仔豬PRRSV、PEDV 和PoRV 混合感染的診斷及基因型分析

王祝榮，熊連

（長沙市雨花區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南長沙 410013；瀏陽市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南瀏陽 410300 ）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）屬于單股正鏈RNA 病毒，為動脈炎病毒屬成員。PRRSV 感染可導致豬繁殖與呼吸障礙綜合征（又稱為藍耳?。?，其臨床癥狀主要包括仔豬呼吸障礙和妊娠母豬繁殖障礙等，且該病可導致豬群出現(xiàn)嚴重的免疫抑制，增加繼發(fā)感染其他病原體幾率，給豬場造成嚴重的經(jīng)濟損失。PRRSV 基因組含有超過10 個開放閱讀框（open reading frames, ORF），其中ORF5 基因變異程度高，可利用該基因序列分析PRRSV 遺傳進化情況。

豬流行性腹瀉病毒 （porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）和豬輪狀病毒 （Porcine rotavirus）屬于重要腸道病毒，其感染均可導致仔豬腹瀉，其中PEDV S 和PoRV VP7 基因可分別用于PEDV 和PoRV 的遺傳進化分析。近年來，PRRSV 與腸道病毒混合感染十分常見，這給臨床診斷帶來巨大的困難，實驗室診斷技術 （如PCR 和qPCR 等）的應用可提高疾病診斷的高效性和準確性。2022 年冬季，湖南衡陽某豬場出現(xiàn)疫情，通過實驗室診斷技術對病原進行檢測，發(fā)現(xiàn)為PEDV、PoRV 和PRRSV 混合感染；進一步對PEDV S1、PoRV VP7 和PRRSV ORF5 基因進行RT-PCR 擴增與測序，分析其基因型，為該病的防控提供了科學依據(jù)。

1 發(fā)病豬場情況及病料采集

湖南衡陽市某豬場存欄母豬百余頭，2022年12 月初該場初生仔豬（主要是一周內仔豬）陸續(xù)出現(xiàn)畏寒、扎堆和水樣腹瀉，部分發(fā)病仔豬出現(xiàn)呼吸困難、耳尖發(fā)紫等。此外，有少數(shù)妊娠母豬出現(xiàn)繁殖障礙，如流產(chǎn)和早產(chǎn)等。為防制該病，豬場對發(fā)病仔豬群進行灌喂或肌肉注射抗生素，甚至對全體豬群緊急免疫接種偽狂犬病毒弱毒疫苗，但治療效果較差。至12 月中旬，該場已有近150 頭仔豬因極度腹瀉和脫水等死亡，病死率近60%。為確診病因，剖檢2 頭表現(xiàn)腹瀉和呼吸困難等癥狀且無治療意義發(fā)病仔豬，無菌采集小腸、肺臟、腹股溝淋巴結等組織樣品裝入潔凈封口袋，低溫運送進行病原診斷。

2 實驗室診斷

2.1 細菌分離與鑒定結果

將每頭送檢病豬組織樣品混合成1 份，共檢測2 份樣品。其簡要步驟如下：

2.1.1 在超凈工作臺下，以滅菌手術刀和眼科剪分別剪取少量小腸、肺臟、淋巴結等組織樣品后混合切碎，放入研缽內，并加入適量滅菌PBS 溶液；

2.1.2 反復研磨，直至未見塊狀組織樣品，室溫稍靜置2 分鐘；

2.1.3 用移液器吸取上清裝入2 毫升滅菌離心管內；

2.1.4 取滅菌接種環(huán)蘸取少量上清接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基表面（平板劃線），37℃恒溫箱內培養(yǎng)16～24 小時后，觀察培養(yǎng)基表面是否出現(xiàn)疑似菌落。結果發(fā)現(xiàn)，平板表面未出現(xiàn)疑似菌落，提示豬只發(fā)病并非細菌性病原感染引起。

2.2 病毒性病原診斷結果

采用商業(yè)化試劑盒提取組織研磨液DNA和RNA 基因組，其后將RNA 逆轉錄為cDNA。分別采用商業(yè)化病原檢測試劑盒 （qPCR 法）檢測核酸樣品中是否存在PRRSV、豬圓環(huán)病毒二型、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬細小病毒、豬乙腦病毒、PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒、PoRV 和豬德塔冠狀病毒等病原核酸。結果發(fā)現(xiàn)，2 份樣品均為PEDV （Ct 值分別為14.75 和19.01）和PRRSV 核酸陽性（Ct 值分別為16.33 和24.62），1 份樣品為PoRV 核酸陽性 （Ct 值為19.34）；其他病原核酸均為陰性。以上結果提示，該豬場暴發(fā)疫情是PEDV、PRRSV 和PoRV 混合感染所致。

