汞脅迫對蔬菜土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)及豐度的影響

王喜英　趙輝　盧志宏　譚智勇　宋希娟

摘要：汞（Hg）是一種廣泛存在于土壤環(huán)境中的全球污染物之一，土壤微生物對汞脅迫的敏感性強(qiáng)于動植物，可從微生物角度為蔬菜土壤汞污染生態(tài)風(fēng)險評估提供科學(xué)依據(jù)。采用盆栽試驗，應(yīng)用熒光定量PCR和高通量測序（Illumina HiSeq）技術(shù)，分析對照（CK）、低濃度汞（T1）、中濃度汞（T2）和高濃度汞（T3）脅迫處理下蔬菜土壤hgcA基因數(shù)量、細(xì)菌數(shù)量、真菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)變化特征。結(jié)果表明，T1處理增加細(xì)菌和hgcA基因數(shù)量，分別比CK、T2和T3提高了37.48%和 12.01%、57.31%和 19.37%、88.85%和14.82%。汞脅迫降低了真菌數(shù)量，其中T2處理降低最顯著。T3處理降低了土壤細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)（豐富度和多樣性），T1處理降低了土壤真菌群落α多樣性指數(shù)（豐富度和多樣性）。土壤細(xì)菌門水平上，共獲得18個類群，其中放線菌門、變形菌門和綠彎菌門為優(yōu)勢類群，且在不同處理間差異極顯著。T2和T3處理分別顯著增加了變形菌門和放線菌門相對豐度。綠彎菌門相對豐度均表現(xiàn)隨汞濃度增加逐漸遞減的趨勢。土壤真菌門水平上，共獲得9個類群，其中子囊菌門、被孢菌門和擔(dān)子菌門為優(yōu)勢類群，其相對豐度共占真菌群落的94.64%。隨著汞濃度增加，子囊菌門相對豐度遞增，被孢菌門相對豐度遞減。擔(dān)子菌門在 T1 處理中最高（5.40%）。土壤pH值、銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量和全汞含量與土壤細(xì)菌數(shù)量、細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著關(guān)系。綜上，汞脅迫對蔬菜土壤hgcA基因、細(xì)菌和真菌數(shù)量有顯著影響，高汞脅迫造成了土壤細(xì)菌多樣性減少，細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生變化，而細(xì)菌群落對汞脅迫的敏感性強(qiáng)于真菌。

關(guān)鍵詞：汞；蔬菜土壤；hgcA基因；細(xì)菌；真菌；高通量測序

中圖分類號：S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）14-0229-11

汞是一種危險和持久性的環(huán)境污染物，可在大氣中轉(zhuǎn)化和長距離運輸，最終在食物鏈中積累，危害人類身體健康。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，施用的化肥、石灰、污泥、肥料、除草劑和殺菌劑等，已經(jīng)成為土壤汞的重要來源之一［1］。汞在土壤中的毒性高度依賴于其化學(xué)種類，甲基汞化合物被認(rèn)為是毒性最大的物種［2］。土壤汞的甲基化主要通過環(huán)境中微生物轉(zhuǎn)化而成，hgcA作為汞甲基化生物標(biāo)志物，常用來評估土壤中潛在汞甲基化微生物［3］。土壤微生物可以快速響應(yīng)土壤環(huán)境脅迫變化，對土壤污染程度具有重要的指示作用［4-5］。研究表明，微生物對重金屬脅迫比植物更敏感［4］。關(guān)于汞對土壤微生物影響的研究很少，且更多集中在細(xì)菌群落［6-9］。在重金屬污染物脅迫下，微生物數(shù)量減少甚至死亡，或變成抗性優(yōu)勢群［10］。在重金屬污染土壤中，強(qiáng)耐受性微生物相對豐度增加，敏感微生物逐漸減少，土壤生態(tài)系統(tǒng)逐漸退化，并出現(xiàn)新物種［11］。Harris-Hellal等研究表明，在低汞濃度（0.1 mg/kg）條件下，土壤微生物群落變化不明顯，在高汞濃度（20 mg/kg）下土壤微生物群落功能多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化［12］。Xie等研究發(fā)現(xiàn)，隨著汞濃度的增加，土壤中革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌比例逐漸增加［13］。Frossard等通過研究不同汞濃度（0.32、3.2、32 μg/g）對森林土壤細(xì)菌和真菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)最高汞濃度造成微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化［14］。Wang等研究表明，在高濃度汞處理下，隨培養(yǎng)時間增加，微生物群落豐富度逐漸下降，而低濃度汞和中低濃度汞對土壤微生物群落均勻性影響不大［11］。Liu等評估汞污染對水稻土壤細(xì)菌多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)在中等汞濃度下細(xì)菌多樣性最高，表明中等干擾下生物多樣性達(dá)到峰值［15］。Rajapaksha等研究認(rèn)為真菌通常比細(xì)菌對重金屬更耐受［16］。然而，關(guān)于汞對土壤真菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的影響及其驅(qū)動因素，尚缺乏深入的研究。

