Cre/loxP系統(tǒng)應(yīng)用于畢赤酵母基因敲除的研究進(jìn)展

王未鮮　韓銘海

摘要 畢赤酵母是重組蛋白最常用的表達(dá)系統(tǒng)之一，蛋白高水平表達(dá)策略一直是領(lǐng)域內(nèi)最重要的研究課題之一。在后基因組時代，高效而便捷的基因改造是一種有效提高畢赤酵母蛋白表達(dá)能力的手段，其中由Cre/loxP系統(tǒng)介導(dǎo)的基因改造技術(shù)受到了科研人員的廣泛關(guān)注。綜述了Cre/loxP系統(tǒng)的基本原理、應(yīng)用于畢赤酵母基因敲除的技術(shù)路線及其關(guān)鍵的技術(shù)問題。

關(guān)鍵詞 畢赤酵母；Cre/loxP；基因敲除

中圖分類號 Q 78文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2023）15-0010-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.15.003

Research Progress on Gene Knockout in Pichia pastoris Mediated by Cre/loxP System

WANG Wei-xian1， HAN Ming-hai2

（1. Analytical and Testing Center， Guizhou Institute of Technology， Guiyang， Guizhou 550000；2.College of Food and Pharmaceutical Engineering， Guizhou Institute of Technology， Guiyang， Guizhou 550000）

Abstract Pichia pastoris is one of the most commonly used systems for expressing recombinant proteins， and the strategy for high-level protein expression is one of the most important research topics in this field. In the post-genomic era， efficient and convenient genetic modification is an effective means to improve the ability of protein expression in Pichia pastoris. Among them， the gene modification technology mediated by Cre/loxP system has attracted extensive attention of researchers. In this paper， the basic principle of Cre/loxP system， the technical route and the key technical issues of gene knockout in Pichia pastoris are summarized.

Key words Pichia pastoris;Cre/loxP;Gene knockout

畢赤酵母（Pichia pastoris，最新系統(tǒng)命名為Komagataella phaffii）是重組蛋白最常用的表達(dá)系統(tǒng)之一［1-2］。相比較于其他表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有明顯的優(yōu)勢：低廉的培養(yǎng)成本、較高的培養(yǎng)密度、易于操控的啟動子、易于基因改造操作、優(yōu)良的蛋白分泌能力、不分泌熱原物質(zhì)、具有真核細(xì)胞的翻譯后修飾，尤其是由其表達(dá)的多肽都具有蛋白活性［1-2］。然而由此宿主表達(dá)的一些有價值的蛋白產(chǎn)品水平仍然較低，因此，促進(jìn)異源蛋白表達(dá)的技術(shù)和策略依然是該領(lǐng)域最重要的研究課題之一［3-4］。畢赤酵母的基因組測序已完成，并已公開發(fā)布［5-6］，在后基因組研究中，以提高畢赤酵母蛋白表達(dá)能力為目的的高效而操作便捷的基因改造技術(shù)受到科研人員廣泛關(guān)注。其中，多篇文獻(xiàn)報道了科研人員利用Cre/loxP系統(tǒng)成功地完成了畢赤酵母的基因敲除操作［7-12］，充分顯示了該系統(tǒng)應(yīng)用于這種酵母基因改造的可靠性。

1 Cre/loxP系統(tǒng)

來自P1噬菌的Cre/loxP系統(tǒng)由Cre重組酶和loxP位點組成，而Cre/loxP介導(dǎo)的基因重組可應(yīng)用于酵母、擬南芥、棉花、水稻、果蠅、小鼠和斑馬魚等多種真核細(xì)胞的基因改造［13-14］。截至2023年2月，以“Cre recombinase”為關(guān)鍵詞，通過PubMed搜索引擎可檢索到超過7 000篇的文獻(xiàn)，這也說明了Cre/loxP系統(tǒng)應(yīng)用于細(xì)胞基因改造技術(shù)的廣泛性和有效性。

1.1 Cre重組酶

Cre重組酶是由343個氨基酸組成的單體蛋白，分子量約為38 kDa［13-14］，其有2個結(jié)構(gòu)域：NTD（N-末端結(jié)構(gòu)域，由110個氨基酸殘基組成）和CTD（C-末端結(jié)構(gòu)域，由210個氨基酸殘基組成）。Cre重組酶蛋白的活性中心位于CTD結(jié)構(gòu)域中，主要由Arg173-His289-Arg292三聯(lián)體結(jié)構(gòu)、2個親核性氨基酸殘基Trp315、Try324以及Glu176、Lys201構(gòu)成，其中Try324殘基具有切割活性，另外Arg259的功能與Cre重組酶的催化活性和loxP位點特異性有關(guān)［15］。Cre重組酶催化2個loxP位點之間的重組反應(yīng)，不需要任何宿主輔因子或輔助蛋白［13-14］。

