分子量62 KD出現(xiàn)，說明該重組蛋白以可溶性蛋白和包涵體蛋白兩種形式表達(dá)。包涵體出現(xiàn)的原因可能是Rab11-FIP5蛋白表達(dá)過高，或者是原核表達(dá)載體pET-B2m缺少蛋白正確折疊的影響因子，也有缺乏蛋白翻譯修飾的酶類等因素。當(dāng)然，包涵體的形成并不影響抗多克隆抗體的制備，反而更有助于外源蛋白的表達(dá)與純化[22]。親和層析法是融合蛋白純化的方式之一，且其不受尿素干擾，可直接在變性條件下純化蛋白。為除去包涵體中的脂質(zhì)和部分膜蛋白等雜質(zhì)，對其進(jìn)行洗滌和純化，本研究利用Ni-NTA樹脂層析柱純化重組蛋白，獲得了純度高達(dá)85%的重組蛋白。

免疫壞節(jié)，選擇日本大耳白兔作為免疫動物，該研究中用500 μg純化的重組蛋白和弗氏完全佐劑（1∶1）混勻后注射日本大白耳兔腹部皮下進(jìn)行免疫。首次免疫后，動物機(jī)體正進(jìn)行抗原刺激、識別抗原及效應(yīng)B細(xì)胞增殖階段，大約7天可檢測到抗體，在10天左右達(dá)到最大值，如果第二次注入抗原時間過短，極易造成免疫抑制，因此間隔10～20天為好，以保持刺激強(qiáng)度，增強(qiáng)抗體效價。本實(shí)驗(yàn)選擇間隔為兩周，共免疫5～6次，提高大耳白兔的免疫應(yīng)答水平。本研究將獲得的兔抗Rab11-FIP5多克隆抗體，通過Western blot 檢測驗(yàn)證，結(jié)果顯示有清晰的條帶，表明成功制備了兔抗Rab11-FIP5多克隆抗體，同時為進(jìn)一步深入研究Rab11-FIP5在尼羅羅非魚中的表達(dá)及生物功能研究提供了重要工具。

4　結(jié)論

本研究據(jù)EST序列設(shè)計(jì)得到了尼羅羅非魚Rab11-FIP5 cDNA序列，該序列含有Rab家族典型保守的結(jié)構(gòu)域。成功構(gòu)建了尼羅羅非魚Rab11-FIP5原核表達(dá)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌B21并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物純化后免疫日本大耳兔制得了效價高、特異性強(qiáng)的多克隆抗體，為Rab11-FIP5在尼羅羅非魚的異免疫機(jī)制研究提供基礎(chǔ)工具，為今后其生長發(fā)育、病害防治等方面研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]HORGAN C, MCCAFFREY M. The dynamic Rab11-FIPs [J]. Biochemical Society Transactions, 2009, 37(5): 1032.

[2]李琳. Rab11A效應(yīng)因子FIP5在FLCN-Rab11A結(jié)合中的作用[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué)，2019.

[3]ZHANGg H J, GAO Y, QIAN P P, et al. Expression analysis of Rab11 during zebrafish embryonic development.[J]. BMC Developmental Biology, 2019, 19(1): 25.

[4]張宇，韓芳，劉嵐萍，等. 大黃魚Rab11基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 集美大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016，21(3): 167-174.

[5]夏正龍，黃雪娜，黃振遠(yuǎn)，等. 羅氏沼蝦Rab11基因cDNA克隆及其組織表達(dá)分析[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2016，40(3): 443-450.

[6]WANG D, BUYON J P, ZHU W, et al. Defining a novel 75-kDa phosphoprotein associated with SS-A/Ro and identification of distinct human autoantibodies[J]. The Journal of Clinical Investigation, 1999, 104(9): 1265-1275.

[7]WELSH G I, LENEY S E, BETHAN L L, et al. Rip11 is a Rab11- and AS160-Rab GAP-binding protein required for insulin-stimulated glucose uptake in adipocytes[J]. Journal of Cell Science, 2007, 120(120): 4197-4208.

[8]SCHONTEICH E, WILSON G M, BURDEN J, et al. The Rip11/Rab11-FIP5 and kinesin II complex regulates endocytic protein recycling[J]. Journal of Cell Science, 2008, 121(22): 3824-3833.

[9]YOON J, GARO J, LEE M, et al. Rab11fip5 regulates telencephalon development via ephrinB1 recycling.[J]. Development, 2021, 148(3): dev196527.

[10]張永德，林勇，馮鵬霏，等. 尼羅羅非魚Lck多克隆抗體的制備及鑒定[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，49(11): 2304-2310.