蔬菜已經(jīng)成為人們飲食必不可少的食物之一。汞成為菜地污染最嚴(yán)重的重金屬之一［17］。白菜在我國種植面積廣泛，對金屬富集作用強(qiáng)于其他非葉蔬菜，對生態(tài)系統(tǒng)和人類構(gòu)成了更大威脅［18］。目前，汞對土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響更多集中在水稻和森林等植物［15，19］，同時，關(guān)于hgcA基因豐度的研究更多的是在厭氧環(huán)境［20-22］，但在蔬菜土壤等非厭氧環(huán)境中研究較少。因此，本研究采用盆栽試驗，應(yīng)用熒光定量PCR和Miseq高通量測序，研究汞脅迫下蔬菜（白菜）土壤hgcA基因數(shù)量、細(xì)菌和真菌數(shù)量、群落組成及其環(huán)境驅(qū)動因素，揭示土壤微生物對汞脅迫的響應(yīng)機(jī)制，從微生物角度為蔬菜汞脅迫的生態(tài)評估及生物預(yù)警提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

土壤樣品采集于貴州省銅仁市碧江區(qū)（109°13′12″E，27°47′30″N）典型菜地黃壤土。從表層0～20 cm收集新鮮土壤去除植物殘體礫石等，風(fēng)干后過2 mm篩用作盆栽試驗。土壤基本理化性質(zhì)：pH值為6.56，有機(jī)碳含量為17.05 g/kg，全氮含量為1.63 g/kg，速效鉀含量為46.59 mg/kg，速效磷含量為16.92 mg/kg和全汞含量為0.331 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

以HgCl2為汞源，設(shè)置4個汞濃度組（0、1、10、50 mg/kg），分別代表對照（CK）、低汞（T1）、中汞（T3）和高汞（T3）濃度污染土壤。每個處理重復(fù)3次，共計12個處理，將土壤樣品混合均勻后，裝入高21 cm、上口直徑21 cm 塑料盆中，盆栽用土 5 kg。為保持添加的汞趨于均勻穩(wěn)定且被土壤充分吸附，土壤老化時間為90 d，同時保持土壤含水量在60%。老化結(jié)束后，栽種試驗于2021年4月在銅仁學(xué)院溫棚進(jìn)行，供試小白菜品種購自天津市宏豐蔬菜研究有限公司。每盆栽種10粒，白菜出苗后，每盆留苗4株。白菜生長期間管理水平一致，為避免水中汞進(jìn)入，均采用蒸餾水澆灌，同時保持土壤田間持水量為60%。在白菜生長60 d時，進(jìn)行植株和土壤樣品采集。白菜測量鮮質(zhì)量、株高和根長等指標(biāo)（表1）。土樣采集后，去除植物根系并過2 mm篩后，分為2份，1份用于土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量測定，其余風(fēng)干土壤用于全汞含量和理化指標(biāo)分析；1份-20? ℃冰箱保存用于土壤微生物分析。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 土壤全汞含量和理化指標(biāo)測定

土壤全汞（THg）含量采用王水水浴消化，原子熒光光度計測定［23］。參照鮑士旦的《土壤農(nóng)化分析》對土壤理化指標(biāo)進(jìn)行測定［24］：采用電位法測定pH值；采用重鉻酸鉀氧化法測定有機(jī)碳（SOC）含量；采用凱氏定氮法測定全氮（TN）含量；采用靛酚藍(lán)比色法測定銨態(tài)氮（NH+4-N）含量；采用酚二磺酸比色法測定硝態(tài)氮（NO-3-N）含量；采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定速效磷（AP）含量；采用乙酸銨提取-火焰光度法測定速效鉀（AK）含量。