1.2 loxP位點

loxP位點是1個長度為34 bp的序列，由2個13 bp的反向重復(fù)序列和中間8 bp間隔序列組成，由于8 bp間隔序列是不對稱的，這確定了loxP位點的方向［16-17］。在DNA分子鏈上，如果2個loxP位點方向相反，則在Cre重組酶的作用下，2個loxP位點之間的DNA序列發(fā)生倒位，這種情況一般不具有基因改造應(yīng)用價值；如果2個loxP位點方向相同，則Cre重組酶可以高效地刪除它們之間的DNA序列，產(chǎn)生一個新的loxP位點［13-14］。但是，新的loxP位點依然被Cre識別，并參與Cre/loxP介導(dǎo)的重組反應(yīng)，這不利于細(xì)胞的基因改造。為了解決這一問題，研究人員使用了2種突變的loxP位點，即lox71和lox66［13-14］，它們在左臂反向重復(fù)序列或右臂反向重復(fù)序列中含有5 bp的突變（表1），lox71和lox66位點可以被Cre蛋白有效識別，重組反應(yīng)產(chǎn)生一個新的loxP位點——lox72。lox72是一個惰性的位點，其左臂反向重復(fù)序列和右臂反向重復(fù)序列中同時含有5 bp的突變，與Cre重組酶的親和力極微弱，因此不參與Cre/loxP介導(dǎo)的重組反應(yīng)，從而實現(xiàn)lox71和lox66之間的DNA片段永久刪除［13-14，18］。

2 Cre/loxP系統(tǒng)應(yīng)用于畢赤酵母基因敲除

2.1 基本原件和主要過程

利用Cre/loxP系統(tǒng)敲除基因的主要核心問題是如何構(gòu)建基因敲除盒（gene disruption cassette）。基因敲除盒主要包含3個基本原件［13-14］：①篩選標(biāo)記基因，一般常用的是抗生素Zeocin抗性標(biāo)記［7-9，11-12］，有些是G418抗性標(biāo)記［10］；②位于篩選標(biāo)記基因上下游的2個突變的loxP位點（一般是lox71和lox66）；③靶基因上游和下游同源臂序列。利用Cre/loxP系統(tǒng)敲除靶基因的過程主要分為兩步［13-14］：①靶基因與基因敲除盒中的同源臂發(fā)生同源重組，基因敲除盒插入靶基因序列，破壞靶基因；②Cre重組酶催化lox71和lox66位點發(fā)生重組，刪除這2個loxP位點之間的DNA序列，切除篩選標(biāo)記，靶基因序列中留下1個惰性的loxP位點（即lox72），完成靶基因的敲除。

2.2 技術(shù)路線和策略

Pan等［7］報道了一種新穎的構(gòu)建基因敲除盒技術(shù)路線：①將Cre蛋白基因克隆到pPICZA質(zhì)粒上，通過PCR獲得Cre-ZeoR序列（ZeoR是Zeocin抗性基因Sh ble的序列）；②通過融合PCR技術(shù)融合3段DNA序列，將lox71和lox66插入Cre-ZeoR序列兩端，構(gòu)建基因敲除盒U-lox71-Cre-ZeoR-lox66-D（U為靶基因上游同源臂，D為靶基因下游同源臂）；③將基因敲除盒電轉(zhuǎn)畢赤酵母，插入靶基因序列中；④甲醇誘導(dǎo)Cre蛋白表達(dá)，激活Cre/loxP系統(tǒng)刪除lox71與lox66之間的DNA序列。這種方法的優(yōu)點是可以采用較少的步驟來完成基因敲除盒的構(gòu)建，但是同時也存在不足：①融合PCR技術(shù)對科研人員的操作經(jīng)驗有一定的要求，并且由于引物中存在lox66和lox71序列，其含有較多的重復(fù)序列，進(jìn)一步增加了融合PCR的難度，這可能要通過多次的嘗試甚至要更換不同的引物才能夠獲得成功；②構(gòu)建的基因敲除盒U-lox71-Cre-ZeoR-lox66-D無法克隆到質(zhì)粒中進(jìn)行保存和擴增，因此如果要敲除多個基因，則需要構(gòu)建多個不同的基因敲除盒序列，這將是一項繁重的實驗操作。另外Pan等［7］還推測，多次PCR可能導(dǎo)致基因敲除盒序列發(fā)生一定突變，可能會影響Cre/loxP系統(tǒng)的效率。