[11]MUTO A, AOKI Y, WATANABE S. Mouse Rab11-FIP4 regulates proliferation and differentiation of retinal progenitors in a Rab11-independent manner[J]. Developmental Dynamics, 2010, 236(1): 214-225.

[12]HORGAN C P, OLELSY A, ZHDANOV A V, et al. Rab11-FIP3 Is Critical for the Structural Integrity of the Endosomal Recycling Compartment[J]. Traffic, 2007, 8(4): 414-430.

[13]WELSH G I, LENEY S E, LLOYD-LEWIS B, et al. Rip11 is a Rab11- and AS160-RabGAP-binding protein required for insulin-stimulated glucose uptake in adipocytes[J]. Journal of Cell Science, 2007, 120(23): 4197-4208.

[14]FAN G H, LAPIERRE L A, GOLDENRING J R, et al. Rab11-family interacting protein 2 and myosin Vb are required for CXCR2 recycling and receptor-mediated chemotaxis[J]. Molecular Biology of the Cell, 2004, 15(5): 2456-2469

[15]WANG Z, EDWARDS J G, RILEY N, et al. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity[J]. Cell, 2008, 135(3): 535-548.

[16]LINDSAY A J, MCCAFFRET M W. Purification and functional properties of Rab11-FIP3[J]. Methods in Enzymology, 2005, 403(403): 499-512.

[17]DAMIANI M T, PAVAROTTI M, LEIVA N, et al. Rab coupling protein associates with phagosomes and regulates recycling from the phagosomal compartment[J]. Traffic, 2010, 5(10): 785-797.

[18]BEHRENDS U, SCHNEIDER I, ROSSLER S, et al. Novel tumor antigens identified by autologous antibody screening of childhood medulloblastoma cDNA libraries.[J]. International Journal of Cancer Journal International Du Cancer, 2003, 106(2): 244-251.

[19]GARCIA M J, POLE J C M , CHIN S F, et al. A1 Mb minimal amplicon at 8p11-12 in breast cancer identifies new candidate oncogenes[J]. Oncogene, 2005, 24(33): 5235-5245.

[20]PATILV S. Rab coupling protein (RCP): a novel target of progesterone action in primate endometrium[J]. Journal of Molecular Endocrinology, 2005, 35(2): 357-372.

[21]HARTMAN E J, ASADY B, JULIA D R, et al.. The Rab11-family interacting proteins reveal selective interaction of mammalian recycling endosomes with the Toxoplasma parasitophorous vacuole in a Rab11-and Arf6-dependent manner[J]. Molecular Biology of the Cell, 2022, 33(5): ar34.

[22]DAS L, GARD J M C, PREKERIS R, et al. Novel regulation of integrin trafficking by Rab11-FIP5 in aggressive prostate cancer[J]. Molecular Cancer Research, 2018, 16(8): 1319-1331.

[23]BRADLEY T, PEPPA D, PEDROZA P I, et al. Rab11-FIP5 expression and altered natural killer cell function are associated with induction of HIV broadly neutralizing antibody responses[J]. Cell, 2018, 175(2): 387-399.

[24]Fan X X, ZHOU D H, ZHAO B L, et al. Rab11-FIP1 and Rab11-FIP5 regulate pIgR/pIgA transcytosis through TRIM21-mediated polyubiquitination[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(19): 10466-10466.

Prokaryotic Expression of Rab11-FIP5 in Nile Tilapia and Preparation of Its Polyclonal Antibody

In order to study the gene function of Rab11 effect factor FIP5 (Rab11-FIp5) in nile tilapia, the Rab11-FiP5 gene sequence was designed for prokaryotic expression vector, and the prokaryotic expression vector pET-B2m-Rab11-FIP5 was constructed, and then the fusion protein Rab11-Fip5 was induced. After purification, Rab11-FIP5 polyclonal antibody was prepared by immunizing Japanese rabbits with large eared rabbits. The target protein was analyzed by ELISA and Western Blot. Results: Western Blot analysis showed that there was a clear target band with a single band, and the molecular weight was about 62 KD, consistent with the expected molecular weight. The titer of the antibody detected by ELISA was 1:048000, indicating that the titer met the antibody standard and had good performance. Conclusions: Rab11-FIP5 polyclonal antibody was successfully prepared, which provides a basic tool for the localization and functional study of Nt-Rab11-FIP5.

nile tilapia; prokaryotic expression; purification; polyclonal antibody

S917.4

A

1008-1151(2023)07-0064-05

2023-01-26

國家自然科學(xué)基金（31372553；31760765）。

宋漫玲（1991－），女，廣西產(chǎn)研院生物制造技術(shù)研究所有限公司工程師，碩士，研究方向?yàn)樗鷦游镞z傳育種。