中藥渣降解菌株的篩選與鑒定

朱彭玲　王蘭英　彭梅芳　楊麗　柏曉林　王露瑤　胡昌江

摘要 ［目的］分離篩選中藥渣高效纖維素降解菌，并進(jìn)行纖維素酶酶活的測(cè)定，以提高藥渣附加值。［方法］將中藥渣腐解物及長(zhǎng)期堆放藥渣的土壤樣本放置于赫奇遜培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，分離純化出以藥渣為唯一碳源的菌株，將得到的菌株采用剛果紅平板法進(jìn)行初篩，測(cè)定菌株濾紙酶（FPA）、外切β-葡聚糖酶（CBH）、內(nèi)切β-葡聚糖酶（CMC）、β-葡萄糖苷酶（CB）等酶活進(jìn)行復(fù)篩，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化、16S rDNA序列分析進(jìn)行菌株鑒定。［結(jié)果］篩選到1株纖維素酶產(chǎn)生較好的纖維素降解菌株YZ25，其FPA酶活25.073 U/mL、CMC酶活24.978 U/mL、CBH酶活58.452 U/mL、CB酶活37.202 U/mL，經(jīng)鑒定菌株YZ25為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。［結(jié)論］該研究豐富了藥渣類纖維素降解菌株資源庫(kù)，應(yīng)用前景良好，對(duì)研究開(kāi)發(fā)中藥渣功能性生物有機(jī)肥料具有實(shí)際意義。

關(guān)鍵詞 中藥渣；纖維素降解菌株；枯草芽孢桿菌；篩選；鑒定

中圖分類號(hào) S 144文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2023）15-0154-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.15.038

Screening and Identification of Degradation Strains of Traditional Chinese Medicine Residue

ZHU Peng-ling1， WANG Lan-ying2， PENG Mei-fang2 et al

（1.Sichuan New Green Pharmaceutical Technology Development Co.， Ltd.， Pengzhou，Sichuan 611930; 2.Biotechnology and Nuclear Technology Research Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu，Sichuan 610061）

Abstract ［Objective］To isolate and screen the high-efficiency cellulose degrading bacteria from traditional Chinese medicine residue， and to determine the cellulase activity in order to improve the added value of traditional Chinese medicine residue. ［Method］The decomposition products of traditional Chinese medicine residues and soil samples piled up with drug residues for a long time were enriched and cultured in Hutchison medium， and the strains with drug residues as the only carbon source were isolated and purified. The obtained strains were primary screened by Congo red plate method， secondary screening by determine the strains filter paper activity， exo-β-glucanase activity， endo-β-glucanase activity and glucosidase activity. The strains were identified by morphology， physiology and biochemistry， 16S rDNA sequence analysis.［Result］One cellulose degrading strain YZ25 with good cellulase production was screened， with FPA enzyme activity of 25.073 U/mL， CMC enzyme activity of 24.978 U/mL， CBH enzyme activity of 58.452 U/mL， and CB enzyme activity of 37.202 U/mL. The strain YZ25 was identified as Bacillus subtilis.［Conclusion］ This study enriches the resource pool of cellulose degrading strains from drug residues and has a good application prospect， which has practical significance for the research and development of functional biological organic fertilizer from traditional Chinese medicine residue.

Key words Traditional Chinese medicine residue;Cellulose degrading strain;Bacillus subtilis;Screening;Identification

