間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞治療策略研究進(jìn)展

段星祥，張瑞，賀燕，彭友儉，葉青松，，4

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)中心，湖北 武漢（430060）；2.武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院再生與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，湖北 武漢（430064）；3.武漢大學(xué)人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，湖北 武漢（430060）；4.哈佛大學(xué)麻省總醫(yī)院，哈佛大學(xué)牙學(xué)院口腔頜面外科，美國(guó) 波士頓（02114）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是干細(xì)胞家族中的重要一員，具有免疫調(diào)節(jié)能力和多項(xiàng)分化能力，在再生醫(yī)學(xué)中有著重要地位。MSCs 的細(xì)胞治療是近年研究熱點(diǎn)，包括傳統(tǒng)意義上的以活細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療策略和新出現(xiàn)的以細(xì)胞外囊泡和其他可溶性蛋白質(zhì)或生物活性分子為基礎(chǔ)的去細(xì)胞治療策略［1］。細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）就是去細(xì)胞治療策略的一個(gè)典型例子，這些微小的囊泡在被發(fā)現(xiàn)是細(xì)胞之間傳遞信號(hào)的信使分子之前很長(zhǎng)一段時(shí)間都被當(dāng)作細(xì)胞排出體外的廢棄物［2］。在去細(xì)胞治療策略研究成為熱點(diǎn)的同時(shí)，傳統(tǒng)細(xì)胞治療策略也在迅速發(fā)展，在創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、缺血性心臟病、肺動(dòng)脈高壓等疾病治療領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了突破［3］。隨著材料科學(xué)的興起，性能各異的合成生物材料被研發(fā)出來(lái)。結(jié)合生物材料，MSCs 可以進(jìn)行原位移植并形成一個(gè)小的整體，進(jìn)而增強(qiáng)其抗炎和修復(fù)受損組織的能力［4］。本文對(duì)基于MSCs 的細(xì)胞治療策略的現(xiàn)狀以及由MSCs 衍生的去細(xì)胞治療策略進(jìn)行綜述。

1 MSCs 細(xì)胞治療策略

MSCs 屬于多能干細(xì)胞，在增殖和分化能力上不具備完全的干性，因此在具備分化潛能的同時(shí)又不存在致瘤的風(fēng)險(xiǎn)。此外MSCs 細(xì)胞治療對(duì)機(jī)體具有免疫調(diào)節(jié)能力，MSCs 能夠分泌多種免疫調(diào)節(jié)因子，包括吲哚胺2，3-雙加氧酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、前列腺素E2、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）等，對(duì)T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞都有調(diào)節(jié)作用［5］。隨著MSCs 研究的深入，不斷有新的MSCs 被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于新的疾病領(lǐng)域，多學(xué)科的交叉結(jié)合提升了MSCs細(xì)胞治療策略的實(shí)用性，但目前臨床中仍然存在著許多的瓶頸。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cells，BMSCs）是最早被發(fā)現(xiàn)的MSCs，也是臨床研究和應(yīng)用最為廣泛的MSCs，但是因?yàn)槠浍@取較為困難，且對(duì)捐獻(xiàn)者有一定損傷，嚴(yán)重影響了它的應(yīng)用。牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）來(lái)源于牙齒，在口腔的治療過(guò)程會(huì)產(chǎn)生許多廢棄的牙齒，有研究顯示每名口腔患者平均拔牙次數(shù)為0.18 次，接受口腔外科治療的患者則高達(dá)1.29 次，因此醫(yī)療廢棄牙是DPSCs 的絕佳來(lái)源，其來(lái)源廣泛，既不存在倫理爭(zhēng)議，又無(wú)侵入性操作［4］。DPSCs 具有比BMSCs 更強(qiáng)的增殖能力，研究顯示DPSCs 在神經(jīng)再生、血管生成、骨質(zhì)形成方面明顯優(yōu)于BMSCs，同時(shí)成脂傾向弱于BMSCs，因此DPSCs 在神經(jīng)、骨疾病方面將比BMSCs 更具優(yōu)勢(shì)［6］。與牙周膜干細(xì)胞、乳牙干細(xì)胞等其他牙源性干細(xì)胞相比，DPSCs 在增殖速率方面不如二者，但在成骨方面更具優(yōu)勢(shì)，乳牙干細(xì)胞體內(nèi)形成完整的牙本質(zhì)/髓樣復(fù)合體時(shí)存在明顯缺陷，而牙周膜干細(xì)胞對(duì)成骨刺激的響應(yīng)性明顯不如DPSCs［7-8］。