1.3.2 土壤DNA提取

采用DNA提取試劑盒（Omega，GA，USA），按照試劑盒步驟進(jìn)行提取。用核酸定量儀（NanoDrop ND-2000）對DNA濃度和純度進(jìn)行檢測。

1.3.3 土壤細(xì)菌、真菌、hgcA基因熒光定量PCR

利用實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)對細(xì)菌（16S rRNA）、真菌（ITS）、hgcA基因豐度進(jìn)行分析，細(xì)菌16S rRNA基因的 V3-V4區(qū)擴(kuò)增引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAC-3′）與519R（5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）［19］。真菌ITS擴(kuò)增引物為ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）［25］；hgcAF（5′-GCCAACTACAAGMTGASCTWC-3′）與hgcAR（5′-CCSGCNGCRCACCAGACRTT-3′）［26］。每個PCR擴(kuò)增樣品重復(fù)3次，通過Minipre Kit獲得樣品質(zhì)粒，根據(jù)樣品質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計算基因拷貝數(shù)。

1.3.4 高通量測序

采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。利用Illumina MiSeq平臺對細(xì)菌16S rRNA、真菌ITS進(jìn)行測序（上海派森諾生物科技有限公司）。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制后，在97%相似度水平下進(jìn)行OTU劃分和歸并。應(yīng)用RDP-classifier分別在16S rRNA和真菌ITS數(shù)據(jù)庫中對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類注釋。使用Mothur軟件分別對細(xì)菌和真菌群落的α多樣性指數(shù)進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對土壤全汞含量和理化性質(zhì)、hgcA基因數(shù)量、細(xì)菌和真菌數(shù)量、群落α多樣性指數(shù)、群落組成相對豐度進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗（P<0.05）；使用SPSS 21.0和R軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。使用R軟件進(jìn)行土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)聚類分析、主坐標(biāo)分析和冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤全汞含量和理化性質(zhì)

隨汞濃度增加，土壤全氮和銨態(tài)氮含量總體呈現(xiàn)遞增趨勢，其中CK處理的全氮含量分別與T1、T2和T3差異顯著；CK處理的銨態(tài)氮含量分別與T2和T3差異顯著。汞濃度增加，導(dǎo)致土壤pH值趨于中性且T3處理顯著高于其他處理。土壤有機(jī)碳含量在T1和T2處理均小于CK，但T3處理顯著增加。硝態(tài)氮含量隨汞濃度增加呈遞減趨勢，且CK分別與T2和T3之間差異顯著。土壤速效磷、速效鉀含量和C/N 比均是CK處理最高。土壤全汞含量大小順序為T3>T2>T1>CK，且T2和T3分別與T1和CK之間差異顯著（表2）。

2.2 土壤細(xì)菌、真菌和hgcA基因豐度

由圖1可知，細(xì)菌16S rRNA基因豐度在不同處理中差異顯著。不同汞濃度下細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)為1.35×109～2.54×109/g干土，且相互之間差異顯著。T1處理顯著增加了細(xì)菌數(shù)量，比CK提高了37.48%。T2和T3處理顯著低于CK，分別比CK降低了12.61%和19.79%。真菌ITS基因拷貝數(shù)為0.83×108～1.99×108/g干土。汞添加降低了真菌數(shù)量，CK處理中真菌ITS基因拷貝數(shù)高于其他處理，與T1處理差異不顯著，分別是T2和T3處理的2.39倍和1.48倍。各處理土壤中均檢測出hgcA基因，范圍為6.9×105～8.24×105/g干土。hgcA基因拷貝數(shù)隨汞濃度增加而有所不同，在T1處理最高，與CK差異不顯著，與T2和T3差異顯著。