中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，隨著國(guó)家多項(xiàng)促進(jìn)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展舉措推進(jìn)，中醫(yī)對(duì)“未病先防、既病防變、病后防復(fù)”等理念的推廣，及人們對(duì)健康保健重視程度的提升，中藥材市場(chǎng)規(guī)模增長(zhǎng)迅速。中藥渣的排放量不容忽視，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年產(chǎn)生的藥渣固體廢物約有3 500萬(wàn)t［1］。中藥渣大部分為植物類，含有粗纖維、粗脂肪、淀粉、多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、氮、磷、鉀等成分［2］，大部分中藥渣都采用堆放、焚燒、填埋等傳統(tǒng)方法處理，導(dǎo)致嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。同時(shí)，中藥渣富含纖維素、木質(zhì)素類物質(zhì)，阻礙了中藥渣的再利用。目前針對(duì)藥渣微生物降解菌株研究較少，曾飛等［3］對(duì)甘草藥渣降解菌進(jìn)行了篩選，選育到草酸青霉 G2，其濾紙酶活力3.43 U/mL、內(nèi)切酶活力16.89 U/mL；吳清華等［4］對(duì)虎杖藥渣纖維素降解菌進(jìn)行篩選，初篩得到活性差異較大的纖維素降解菌7種。李婉云等［5］在藥用植物根區(qū)使用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基初篩及玉米秸稈、甘草藥渣固態(tài)培養(yǎng)基復(fù)篩，篩選到2株濾紙纖維素酶木霉菌菌株。郭建軍等［6］對(duì)藥渣纖維素降解菌進(jìn)行了篩選，得到菌株在以藥渣為底物發(fā)酵時(shí)的纖維素酶內(nèi)切酶酶活最高為93.32 U/mL，外切酶酶活最高為18.77 U/mL，β-葡萄糖苷酶酶活最高為5.71 U/mL。由于中藥材常用品種有441味，其藥渣成分復(fù)雜，菌株應(yīng)用效果不穩(wěn)定，還需要針對(duì)不同的品種進(jìn)行微生物降解菌株篩選。中藥材大部分為植物類，該類中藥材又分為根莖類、全草類、葉類、皮類、花類、果實(shí)類。該研究針對(duì)黨參、川芎、澤瀉、白芍、大黃、使君子、貫眾等具有代表性的中藥材根莖類中藥渣品種，進(jìn)行中藥渣降解菌的篩選，考察菌株對(duì)該類藥渣的發(fā)酵效率，以期將所篩選的菌株應(yīng)用到根莖類中藥渣處理中，解決大量中藥渣資源化問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品。中藥渣腐解物及長(zhǎng)期堆放藥渣的土壤樣本來(lái)源于四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，保存于4 ℃冰箱備用。

1.1.2 培養(yǎng)基。赫奇遜培養(yǎng)基：K2HPO4 1.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.1 g，F(xiàn)eCl3 0.01 g，NaNO3 2.5 g，水1 L，pH 7.0。纖維素剛果紅培養(yǎng)基：CMC-Na 15.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4 ·7H2O 0.5 g，（NH4）2SO4 2.0 g，剛果紅0.2 g，NaCl 0.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 7.0。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂15.0 g，水1 000 mL，pH 7.0，1×105 Pa滅菌30 min。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂15.0 g，水1 000 mL，pH自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株富集、分離。分別稱取藥渣或土壤樣品10 g，加入90 mL添加15 g新鮮藥渣的赫奇遜液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 150 r/min振蕩富集培養(yǎng)7 d。取1 mL培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于添加15 g CMC-Na的赫奇遜固體培養(yǎng)基上，30 ℃ 倒置連續(xù)觀察培養(yǎng)1～7 d，每天連續(xù)觀察，選取不同形態(tài)的菌落分別在LB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離純化培養(yǎng)。

1.2.2 菌株初篩。將分離純化后的菌株，采用點(diǎn)種法接種到纖維素剛果紅固體培養(yǎng)基上，觀察平板上有無(wú)透明圈，挑取透明圈較大的菌株，測(cè)定透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值（D/d），根據(jù)比值大小初步判定纖維素降解能力的大小，并將篩選到的菌株接種到對(duì)應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)1～5 d，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌株復(fù)篩。

將初篩得到的菌株分別接入添加15 g新鮮藥渣的赫奇遜液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)1～7 d，發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清液為粗酶液。

酶活測(cè)定：①濾紙酶（FPA）酶活的測(cè)定［7］。在試管（含空白）中加入1.5 mL 0.05 mol/L pH 4.5的檸檬酸緩沖液及濾紙條50 mg，置于50 ℃水浴中預(yù)熱5 min，加入0.5 mL稀釋酶液（空白不加），50 ℃水浴保溫1 h后取出，立即向各管加入1.5 mL DNS試劑，并在空白中加入稀釋酶液0.5 mL，搖勻后將全部試管同時(shí)放入沸水中加熱10 min后取出，迅速冷卻至室溫，定容至10 mL，520 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。②外切β-葡聚糖酶（CBH）酶活的測(cè)定［8］。在試管中加入1.5 mL 0.05 mol/L pH 5.0的檸檬酸緩沖液及脫脂棉0.1 g，置于45 ℃水浴中預(yù)熱5 min，加入0.5 mL稀釋酶液，45 ℃水浴保溫24 h后取出，顯色過(guò)程及對(duì)照同F(xiàn)PA酶活測(cè)定，520 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。③內(nèi)切β-葡聚糖酶（CMC）酶活測(cè)定［8］。在試管中加入1.5 mL 1％CMC檸檬酸緩沖液，預(yù)熱5 min后，加入0.5 mL稀釋酶液，45 ℃水浴保溫30 min后取出，顯色過(guò)程及對(duì)照同F(xiàn)PA酶活測(cè)定，520 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。④β-葡萄糖苷酶（CB）酶活的測(cè)定［9］。在試管中加入1.5 mL 0.5％水楊苷檸檬酸緩沖液，預(yù)熱5 min后，加入0.5 mL稀釋好的酶液，50 ℃水浴保溫30 min后取出，顯色過(guò)程及對(duì)照同F(xiàn)PA酶活測(cè)定，520 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。