1.1 MSCs 細(xì)胞治療的適應(yīng)證

MSCs 在自身免疫性疾病、移植排斥、慢性炎癥疾病方面的研究獲得了更多的關(guān)注。在2016 年BMSCs 的免疫調(diào)節(jié)作用才正式被學(xué)者們所認(rèn)可，但在2016 之前NIH 臨床注冊(cè)的MSCs 相關(guān)臨床試驗(yàn)項(xiàng)目中，接近一半項(xiàng)目的適應(yīng)證都是免疫與炎癥相關(guān)的疾病。第一例MSCs 應(yīng)用于免疫性疾病是2004 年，BMSCs 被移植到IV 級(jí)急性移植物抗宿主?。╣raft-vs-host disease，GVHD）患者體內(nèi)，患者于1 年后痊愈［9］。之后越來(lái)越多的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)證明了MSCs 對(duì)于GVDH 的有效性，其機(jī)制包括抑制效應(yīng)T 細(xì)胞和旁分泌作用調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的水平，如IFN-γ、TNF-α 和白細(xì)胞介素-1β 等，MSCs 還具有促進(jìn)免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗炎因子白細(xì)胞介素-10 的作用［10］。在其他傳統(tǒng)治療難以奏效的免疫疾病方面，MSCs 也取得許多驚人的成果，在最近的一項(xiàng)臨床研究中顯示，靜脈注射MSCs 治療銀屑病是安全且部分有效的，Treg 細(xì)胞水平可能是預(yù)測(cè)移植有效性的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，且女性的有效性明顯高于男性［11］。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療中，CD1c+樹突狀細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的關(guān)鍵點(diǎn)，而MSCs能夠通過(guò)IFN-γ-FLT3L-FLT3 軸上調(diào)CD1c+樹突狀細(xì)胞來(lái)達(dá)到抑制炎癥的作用［12］。

誘導(dǎo)技術(shù)的進(jìn)步也在一定程度上拓寬了MSCs細(xì)胞治療策略的適應(yīng)證，MSCs 可以在體外條件下發(fā)育為三個(gè)胚層的不同細(xì)胞。在向內(nèi)胚層細(xì)胞分化方面，目前報(bào)道有多種有效的方法可將MSCs 誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞［13］。MSCs 誘導(dǎo)得到的肝細(xì)胞樣細(xì)胞不僅能夠合成和分泌白蛋白，還通過(guò)CYP3A4酶代謝藥物，在移植進(jìn)入肝衰竭的小鼠模型之后，它們能夠在損傷的肝臟中定植，成為小鼠肝臟的一部分，并幫助恢復(fù)其肝功能緩解肝衰竭癥狀［14］。在外胚層細(xì)胞分化方面，MSCs 具有很強(qiáng)的神經(jīng)分化潛能。有研究報(bào)道將MSCs 經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后得到的膽堿能樣神經(jīng)元移植入小鼠腦內(nèi)后能夠改善阿爾茨海默病大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力［15］。也有研究報(bào)道通過(guò)靜脈注射MSCs 同樣能夠減少阿爾茨海默病模型小鼠的Tau 蛋白磷酸化和炎癥反應(yīng)，并且早期注射MSCs 對(duì)阿爾茨海默病樣神經(jīng)病理改變有長(zhǎng)期的有益影響［16］。除此之外，MSCs的細(xì)胞治療策略在抑郁癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等疾病中也有應(yīng)用。