為明確汞污染下蔬菜土壤細(xì)菌16S rRNA、真菌ITS和hgcA基因拷貝數(shù)差異的影響因素，分別與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析（圖2）。細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)分別與土壤pH值、銨態(tài)氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；與有機(jī)碳、速效磷和總汞含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；與硝態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。真菌ITS基因拷貝數(shù)與全氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；與碳氮比呈顯著正相關(guān)。hgcA基因拷貝數(shù)與土壤pH值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.3 土壤細(xì)菌和真菌測序結(jié)果及其α多樣性指數(shù)

由表3可知，土壤細(xì)菌和真菌覆蓋度均在0.98以上，測序結(jié)果可以真實反映各處理土壤微生物群落特征。土壤細(xì)菌和真菌中CK、T1、T2和T3獲得質(zhì)控后序列數(shù)分別為88 856（116 967）、83 655（110 772）、84 090（112 434）和88 335（113 698）。土壤細(xì)菌OTUs隨汞濃度增加逐漸減少。CK處理土壤細(xì)菌和真菌OTUs均最多，分別為3 781、622個；土壤細(xì)菌CK處理與T3之間差異顯著；土壤真菌CK處理分別與T1、T2和T3之間差異顯著。說明汞濃度增加改變了蔬菜土壤細(xì)菌和真菌OTUs水平上的物種組成，且土壤真菌變化更加明顯。

土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)均大于真菌。隨汞濃度增加，土壤細(xì)菌Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均表現(xiàn)出先增加后降低趨勢，表明低汞濃度有利于土壤細(xì)菌群落豐富度增加。 T3處理Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均顯著低于其他處理，說明土壤細(xì)菌豐富度受到高濃度汞污染的影響嚴(yán)重。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)變化趨勢相同，隨汞濃度增加逐漸降低；其中，CK、T1和T2處理之間變化不明顯，T3處理顯著低于其他處理。土壤真菌α多樣性指數(shù)均是T2處理最高，其中Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)是T1處理最小，且T2與CK和T3之間差異不明顯，T2與T1差異顯著。Simpson指數(shù)隨汞濃度增加表現(xiàn)先增加后降低趨勢，且T2與CK差異顯著。可知，低汞脅迫對土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐富度有促進(jìn)作用，對土壤真菌群落的多樣性和豐富度有抑制作用。

相關(guān)性分析結(jié)果（圖2）表明，土壤細(xì)菌Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別與土壤pH值、銨態(tài)氮和總汞含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與硝態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與速效鉀含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)與有機(jī)碳含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。Chao1指數(shù)與速效磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別與有機(jī)碳含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。土壤真菌Chao1指數(shù)與速效磷含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。Simpson指數(shù)與碳氮比呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.4 土壤細(xì)菌和真菌群落組成

通過對汞脅迫下蔬菜土壤樣品OTUs進(jìn)行歸類，土壤細(xì)菌得到18個門、50個綱、114個目、172個科和262個屬。土壤真菌得到9個門、20個綱、47個目、91個科和139個屬。在細(xì)菌門水平上，將平均相對豐度<1%類群歸類為其他，得到6個類群（圖3-a），分別為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和厚壁菌門（Firmicutes），其中放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門在不同處理之間有極顯著差異（P<0.01）。放線菌門（59.56%～68.99%）、變形菌門（16.67%～19.43%）和綠彎菌門（3.95%～7.22%）為優(yōu)勢菌門，占細(xì)菌總類群相對豐度的84.96%～89.62%。放線菌門相對豐度在T3處理中最高，分別是CK、T1和T2的1.13倍、1.16倍和1.15倍。變形菌門相對豐度隨汞濃度增加表現(xiàn)先增加后減少，在T2處理最高（19.43%），T3處理最低（16.67%）。綠彎菌門和酸桿菌門相對豐度均表現(xiàn)出隨汞濃度增加逐漸遞減，在T3處理最低（3.95%和3.01%），分別比CK降低了45.21%和50.2%。芽單胞菌門在T1處理最高（4.43%），T3處理最低（2.92%）。厚壁菌門相對豐度在不同處理中差異不顯著，CK最低（1.91%），T2處理最高（2.51%）。在屬水平上，得到相對豐度在1%以上的10個類群（圖3-c），分別為鏈絲菌屬（Streptomyces）、小單孢菌屬（Micromonospora）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、Subgroup_6、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、67-14、KD4-96、Gaiella、濱田氏菌屬（Hamadaea）和Marmoricola。其中，鏈絲菌屬、小單孢菌屬和類諾卡氏菌屬為優(yōu)勢菌屬，相對豐度分別為2.42%～27.42%、5.72%～8.17%和4%～6.6%。隨汞濃度增加，鏈絲菌屬相對豐度顯著增加，T1、T2和T3分別是CK的1.31倍、3.85倍和11.44倍。小單孢菌屬相對豐度在T3處理顯著高于其他處理，比CK增加了20.86%。汞添加降低了類諾卡氏菌屬相對豐度，其中T3處理降低幅度最大，且與其他處理之間差異極顯著。