1.2.4 菌株鑒定。

形態(tài)鑒定和生理生化特性研究參考文獻(xiàn)［10］。使用基因DNA提取試劑盒（Thermo Fisher）進(jìn)行DNA提取，采用16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′）、1492R（5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)菌株進(jìn)行16S擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃45 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次，72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)同源系列，使用MEGA軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)、生理生化特征確定菌株名稱。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩

在藥渣和土壤樣品中，通過(guò)富集培養(yǎng)，從分離純化的26株菌株中篩選到4株具有藥渣纖維降解的菌株，分別命名為YZ9、YZ17、YZ22、YZ25。將菌株分別接種到纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，測(cè)定透明圈直徑與菌落直徑比值大小，其值分別為1.47、1.32、1.65、2.70（表1），表明菌株具有較好的纖維素降解能力。

2.2 菌株復(fù)篩

將初篩獲得的4株菌株進(jìn)行復(fù)篩，對(duì)菌株的FPA、CMC、CBH、CB酶活進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明（表2），菌株YZ25的FPA酶活、CMC酶活、CBH酶活、CB酶活均最高，分別為25.073、24.978、58.452、37.202 U/mL，根據(jù)復(fù)篩結(jié)果，選取菌株YZ25進(jìn)行了菌株鑒定。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定。

菌株YZ25，革蘭氏陽(yáng)性，兼性厭氧，桿狀，產(chǎn)芽孢，在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落乳白色，光滑，表面濕潤(rùn)，不透明，邊緣不規(guī)則。

2.3.2 生理生化特性。

由表3可知，菌株YZ25甘露醇產(chǎn)酸陰性，在2%、5%、7%、10%NaCl生長(zhǎng)陽(yáng)性，在30、40、50 ℃生長(zhǎng)陽(yáng)性。

2.3.3 序列分析。

在NIBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast同源性比較，結(jié)果顯示（圖1），菌株YZ25與枯草芽孢桿菌（KX960108.1 Bacillus subtilis）同源性最高。結(jié)合形態(tài)學(xué)分析和生理生化特征結(jié)果，確定菌株YZ25為枯草芽孢桿菌。

3 討論

隨著國(guó)家《“十四五”中醫(yī)藥發(fā)展規(guī)劃》等一系列促進(jìn)中醫(yī)藥發(fā)展政策出臺(tái)及中醫(yī)藥特色醫(yī)養(yǎng)結(jié)合需求量增加［11］，中藥渣的資源化利用將成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展及環(huán)境保護(hù)的迫切需求，利用中藥渣開(kāi)發(fā)生物有機(jī)肥是提高其附加值的一種手段。目前，中藥渣降解菌生物資源篩選報(bào)道不多，主要集中在虎杖、甘草、黃芪、木薯、丹參等藥材［3-4，12-14］，涉及范圍有限，而中藥渣品種豐富，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)作物生長(zhǎng)［15-17］，且藥渣中還含有約30%的藥用成分［18］，覆蓋大量抑菌［19］和驅(qū)蟲(chóng)、殺蟲(chóng)［20］的藥效成分，部分已證實(shí)能有效應(yīng)用于農(nóng)作物［19-21］，這些功效成分都有待開(kāi)發(fā)應(yīng)用。該研究從提高中藥渣附加值的角度出發(fā)，篩選藥渣纖維素降解菌，將藥渣轉(zhuǎn)化為作物可利用資源，對(duì)實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展、保護(hù)環(huán)境起到了積極作用，為后續(xù)中藥渣功能性生物有機(jī)肥的開(kāi)發(fā)打下了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

該研究從中藥渣腐解物及長(zhǎng)期堆放藥渣的土壤樣本中篩選到1株纖維素酶產(chǎn)生較好的纖維素降解菌株YZ25，豐富了纖維素降解菌株資源庫(kù)，應(yīng)用前景良好，對(duì)研究開(kāi)發(fā)中藥渣功能性生物有機(jī)肥料具有實(shí)際意義。

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基金項(xiàng)目 成都市重點(diǎn)研發(fā)支撐計(jì)劃（2021-YF05-02126-SN）。

作者簡(jiǎn)介 朱彭玲（1981—），女，四川成都人，助理研究員，碩士，從事應(yīng)用微生物研究開(kāi)發(fā)工作。

*通信作者，教授，從事中藥材研究開(kāi)發(fā)工作。

收稿日期 2022-06-27