1.2 MSCs 與生物材料結(jié)合增強(qiáng)治療的效果

常規(guī)的細(xì)胞治療策略存在定植率低、存活率低、活性差等問(wèn)題，通過(guò)與材料科學(xué)的交叉結(jié)合，不僅能夠解決這些問(wèn)題，甚至能夠特異性提高細(xì)胞的某項(xiàng)能力，增強(qiáng)細(xì)胞治療效果。這些材料往往具有良好力學(xué)和生物學(xué)性能，既滿足細(xì)胞附著要求，又不引起過(guò)敏或免疫反應(yīng)，具有很強(qiáng)的生物活性和生物相容性，以及可控的生物降解。脊髓損傷在外傷患者中較為常見，往往會(huì)給患者帶來(lái)嚴(yán)重的后果，目前仍無(wú)有效治療能夠讓患者完全恢復(fù)，MSCs 與材料的結(jié)合有望解決這一問(wèn)題。DPSCs 聯(lián)合水凝膠及活性氧清除劑，可以協(xié)同調(diào)節(jié)鐵代謝，抑制鐵死亡，促進(jìn)脊髓鐵穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)［17］。同時(shí)聯(lián)合水凝膠移植的DPSCs 能夠很好地定植分化并參與神經(jīng)的重建，成為小鼠神經(jīng)的一部分［18］。齲齒是最常見的口腔疾病之一，是牙齒硬組織破壞和牙髓暴露的主要原因，如何保存深部病變的牙髓活力一直是棘手的問(wèn)題，DPSCs 能夠分化成牙本質(zhì)樣細(xì)胞，產(chǎn)生牙本質(zhì)/牙髓樣復(fù)合體，因此是牙本質(zhì)修復(fù)的理想選擇［19］。但傳統(tǒng)的細(xì)胞治療策略應(yīng)用于牙齒時(shí)，細(xì)胞難以黏附，體內(nèi)體外差異巨大。通過(guò)磁性納米顆粒改性的水凝膠包裹的3D DPSCs 微球能夠很好解決細(xì)胞黏附的問(wèn)題，并且在磁性納米顆粒的機(jī)械刺激下還能夠促進(jìn)DPSCs 的成牙性分化［20］。

1.3 MSCs 細(xì)胞治療臨床應(yīng)用的瓶頸

MSCs 的細(xì)胞治療策略目前尚未在臨床中廣泛應(yīng)用，主要還是人們對(duì)其安全性的擔(dān)憂。MSCs 屬于多能干細(xì)胞，相較于胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），不存在成瘤風(fēng)險(xiǎn)和病毒編程帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，目前臨床實(shí)驗(yàn)已證實(shí)MSCs 的安全性，未發(fā)生異位組織、腫瘤等嚴(yán)重不良事件［21］。但是MSCs 對(duì)于腫瘤的影響似乎是把雙刃劍，這也是人們擔(dān)憂其安全性的原因之一。研究報(bào)道MSCs 可能是腫瘤啟動(dòng)子，因?yàn)檫@些細(xì)胞可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成［22］。另一方面，也有報(bào)道又證實(shí)了MSCs 的抑瘤作用。細(xì)胞的異質(zhì)性也是帶來(lái)安全性的問(wèn)題之一，在經(jīng)過(guò)大規(guī)模擴(kuò)增培養(yǎng)后很可能表現(xiàn)出形態(tài)和功能的異質(zhì)性，甚至可能造成血管栓塞導(dǎo)致嚴(yán)重后果［23］。因此MSCs 制備過(guò)程的安全性、分子機(jī)制、標(biāo)準(zhǔn)化以及運(yùn)輸和臨床應(yīng)用等方面的研究有待進(jìn)一步深入。

2 MSCs 去細(xì)胞治療策略

去細(xì)胞治療策略是通過(guò)細(xì)胞外囊泡和細(xì)胞分泌的其他可溶性蛋白質(zhì)或生物活性分子進(jìn)行治療，是細(xì)胞治療的一種衍生策略［1，24］，不具有致瘤性和栓塞風(fēng)險(xiǎn)，具有更好的安全性。