在門水平上，真菌群落相對豐度達(dá)到1%以上的類群有3個，分別為子囊菌門（Ascomycota，平均相對豐度80.94%）、被孢菌門（Mortierellomycota，平均相對豐度10.33%）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota，平均相對豐度3.37%）（圖3-b）。隨汞濃度增加，子囊菌門相對豐度遞增，被孢菌門相對豐度遞減。子囊菌門和被孢菌門在不同汞濃度處理中差異極顯著，子囊菌門相對豐度在T3處理最高（91.92%），分別比CK、T1和T2增加了28.7%、17.22%和12.09%。被孢菌門相對豐度在T1、T2和T3處理中，分別比CK減少了30.37%、42.04%和98.51%。擔(dān)子菌門相對豐度隨汞濃度增加表現(xiàn)為先增加后減少趨勢，大小順序為T1>CK>T2>T3。屬水平上，相對豐度大于1%的類群為鐮刀菌屬（Fusarium）、被孢霉屬（Mortierella）、扁孔腔菌屬（Lophiostoma）、螺旋聚孢霉屬（Clonostachys）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）和圓孢霉屬（Staphylotrichum），且不同處理間差異顯著（圖3-d）。其中，鐮刀菌屬和被孢霉屬為優(yōu)勢類群，相對豐度分別為12.78%～33.26%和0.27%～18.94%。鐮刀菌屬相對豐度隨汞濃度增加顯著遞增，T1、T2和T3分別比CK增加了30.75%、46.32%和162.25%。被孢霉屬相對豐度在汞添加處理中均小于CK（18.94%），T3處理最低（0.27%）。汞添加顯著增加了扁孔腔菌屬和螺旋聚孢霉屬相對豐度，其中扁孔腔菌屬相對豐度在T2處理最高（6.33%），螺旋聚孢霉屬在T3處理最高（7.31%）。汞添加降低了小不整球殼屬和圓孢霉屬相對豐度，汞濃度越高抑制作用越強(qiáng)。

2.5 土壤細(xì)菌和真菌群落的層次聚類和PCoA分析

汞脅迫下土壤細(xì)菌和真菌的層次聚類樹如圖4所示。不同處理土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。土壤細(xì)菌和真菌除T1外，其他處理3個重復(fù)聚類在一起。其中，CK和T1處理之間距離較近。T3與CK和T1處理之間距離較遠(yuǎn)。PCoA分析進(jìn)一步證實了汞脅迫處理土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。PCoA1和PCoA2對細(xì)菌和真菌群落分別解釋了總變異的43.5%（24.8%）和14.3%（23.5%）（圖5）。CK、T1和T2距離較近，說明土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高。T3和其他處理在不同象限內(nèi)，T3與CK、T1和T2相距較遠(yuǎn)，說明高濃度汞脅迫對土壤細(xì)菌和真菌群落影響最大。

2.6 土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系

本研究在土壤細(xì)菌和真菌屬水平上與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行了冗余分析（圖6）。RDA1和RDA2分別解釋了土壤細(xì)菌群落變異的93.52%和3.09%，前兩軸解釋了總變異的96.61%。RDA1和RDA2分別解釋了土壤真菌群落變異的82.13%和7.55%，前兩軸解釋了總變異的89.68%。由表4可知，土壤pH值、銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量和全汞含量對細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)有極顯著影響，有機(jī)碳含量對細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，全氮含量對真菌群落結(jié)構(gòu)有極顯著影響， 速效鉀含量對真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。

