基于白細(xì)胞介素8/黏蛋白5ac信號探討益氣活血化痰方對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道重塑及平滑肌厚度的影響※

陳慧婷 王盛隆 白 麗

(山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肺病科,山西 太原 030013)

相關(guān)統(tǒng)計顯示,我國每年死于慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的患者有近百萬,致殘人數(shù)近千萬[1]。在國外,COPD也是致殘及致死率前五的疾病[2]。COPD患者主要表現(xiàn)為氣道慢性炎癥及氣流受阻,同時還伴有氣道黏膜高分泌,使得氣道狹窄,影響肺功能。白細(xì)胞介素8(IL-8)/黏蛋白5ac(MUC5ac)通路在氣道高分泌發(fā)展中占有重要地位,可通過激活該通路,調(diào)控MUC5ac表達(dá),影響氣道黏液分泌。IL-8通過調(diào)控該通路中核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)的表達(dá)調(diào)控炎性反應(yīng),并調(diào)控MUC5ac表達(dá)。COPD患者該通路異?；罨?促進炎癥反復(fù)發(fā)展,持續(xù)的氣道炎癥反應(yīng)會促使氣道狹小,支氣管平滑肌厚度增加,影響肺功能[3]。目前,COPD的治療常選用糖皮質(zhì)激素類藥物,具有一定的療效,但該類藥物具有毒副作用。此外,由于COPD病程久,易反復(fù)發(fā)作,使得患者的經(jīng)濟費用增加,最終導(dǎo)致患者的依從性低,不易長期使用。近年來,中醫(yī)對COPD的治療逐漸成為研究熱點。COPD屬中醫(yī)學(xué)“肺脹”“喘證”“咳嗽”等疾病范疇,主要累及肺,兼及脾、心、腎。其病因主要為水停痰凝、氣虛氣滯、痰瘀互結(jié),在后期則兼見腎虛的證候[4]。根據(jù)辨證,本實驗運用益氣活血化痰方對其動物模型進行治療。既往研究已經(jīng)證實,益氣活血化痰方可抑制COPD模型動物IL-8等炎癥因子的增加,下調(diào)肺組織MUC5ac、NF-κB等蛋白的表達(dá),改善肺功能,減少COPD的復(fù)發(fā)?；诖?本研究基于IL-8/MUC5ac信號通路探討益氣活血化痰方對COPD大鼠氣道重塑及平滑肌厚度的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠53只,購自江蘇艾菱菲生物公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2021-1012,體質(zhì)量200～300 g,鼠齡6～8周,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 實驗藥物 益氣活血化痰方藥物組成:南沙參、黃芪、桔梗、茯苓、法半夏、紫菀各15 g,杏仁12 g,水蛭、百合各9 g,甘草6 g。將藥物煎煮3次后濃縮成浸膏,生藥量3.2 g/mL。冰箱中保存。

1.3 實驗試劑及儀器

1.3.1 實驗試劑 白細(xì)胞介素8(IL-8)、IL-17、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司,貨號分別為:SP10233、SP10179、SP10205);IKB激酶2(IKK2)一抗(上海研生實業(yè)有限公司,貨號:YS-YK00174);磷酸化IKB激酶α(p-IKBα)一抗(法國Covalab公司,貨號:pab11292);NF-κB一抗(美國abclonal公司,貨號:A15694);MUC5ac一抗(英國Abbexa公司,貨號:abx106178);辣根過氧化物酶二抗(上海李記生物科技有限公司,貨號:AP31L343);脂多糖(LPS)(北京伊塔生物科技有限公司,貨號:YT1319);吡咯烷二硫代甲酸銨(PDTC)(上海翌圣生物科技股份有限公司,貨號:52202ES50);戊巴比妥鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字H31021725);二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)蛋白定量試劑盒(Pierce公司,貨號:23225);蘇木素-伊紅(HE)試劑盒( 北京索萊寶科技有限公司,貨號:G1120);磷酸鹽緩沖液(PBS)(北京伊塔生物科技有限公司,貨號:YT8386)。

1.3.2 實驗儀器 PFT動物肺功能檢測儀(美國DATA SCIENCES INTERNATIONAL公司),BK-1200全自動生化分析儀(山東BIOBASE公司),RT-6100酶標(biāo)分析儀(雷杜生命科學(xué)股份有限公司),MAGICL6800全自動化學(xué)發(fā)光測定儀(南京基蛋生物科技股份有限公司),TDZ4-WS型低速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司),SLK-O3000-S LED數(shù)顯圓周搖床(美國賽洛捷克公司),DYCP-31E型電泳儀(上海新諾儀器設(shè)備有限公司),RV 10 digital V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司),B203LED生物顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組及造模 于53只大鼠中隨機抽取10只大鼠作為健康組進行對照,剩余43只大鼠根據(jù)文獻[5]建立COPD模型:采用氣管滴入LPS結(jié)合香煙(焦油含量:13 mg,煙堿含量:1.1 mg,每次10支)建模。將大鼠放置于80 cm×50 cm×40 cm的密閉箱內(nèi),于建模第1、14天在大鼠氣管內(nèi)滴入LPS 200 μg/200 μL,第2～13、15～60天,每天煙熏0.5 h進行建模。大鼠在出現(xiàn)食欲不振、持續(xù)腹瀉后,隨機抽取3只大鼠,處死后取肺組織進行HE染色,觀察到大鼠支氣管腔狹窄、肺泡壁斷裂且有大量炎性細(xì)胞浸潤視為建模成功。建模過程中無意外死亡,剩余40只大鼠運用數(shù)字隨機表法分為模型組、中藥組、抑制劑組、聯(lián)合組,每組10只。