2.1 去細(xì)胞治療制劑

常見的去細(xì)胞治療制劑包括條件培養(yǎng)基、細(xì)胞外囊泡（EVs）、細(xì)胞裂解液三種。條件培養(yǎng)基是將MSCs 在無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將培養(yǎng)基離心過(guò)濾去除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)后獲得的培養(yǎng)基，是可溶性成分和泡狀成分的復(fù)雜混合物，包含可溶性蛋白質(zhì)（細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子、細(xì)胞粘附分子、信號(hào)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和酶）、核酸（DNA、mRNA 和microRNAs）、脂質(zhì)和EVs［25］。由于條件培養(yǎng)基的收集比較簡(jiǎn)單，因此衍生了2 種產(chǎn)品，即條件培養(yǎng)基濃縮液和EVs 分離液（外泌體）。EVs 包含大量miRNA、mRNA 和蛋白質(zhì)，在細(xì)胞-細(xì)胞通訊、組織穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞分化和器官發(fā)育和重塑中發(fā)揮重要作用。EVs 根據(jù)其大小和來(lái)源主要分為5 個(gè)亞群：納米囊泡（8～12 nm）；外泌體（30～150 nm）；微囊泡（200～1 000 nm）；凋亡小體（1 000～5 000 nm）；癌小體（1～10 μm）［26］。MSCs 裂解液是將MSCs 通過(guò)物理或者化學(xué)方法裂解，經(jīng)離心過(guò)濾去除破碎細(xì)胞器的產(chǎn)物，包含多種細(xì)胞因子。MSCs 裂解液同樣具有炎癥調(diào)節(jié)和促進(jìn)組織再生的作用，有研究報(bào)道MSCs 裂解液在結(jié)腸炎、神經(jīng)源性陰莖勃起障礙、皮膚光老化小鼠模型中均能夠抑制炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)組織再生，改善臨床癥狀［27-28］。

2.2 去細(xì)胞治療的有效性和安全性

MSCs 來(lái)源的外泌體的相關(guān)研究是最多的，本綜述主要闡述MSCs 來(lái)源的外泌體去細(xì)胞治療的有效性和安全性。MSCs 來(lái)源的外泌體已用于多種疾病模型的治療，在MSCs 應(yīng)用最為廣泛的炎癥和免疫疾病方面，局部應(yīng)用MSCs 來(lái)源外泌體可以抑制角質(zhì)層補(bǔ)體的激活，從而減少中性粒細(xì)胞在角質(zhì)層內(nèi)和角質(zhì)層分泌的IL-17，緩解銀屑病癥狀［29］。MSCs 在神經(jīng)血管疾病的治療中也有很好的效果，DPSCs 來(lái)源的外泌體能夠通過(guò)抑制HMGB1/TLR4/MyD88/NF-κB 多條通路，減輕腦梗小鼠模型的腦水腫、腦梗死和神經(jīng)功能障礙等癥狀［30］。外泌體聯(lián)合生物材料也有諸多應(yīng)用，MSCs來(lái)源的外泌體結(jié)合導(dǎo)電水凝膠顯著減少脊髓神經(jīng)損傷小鼠模型中CD68+小膠質(zhì)細(xì)胞，增強(qiáng)局部神經(jīng)干細(xì)胞聚集，誘導(dǎo)神經(jīng)元和軸突再生，明顯促進(jìn)脊髓神經(jīng)損傷小鼠模型的功能恢復(fù)［31］。此外MSCs來(lái)源的外泌體還應(yīng)用于癌癥治療，研究表明MSCs的外泌體具有固有的歸巢特性，再現(xiàn)了它們?cè)隗w內(nèi)的生物學(xué)作用，使它們?cè)谟糜诎┌Y治療時(shí)有效地移動(dòng)到腫瘤細(xì)胞中［32］。以上研究證明MSCs 來(lái)源的外泌體表現(xiàn)出來(lái)的效果良好。外泌體主要由miRNA、mRNA 和蛋白質(zhì)構(gòu)成，危險(xiǎn)因素相對(duì)更少，從各方面都相較細(xì)胞治療策略更為安全。正是因?yàn)槿ゼ?xì)胞治療策略所展現(xiàn)出來(lái)良好的有效性和安全性，許多臨床前成果已經(jīng)迅速步入臨床實(shí)驗(yàn)階段，相信未來(lái)去細(xì)胞治療策略的發(fā)展將會(huì)帶來(lái)更多的驚喜。