3 討論與結(jié)論

3.1 汞脅迫對蔬菜土壤細(xì)菌、真菌和hgcA基因豐度的影響

重金屬污染由于降解性低，給土壤帶來了嚴(yán)重的環(huán)境惡化問題，通過功能干擾、蛋白質(zhì)變性或細(xì)胞膜破壞影響微生物生長和代謝，抑制微生物活性，導(dǎo)致土壤微生物總量下降［8］。

本研究土壤細(xì)菌數(shù)量（CK除外）隨汞濃度增加表現(xiàn)遞減趨勢，與Zheng等研究結(jié)果［19］一致。T1處理土壤細(xì)菌數(shù)量顯著高于其他處理，可能由于低濃度汞處理蔬菜土壤pH值較低，降低了汞的生物利用度和甲基化，對土壤鉀和磷的釋放有促進(jìn)作用，有利于植物生長［27-28］。植物長勢好，根系分泌物多，可以促進(jìn)細(xì)菌數(shù)量增加［29］。Frossard等研究也認(rèn)為，小于3.2 mg/kg的汞濃度對土壤細(xì)菌數(shù)量沒有顯著抑制作用［14］。本研究T1處理的汞濃度較低，對植物生長和土壤細(xì)菌還未起到抑制作用，說明該汞濃度未超過閾值。相關(guān)性分析表明，土壤細(xì)菌數(shù)量與總汞含量呈負(fù)相關(guān)，Hg污染抑制微生物生長，與Liu等研究結(jié)果［30］一致。然而，Liu等研究認(rèn)為，長期來看，水稻土壤細(xì)菌數(shù)量與總汞含量沒有顯著相關(guān)性［15］，這可能與本研究開展的是短期汞脅迫試驗有關(guān)。本研究中，隨汞濃度增加土壤真菌數(shù)量下降，這與許多重金污染下所得結(jié)果［14，31］一致。汞污染下細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)高于真菌，有可能細(xì)菌與真菌競爭營養(yǎng)，從而對真菌群落產(chǎn)生更大生存壓力［31］。T3處理真菌數(shù)量高于T2，說明真菌對高濃度汞污染具有更大抵抗力。Zheng等研究也認(rèn)為，許多真菌可以忍受高濃度汞污染，通過排出有機(jī)酸與土壤中金屬形成復(fù)合物，從而降低重金屬毒性［19］。

本研究hgcA基因基因拷貝數(shù)為 6.9×105～8.24×105/g干土，遠(yuǎn)低于周心勸等關(guān)于水稻田的研究結(jié)果［20］，可能與hgcA基因主要是在厭氧條件下形成有關(guān)?？偣颗chgcA豐度沒有顯著相關(guān)，與Liu等研究結(jié)果［32］一致，但與Vishnivetskaya等研究結(jié)果［33］不一致，這可能與取樣環(huán)境、植物類型和土壤類型等因素有關(guān)。T1處理hgcA基因數(shù)量高于其他處理，可能與土壤pH值有關(guān)，由于pH值直接影響汞在土壤中的溶解度。Liu等研究認(rèn)為，在堿性環(huán)境中可能不適合含汞甲基化hgcA基因的微生物存活，當(dāng)土壤處于酸性條件下時，汞的甲基化程度增強(qiáng)，導(dǎo)致汞的生物利用度增加，然而，當(dāng)pH值過低時，大量腐殖酸會影響汞的生物利用度或甲基供體轉(zhuǎn)移，降低汞的甲基化［3］。

3.2 汞脅迫對蔬菜土壤細(xì)菌和真菌多樣性的影響

微生物多樣性是評估土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的重要指標(biāo)［27］。本研究土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)（CK除外）均隨汞含量增加而減少，與Vishnivetskaya等研究結(jié)果［33］一致。Crognale等研究認(rèn)為，短期重金屬污染對土壤微生物數(shù)量、豐富度和多樣性產(chǎn)生負(fù)面影響［34］。土壤細(xì)菌Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)在低汞濃度中最高，然后隨汞濃度增加逐漸下降，表明土壤微生物群落豐富度逐漸下降，豐富度受到高汞濃度影響嚴(yán)重。這種趨勢很可能是由于低濃度汞的存在刺激抗金屬物種生長，汞濃度增加導(dǎo)致許多敏感物種死亡，最終導(dǎo)致微生物遺傳多樣性下降［35］。土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在對照、低汞濃度和中汞濃度下變化不顯著，但高汞濃度下明顯改變了Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，與Liu等研究結(jié)果［15］相似。這種原因可能是隨汞濃度增加，不能適應(yīng)高汞濃度的微生物數(shù)量逐漸減少甚至死亡。