Han等［8］報道了一種改進(jìn)的兩步法策略（圖1），將Cre蛋白基因和loxP序列安置在不同的質(zhì)粒中，構(gòu)建的中間序列可以插入質(zhì)粒中保存和擴增，具體技術(shù)路線如下：①從pPICZαA獲得ZeoR序列，通過PCR構(gòu)建lox71-ZeoR-lox66序列原件，并插入克隆質(zhì)粒中保存；②在獲得lox71-ZeoR-lox66序列基礎(chǔ)上，克隆靶基因上下游同源臂序列，構(gòu)建U-lox71-ZeoR-lox66-D基因敲除盒序列；③通過電轉(zhuǎn)將基因敲除盒導(dǎo)入畢赤酵母，嵌入靶基因；④將Cre蛋白基因克隆到pPICZαA質(zhì)粒中，構(gòu)建pPICZαA/Cre質(zhì)粒，并將HIS4基因（源于pAO815質(zhì)粒）插入pPICZαA/Cre獲得輔助質(zhì)粒pPICZαA/Cre/his4；⑤通過電轉(zhuǎn)，將輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到上述已嵌入基因敲除盒的畢赤酵母中，產(chǎn)生U-lox71-ZeoR-pPICZαA/Cre/his4-lox66-D序列（重組位點在ZeoR序列中）；⑥甲醇誘導(dǎo)Cre蛋白表達(dá)，刪除ZeoR-pPICZαA/Cre/his4序列。兩步法技術(shù)路線的優(yōu)點是：①易于操作，可以避免有技術(shù)難度的融合PCR操作；②lox71-ZeoR-lox66或U-lox71-ZeoR-lox66-D中間序列都可以克隆并保存在質(zhì)粒中，有利于多基因敲除操作；③該方法中構(gòu)建的輔助質(zhì)粒pPICZαA/Cre/his4還可以直接應(yīng)用于其他不同基因的敲除?？傊?，相比Pan等［7］報道的方法，雖然增加了操作步驟（增加了一次畢赤酵母的轉(zhuǎn)化操作），但是對于初次接觸分子生物學(xué)的研究人員是十分友好的，而且特別適用于多基因敲除的操作。

如果需要敲除的靶基因是畢赤酵母維持正常生長所必需的，那么用傳統(tǒng)的基因敲除方法可能就得不到所需的突變菌株。對于這個技術(shù)難題，Shibui等［9］提出了一種有效的解決方案：在基因敲除盒U-lox71-Cre-ZeoR-lox66-D序列中插入靶基因?qū)?yīng)的救援基因（rescue gene），當(dāng)基因敲除盒序列破壞靶基因后，基因敲除盒序列中的救援基因就會彌補靶基因的功能，使畢赤酵母細(xì)胞的生長表型不會發(fā)生改變。

2.3 Cre/loxP系統(tǒng)在畢赤酵母中應(yīng)用的技術(shù)問題

2.3.1 PAOX1驅(qū)動Cre蛋白表達(dá)。

啟動子PAOX1具有較高的轉(zhuǎn)錄活性［1-2］，是畢赤酵母中最常用異源蛋白表達(dá)的啟動子之一。大部分的文獻(xiàn)報道，應(yīng)用于畢赤酵母的Cre/loxP系統(tǒng)的Cre蛋白都是利用PAOX1來表達(dá)的，這也使得該系統(tǒng)在這種細(xì)胞中表現(xiàn)出了較高的活性。Shibui等［9］報道，在30 ℃，甲醇誘導(dǎo)PAOX1表達(dá)Cre蛋白6 h后，96%的畢赤酵母細(xì)胞完成了Cre/loxP系統(tǒng)介導(dǎo)的重組；Han等［8］報道，在28 ℃，甲醇誘導(dǎo)48 h，100%的畢赤酵母細(xì)胞完成了此重組反應(yīng)。另外，即使lox71與lox66之間有冗長的序列，Cre蛋白依然能高效地完成催化重組。例如，Han等［8］報道，當(dāng)lox71與lox66之間序列長達(dá)10 kbp時，經(jīng)過48 h的甲醇誘導(dǎo)，基因重組效率依然達(dá)到了100%。