2.3 外泌體臨床應(yīng)用的瓶頸和突破

外泌體臨床應(yīng)用的所面臨的主要問(wèn)題是產(chǎn)能不足。差速超離法是用于外泌體分離的第一種方法，至今仍是外泌體分離的金標(biāo)準(zhǔn)，但是長(zhǎng)時(shí)間的高速離心會(huì)造成外泌體的機(jī)械損傷，差速超離耗時(shí)長(zhǎng)，提取率不高，使其難以在短時(shí)間內(nèi)處理多個(gè)生物樣品［33］。聚合物沉淀法操作簡(jiǎn)單，所需時(shí)間短，適用于處理大量樣品，但純度不高且回收率較低，可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，產(chǎn)生的聚合物難以去除［34］。超濾和排阻色譜法是根據(jù)外泌體與其他組分的尺寸差異進(jìn)行分離，免疫親和法是通過(guò)標(biāo)記外泌體的特異性蛋白來(lái)分離，以上兩種方法都存在提取效率較低的問(wèn)題［35］?；谝陨显硪渤霈F(xiàn)多個(gè)商業(yè)化的試劑盒，極大地簡(jiǎn)化了提取流程，但不同廠商的試劑盒提取效果差異較大［36］。新出現(xiàn)的微流控分離技術(shù)，能夠進(jìn)一步提高回收率、減少樣品體積、縮短處理時(shí)間，具有良好的應(yīng)用前景，Chen 等［37］開發(fā)的EXODUS 系統(tǒng)通過(guò)在兩個(gè)耦合振蕩器在膜上產(chǎn)生雙頻橫波分離外泌體，使EXODUS系統(tǒng)在速度、純度和收率方面優(yōu)于其他分離技術(shù)。除了通過(guò)分離提取的改進(jìn)增加產(chǎn)能外，干細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)也能夠提高外泌體的產(chǎn)能。傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)所得到的細(xì)胞量十分有限，而新出現(xiàn)的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)很好地解決了這一問(wèn)題。應(yīng)用較為普遍的多層培養(yǎng)托盤系統(tǒng)也被稱為“細(xì)胞堆”或“細(xì)胞工廠”，多個(gè)培養(yǎng)托盤相互堆疊，給細(xì)胞更多附著面積，可以提供高達(dá)25 440 cm2的培養(yǎng)表面積，遠(yuǎn)大于T-225 培養(yǎng)瓶。除此之外還有滾瓶和微載體的培養(yǎng)方式，也能通過(guò)增大附著面積的方式擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模［38］。最新的研究報(bào)道自動(dòng)化技術(shù)與微載體技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)全封閉自動(dòng)化的MSCs 大規(guī)模培養(yǎng)，能夠最大程度減少污染可能，且節(jié)約人力成本，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)臨床級(jí)MSCs，細(xì)胞質(zhì)量與傳統(tǒng)二維平面培養(yǎng)的細(xì)胞質(zhì)量無(wú)顯著差異［39］。另外，外泌體成分復(fù)雜，具體作用機(jī)制還需要更多的臨床前研究加以證實(shí)，仍需開展全方位、多領(lǐng)域的研究。

3 小 結(jié)

細(xì)胞治療策略能替換病變的細(xì)胞從根本解決某些疾病，尤其在神經(jīng)、心肌等再生能力弱的組織中所起作用更為關(guān)鍵。隨著誘導(dǎo)技術(shù)、組織工程技術(shù)、類器官技術(shù)的發(fā)展等，一些限制已經(jīng)實(shí)現(xiàn)突破，MSCs 誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞已經(jīng)具備成熟的功能和特異性的結(jié)構(gòu)，結(jié)合生物材料或類器官技術(shù)的原位移植在定植率及功能性方面都有極大的提升，但其中的許多有效機(jī)制仍不明確，移植規(guī)模仍然較小，離人工器官的目標(biāo)仍相去甚遠(yuǎn)。雖然目前研究顯示MSCs 在移植后能夠定植于體內(nèi)，但似乎旁分泌所起到的作用更大，人們對(duì)細(xì)胞治療策略安全性的擔(dān)憂也是促進(jìn)去細(xì)胞治療策略發(fā)展的原因之一。MSCs 的旁分泌作用對(duì)于類器官的形成是有利的［40］，這其中的機(jī)制值得進(jìn)一步探索。去細(xì)胞治療策略和細(xì)胞治療策略是一個(gè)相輔相成、有機(jī)結(jié)合的整體，相信這會(huì)加速人工器官的早日實(shí)現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)真正意義上的再生。

【Author contributions】Ye QS, Duan XX, Zhang R, He Y, Peng YJ collected the references and wrote the article.Ye QS conceptualized and wrote the article, reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.