2.3 三種病原基因型分析結果

為分析該豬場流行的PEDV、PRRSV 和PoRV 基因型特征，采用RT-PCR 法分別擴增PEDV S1 基因、PRRSV ORF5 基因和PoRV VP7基因序列。RT-PCR 體系（50.0 微升）包括2×PCR預混液25.0 微升、上下游引物各1.0 微升、模板3.0 微升和無核酸水20.0 微升；反應條件為95℃5 分鐘；95℃30 秒，56℃30 秒，72℃45 秒，共35個循環(huán)，72℃7 分鐘。反應結束后取少量RT-PCR產(chǎn)物進行瓊脂凝膠電泳，確定擴增出陽性結果后將其送至公司進行雙向測序，并分析測序結果。

RT-PCR 產(chǎn)物凝膠電泳結果所示，確定成功擴增陽性樣品PEDV S1 基因 （～1900 基點）、PoRV VP7 基因（～1000 基點）和PRRSV ORF5基因序列（～800 基點）（圖略）。測序后，分析序列特征結果發(fā)現(xiàn)，2 份PEDV S1 基因序列與國內2010 年后流行的PEDV 變異株 （Genbank 登錄號為KC210145.1）同源性最高（98.3%～98.5%），與經(jīng)典疫苗株CV777 同源性僅93.2%～93.8%；2份PRRSV ORF5 基因序列與已知類NADC30 株（Genbank 登錄號為KP861625.1）同源性最高（96.2%～97.1%），與其他基因亞型PRRSV 同源性均低于92.5%；1 份PoRV VP7 基因序列與已知PoRV G9 血清型毒株 （Genbank 登錄號為JF781163.1）同源性最高（97.4%），與其他基因型毒株同源性均低于95%。以上結果表明，該豬場流行的PEDV 株屬于變異株，PRRSV 株屬于類NADC30 株，而PoRV 株屬于G9 血清型。

3 討論

近年來，國內豬場發(fā)生多種疾病混合感染現(xiàn)象十分頻繁，使得疾病診斷和防控更加困難。PRRSV 感染不但使病豬出現(xiàn)系列臨床癥狀，導致嚴重的病死率；同時引發(fā)豬群免疫抑制，影響疫苗免疫效果，增加混合感染其他病原的幾率。在本案例中，該豬場暴發(fā)以仔豬腹瀉和部分妊娠母豬流產(chǎn)為特征的疫情，雖然對豬群進行抗生素治療和緊急免疫接種偽狂犬病毒弱毒疫苗，但效果仍然較差，豬場工作人員猜測該場豬群發(fā)病可能不是細菌性病原和偽狂犬病毒感染引起。

其后，送檢組織樣品進行病原診斷。雖然在病料組織中未成功分離到疑似菌落，由于該場在送檢樣品之前對豬群進行了長時間的抗生素治療，因此我們不能排除豬群感染細菌性病原的可能性。對樣品進行病毒性病原檢測，結果顯示，該場存在PRRSV、PEDV 和PoRV 混合感染疫情，進一步基因型分析發(fā)現(xiàn)該場流行PRRSV 屬于類NADC30 株，而PEDV 屬于變異株，PoRV屬于G9 血清型。根據(jù)該場負責人描述，該場一直為PRRSV 不穩(wěn)定場，但豬群生產(chǎn)成績相對穩(wěn)定。因此，筆者猜測該場仔豬因感染PRRSV 而免疫力下降，繼發(fā)感染PEDV 和PoRV 而出現(xiàn)腹瀉等癥狀。

為有效防控該病，筆者建議豬場應采取以下措施：對病死豬和無治療意義豬進行無害化處理；將發(fā)病豬群與假定健康豬群隔離飼養(yǎng)；清理糞污，清掃水槽和食槽等，徹底消毒；在走廊處噴灑石灰石，保持豬舍干燥；給予全場豬群免疫接種哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的腹瀉三聯(lián)滅活疫苗和PRRS 滅活疫苗（CH-1R 株），飼料內加入適量替米考星和泰萬菌素，連續(xù)用藥1 周。2 周后回訪豬場，該場豬群發(fā)病情況明顯得到改善。

4 小結

在本次案例中，筆者通過分子生物學診斷方法確定該場仔豬腹瀉和妊娠母豬繁殖障礙是由PRRSV （類NADC30 株）、PEDV （變異株）和PoRV（G9 血清型）混合感染所致。根據(jù)診斷結果提出了切實有效的防控方案，為此類混合感染疾病的診斷與防控提供了科學依據(jù)。