Rieder等研究表明，真菌比細(xì)菌對長期重金屬污染更有抵抗力，真菌對汞的反應(yīng)不如細(xì)菌強(qiáng)烈［36］。本研究中，隨汞濃度增加，真菌Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表現(xiàn)先增后減少趨勢，與Frossard等研究結(jié)果［37］一致。該結(jié)果也支持了中度干擾假說，表明中等汞濃度可提高真菌多樣性［38］。前人研究認(rèn)為，汞污染通過影響土壤理化性質(zhì)間接影響真菌多樣性，土壤理化性質(zhì)是土壤微生物多樣性的重要驅(qū)動因素，汞在調(diào)節(jié)土壤真菌豐度和多樣性方面具有重要性［39］。Durand等研究表明，在受汞污染脅迫的礦區(qū)，土壤真菌多樣性與汞濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［40］。然而，本研究中沒有發(fā)現(xiàn)汞對真菌多樣性有顯著影響，與Frossard等研究結(jié)果［37］一致。目前，關(guān)于這一現(xiàn)象的原因尚未明確，可能是由于土壤真菌群落對汞的預(yù)適應(yīng)性，真菌耐汞類群的改變或者低汞生物利用導(dǎo)致缺乏汞毒性［41］。

3.3 汞脅迫對蔬菜土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

Wang等研究認(rèn)為，重金屬汞進(jìn)入土壤將對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響［11］。本研究結(jié)果也表明，汞導(dǎo)致土壤細(xì)菌和真菌群落組成發(fā)生變化，存在劑量相關(guān)效應(yīng)，這與之前研究結(jié)果［19，42］一致。土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可能因重金屬汞添加引起土壤金屬敏感生物數(shù)量減少，耐抗微生物數(shù)量增加，導(dǎo)致微生物群落組成發(fā)生變化［43］。

本研究中，細(xì)菌群落中放線菌門、變形菌門和綠彎菌門為優(yōu)勢菌門，與前人研究結(jié)果［19，44］一致。放線菌門在動植物殘體分解過程中起著重要作用，有利于土壤氮轉(zhuǎn)化，可產(chǎn)生抗生素減少病原微生物侵害［45］。放線菌門相對豐度在高汞濃度下顯著增加，說明放線菌門對汞污染具有耐受性。相關(guān)研究已經(jīng)證明放線菌門對重金屬污染具有耐受性［46］，可能與阻力機(jī)制及沉淀-溶解平衡有關(guān)，限制了土壤游離金屬離子的動態(tài)變化［47］。Barkay等研究認(rèn)為，放線菌門對汞具有耐受性，主要與其含有耐汞基因（merA）有關(guān)［48］。變形菌門具有固氮、代謝和利用光合作用存儲能量的作用［49］。本研究中，變形菌門相對豐度在中等汞濃度最高，高汞濃度最低，可能與中度干擾或應(yīng)激假說有關(guān)［15］。由此可知，變形菌門對汞具有一定耐受性，當(dāng)汞濃度超過一定閾值，將導(dǎo)致其數(shù)量減少或者死亡。變形菌門的耐受能力可能有3個方面原因，一是汞可以被吸附在微生物活細(xì)胞或死細(xì)胞中，從而降低有效汞對其影響［43］；二是變形菌門含有merA基因，merA編碼汞還原酶，可將汞離子還原為元素汞［50］；三是通過外排系統(tǒng)擠出重金屬離子、通過含硫醇分子進(jìn)行分離以及還原為具有降低毒性的氧化狀態(tài)［51］。綠彎菌門含有綠色色素，具有降解纖維素作用，與地上生物量呈顯著正相關(guān)關(guān)系［52］。本研究綠彎菌門相對豐度隨汞濃度增加顯著降低，一方面可能由于地上蔬菜生物量總體隨汞濃度增加逐漸減少，土壤中纖維素減少，不利于綠彎菌門生長。另一方面，綠彎菌門中沒有脂質(zhì)外膜和專門的分泌系統(tǒng)，對汞較敏感，其生長易受汞抑制［53］。