在畢赤酵母中，PAOX1是受到嚴(yán)格調(diào)控的，在有葡萄糖、乙醇、甘油等碳源存在條件下，PAOX1的轉(zhuǎn)錄活性是受到強烈抑制的［1-2］；但Shibui等［9］報道，在PAOX1活性被抑制的情況下，畢赤酵母中的Cre/loxP系統(tǒng)還是表現(xiàn)出了微弱活性。

在大腸桿菌中，PAOX1沒有受到細(xì)胞的調(diào)控，可能表現(xiàn)出一定的活性，由PAOX1驅(qū)動的Cre蛋白基因出現(xiàn)了一定程度的滲漏表達(dá)（leakage expression）［19-20］，這就導(dǎo)致Cre/loxP系統(tǒng)表現(xiàn)出了一定的活性。因而，含有l(wèi)ox71-PAOX1-Cre-lox66序列的質(zhì)粒在大腸桿菌中不穩(wěn)定［8，19-20］，這也許是部分研究者選擇通過融合PCR構(gòu)建基因敲除盒的主要原因。

2.3.2 Cre蛋白的毒性。

目前，未發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道Cre蛋白對畢赤酵母細(xì)胞的影響，但是在其他細(xì)胞中，Cre蛋白的毒害作用已被證實。例如，Cre蛋白基因的表達(dá)可以減少哺乳動物細(xì)胞增殖、導(dǎo)致異常DNA重組及染色體缺陷［21］；在包括神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了Cre蛋白表達(dá)導(dǎo)致的毒性［21-24］；Cre蛋白表達(dá)也可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的消退［21］。

在哺乳動物基因組中發(fā)現(xiàn)了許多隱性（pseudo）loxP位點［25-26］，生物信息學(xué)分析表明某些基因組區(qū)域，這種隱性loxP位點出現(xiàn)的頻率為1.2個/Mbp［27］?？紤]到畢赤酵母的基因組大約為9.7 Mbp，因而不能忽略Cre蛋白的毒性，不能排除長期高水平表達(dá)Cre蛋白對畢赤酵母的毒性，因而使用誘導(dǎo)型Cre/loxP系統(tǒng)和及時刪除Cre蛋白基因都是必須的。目前，研究者大多采用的基因敲除盒都是在U-lox71-Cre-ZeoR-lox66-D序列基礎(chǔ)上改進(jìn)的，Cre/loxP系統(tǒng)介導(dǎo)的重組反應(yīng)與Cre蛋白基因的刪除是同時發(fā)生的，這種策略可以避免或是降低Cre蛋白對畢赤酵母毒害的可能性。

2.3.3 同源臂的長度。

在畢赤酵母中，基因取代（gene replacement）效率高度依賴于靶基因同源臂的長度［28］，延長同源臂的長度可以有效地提高基因取代效率，提高基因敲除效率（打靶效率）。為了達(dá)到合理的打靶效率，與釀酒酵母相比，畢赤酵母中靶基因同源臂要長得多［9］。Shibui等［9］報道，當(dāng)前后同源臂的長度均為40 bp時，敲除och1、URA3和ADE2的打靶效率分別為1/40（2.5%）、1/60（1.7%）和1/70（1.4%）；Han等［8］報道，當(dāng)前后同源臂的長度分別為2 300和1 500 bp時，敲除cne1和his4基因的打靶效率分別為15.6%和26.7%［8］；Cregg等［28］報道，當(dāng)前后同源臂的長度超過2 000 bp時，基因打靶效率能超過50%，如果同源臂的長度小于500 bp，那么其打靶效率可能會小于0.1%；Chen等［29］報道，敲除och1基因的同源臂長度分別為874和852 bp時，其基因敲除效率為1/10（10%）。除了同源臂的長度以外，影響打靶效率的因素還包括同源臂位于靶基因的位置及靶基因本身等［9，28，30］。

3 與其他基因敲除系統(tǒng)的比較

3.1 FLP/FRT系統(tǒng)

來源于釀酒酵母的FLP/FRT系統(tǒng)由FLP重組酶及相應(yīng)的FRT位點組成，其工作機制與Cre/loxP系統(tǒng)極為相似：FLP重組酶催化2個同向的FRT位點發(fā)生重組，刪除這2個位點之間的DNA序列［31］。FLP/FRT系統(tǒng)也被廣泛應(yīng)用到多種細(xì)胞的基因敲除技術(shù)中，其中包括畢赤酵母。例如，Cregg等［32］報道了1種利用FLP/FRT系統(tǒng)兩步法敲除畢赤酵母（Arg-）菌株中的his4基因：①將靶基因（his4）的上下游同源臂、2個FRT位點、arg4基因序列和FLP基因構(gòu)建到1個質(zhì)粒上；②質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中；③his4基因被基因敲除盒序列取代，而FLP介導(dǎo)的重組則切除arg4基因。試驗結(jié)果表明，基因敲除打靶效率為26%（表型是His-的克隆比例）。另外，Ahmad等［33］報道了利用FLP/FRT系統(tǒng)一步法策略，其巧妙地使用了一種可自我切除的基因敲除盒，基因敲除盒序列由PAOX1、FLP基因、FRT、Sh ble基因、靶基因的上下游同源臂等組成（U-FRT-PAOX1-FLP-Sh ble-FRT-D）；該基因敲除盒序列的構(gòu)建與Han等［8］報道的策略相似，通過融合PCR技術(shù)預(yù)制FRT-PAOX1-FLP-Sh ble-FRT片段，并插入質(zhì)粒；再用靶基因的上下游同源臂替換FRT位點側(cè)翼的序列，就得到了基因敲除盒序列。

3.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)

CRISPR/Cas系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌與古細(xì)菌中，具有抵抗噬菌體和質(zhì)粒DNA入侵的功能［34-35］。近年來，高效的CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于基因組編輯已經(jīng)成為生物學(xué)研究的熱門話題。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由CRISPR序列和Cas9蛋白組成，在Cas9蛋白作用下，便可完成精準(zhǔn)而高效的基因編輯［34-35］。CRISPR 序列包含1個前導(dǎo)序列（leader）、多個高度保守的重復(fù)序列（repeat）和多段間隔序列（spacer），其中Leader是啟動子序列，位于CRISPR的上游，Repeat序列是長度在21～48 bp的反向重復(fù)序列，能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，Spacer序列則是外源DNA序列［34-35］。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于多種細(xì)胞（包括畢赤酵母）基因敲除操作，并表現(xiàn)出較高的效率，受到研究者的青睞［36-39］。盡管應(yīng)用Cre/loxP系統(tǒng)介導(dǎo)基因敲除的打靶效率并沒有CRISPR/Cas9系統(tǒng)那么出色，但Cre/loxP系統(tǒng)的使用歷史更悠久，有成熟的操作性可以借鑒，其仍然是當(dāng)今酵母基因敲除常用的系統(tǒng)［36-39］，另外，一些研究者也在使用過程中不斷改進(jìn)Cre/loxP系統(tǒng)的技術(shù)和策略，也確實進(jìn)一步提升了其應(yīng)用價值［7-12，40］。在采用合理的上下游同源臂長度的條件下，Cre/loxP系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)能表現(xiàn)出良好的打靶效率，是完全能夠滿足畢赤酵母常規(guī)的基因敲除操作；如果能采用精簡的基因敲除盒序列，預(yù)制中間序列（例如lox71-Sh ble-lox66），則可大大便捷基因敲除盒的構(gòu)建，特別有利于多個基因敲除的操作。

4 結(jié)語

Cre/loxP系統(tǒng)已被證明能有效地應(yīng)用于畢赤酵母基因敲除技術(shù)，至今仍具有良好的應(yīng)用價值。在利用Cre/loxP系統(tǒng)時，①要注意Cre蛋白滲漏的問題，這將導(dǎo)致含有l(wèi)ox71-Cre-lox66序列質(zhì)粒在大腸桿菌中不穩(wěn)定；②要保證靶基因上下游同源臂的長度以滿足合理的打靶效率；③建議利用強啟動子來表達(dá)Cre基因，例如PAOX1，以確保Cre/loxP系統(tǒng)表現(xiàn)出良好的活性；④建議預(yù)制基因敲除盒的部分序列，以方便基因敲除盒序列的構(gòu)建，以提高多個基因敲除操作的效率。

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基金項目 國家自然科學(xué)基金項目（32260012）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項目（黔科合基礎(chǔ)〔2020〕1Y148號）。

作者簡介 王未鮮（1976—），女，山西原平人，實驗師，碩士，從事微生物蛋白工程的研究。*通信作者，副教授，博士，從事畢赤酵母高效蛋白表達(dá)技術(shù)研究。

收稿日期 2023-02-24