op de Beeck等研究表明，重金屬污染對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化具有重要影響［54］。本研究子囊菌門、被孢菌門和擔(dān)子菌門為優(yōu)勢類群，與Zhang等研究結(jié)果［55］相似。子囊菌門被認(rèn)為是降解木質(zhì)纖維素的重要真菌，廣泛存在于農(nóng)田土壤。子囊菌門相對豐富隨汞脅迫加劇呈增加趨勢，說明對高濃度汞污染具有更大耐受性，可能由于子囊菌為腐生菌，能降解土壤有機(jī)質(zhì)［56］，在高汞濃度脅迫下土壤有機(jī)碳最多，從而有利于子囊菌門相對豐度增加。目前，關(guān)于子囊菌門對重金屬污染的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制研究較少。隨汞濃度增加，被孢菌門和擔(dān)子菌門相對豐度總體表現(xiàn)遞減趨勢。擔(dān)子菌門能適應(yīng)較低養(yǎng)分環(huán)境，具有降解纖維素和木質(zhì)素的能力［57］。汞濃度增加，土壤全氮和銨態(tài)氮等養(yǎng)分增加，蔬菜生物量減少，蔬菜殘體及木質(zhì)素較少，不利于擔(dān)子菌門生長。在重金屬脅迫下，擔(dān)子菌群酶活性受到抑制［58］，也導(dǎo)致?lián)泳T相對豐度減少。

本研究通過RDA分析探討了土壤細(xì)菌和真菌群落與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性，揭示了微生物群落受特定土壤理化性質(zhì)的影響。土壤細(xì)菌和真菌群落與土壤pH值、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和總汞含量有顯著相關(guān)性。許多研究也表明，土壤pH值和重金屬含量對微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響［31，59］。土壤pH值通過影響金屬離子溶解度和流動性在土壤重金屬的積累中起著重要作用，決定土壤養(yǎng)分的生物有效性，同時H+與溶解金屬之間的配體競爭，導(dǎo)致重金屬遷移率和生物利用度增加［45］。Wen等研究表明，模擬酸雨可增加土壤溶液中重金屬可溶性含量，增加重金屬的環(huán)境風(fēng)險［60］。一些敏感和耐受性菌群豐度隨土壤pH值增加而變化，土壤pH值通過影響重金屬形態(tài)和可用性，從而導(dǎo)致生態(tài)毒性的變化［61］。

低汞濃度處理提高了土壤細(xì)菌和hgcA基因數(shù)量。高汞濃度脅迫顯著降低了土壤細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)。汞濃度越高，對微生物群落結(jié)構(gòu)影響越大，真菌對汞的敏感性弱于細(xì)菌。放線菌門和子囊菌門對汞污染具有耐受性，綠彎菌門和被孢菌門對汞污染敏感。低汞濃度對擔(dān)子菌門有促進(jìn)作用，中等汞濃度對變形菌門有促進(jìn)作用。土壤pH值、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和汞含量是影響土壤細(xì)菌和真菌群落變化的主要因素。然而，關(guān)于汞對蔬菜土壤細(xì)菌和真菌群落的影響機(jī)制需開展長期的定點和多蔬菜種類研究。

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收稿日期：2022-07-20

基金項目：貴州省教育廳自然科學(xué)項目（編號：黔教合KY字［2020］163）；銅仁學(xué)院博士科研啟動基金（編號：tyxyDH2002、tyxyDH1603）；綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程教育部重點實驗室開放基金（編號：黔教合KY字［2019］036）；銅仁學(xué)院碩士點及學(xué)科建設(shè)研究子項目（編號：trxyxwdxm-027）；貴州省科技項目（編號：黔科合SY字［2014］3035）。

作者簡介：王喜英（1981—），女，河南汝南人，碩士，講師，主要從事生物化學(xué)及生物信息學(xué)分析。E-mail：810315971@qq.com。

通信作者：趙 輝，博士，教授，主要從事土壤微生態(tài)及作物栽培研究。E-mail：yancao504@163.com。