1.4.2 給藥 中藥組大鼠予益氣活血化痰方32 g/kg灌胃,每日1次,連續(xù)給藥28天;抑制劑組大鼠予腹腔注射100 mg/kg的IL-8/IKK/NF-κB/MUC5ac通路抑制劑PDTC,每日1次,連續(xù)給藥28天;聯(lián)合組予益氣活血化痰方32 g/kg灌胃的同時腹腔注射PDTC 100 mg/kg,每日1次,連續(xù)給藥28天;健康組、模型組正常飼養(yǎng),不予干預(yù)。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 肺功能指標(biāo) 1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后暴露氣管,在氣管軟骨處做環(huán)形切口,接入三通管,并將該管與氣管固定,采用動物肺功能檢測儀測定用力肺活量(FVC)、呼氣峰值流速(PEF)、第1 s用力呼氣容積(FEV1)。

1.5.2 肺泡灌洗液炎癥因子水平 將各組大鼠麻醉后,打開胸腔,將灌胃針頭插入氣管,運用0.9%氯化鈉注射液沖洗肺部并收集肺泡灌洗液,酶聯(lián)免疫吸附法檢測肺泡灌洗液中IL-8、IL-17、TNF-α水平,將標(biāo)準(zhǔn)品進行稀釋后加入酶標(biāo)孔內(nèi),封孔孵育2 h,清洗后加入生物素化抗體工作液孵育1 h,清洗后加入10 μL酶結(jié)合物工作液孵育0.5 h,清洗后加入顯色液,孵育20 min,加入終止液,混勻后檢測450 nm處光密度(OD)值。

1.5.3 支氣管平滑肌厚度 根據(jù)文獻[6]測量支氣管平滑肌厚度。運用Image-Pro Plus 6.0軟件進行測量,實驗步驟嚴(yán)格按照說明書進行。以單位長度的平滑肌層面積(WAsm/Pi,μm2/μm)表示平滑肌層厚度。

1.5.4 蛋白免疫印跡法(Wb)檢測各組大鼠肺組織IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac蛋白表達(dá) 取各組大鼠肺組織,剪碎后研磨,裂解液裂解,離心后取上清,BCA法測定蛋白濃度。取20 μg總蛋白于SDS緩沖液中,煮5 min后,進行電泳,后轉(zhuǎn)入PVDF膜上,加入5%脫脂奶粉,封閉2 h,后加入IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac一抗(1∶200),孵育過夜,PBS清洗后,加入辣根過氧化物酶二抗(1∶1000),封閉2 h,后PBS清洗。采用增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測蛋白表達(dá)。運用凝膠成像系統(tǒng)對蛋白條帶進行分析。

1.5.5 HE染色觀察各組大鼠肺組織病理形態(tài) 取各組大鼠肺組織,多聚甲醛固定,脫水,包埋,切片,二甲苯脫蠟,乙醇脫水后烘干,蘇木精染色10 min,鹽酸(1%)處理,伊紅復(fù)染,乙醇脫水,封片后使用生物顯微鏡(×200)觀察肺組織病理形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺功能水平比較 與健康組比較,模型組、中藥組、抑制劑組、聯(lián)合組FVC、PEF、FEV1水平均降低(P<0.05);與模型組比較,中藥組、抑制劑組、聯(lián)合組FVC、PEF、FEV1水平均升高(P<0.05);聯(lián)合組FVC、PEF、FEV1水平均高于中藥組、抑制劑組(P<0.05)。中藥組與抑制劑組組間各項指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺功能水平比較

2.2 各組大鼠肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平比較 與健康組比較,模型組、中藥組、抑制劑組、聯(lián)合組肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平均升高(P<0.05);與模型組比較,中藥組、抑制劑組、聯(lián)合組肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平均降低(P<0.05);聯(lián)合組肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平均低于中藥組、抑制劑組(P<0.05)。中藥組與抑制劑組組間各項指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平比較

2.3 各組大鼠支氣管平滑肌厚度比較 與健康組比較,模型組、中藥組、抑制劑組、聯(lián)合組支氣管平滑肌厚度均增加(P<0.05);與模型組比較,中藥組、抑制劑組、聯(lián)合組支氣管平滑肌厚度均降低(P<0.05);聯(lián)合組支氣管平滑肌厚度低于中藥組、抑制劑組(P<0.05)。中藥組與抑制劑組組間支氣管平滑肌厚度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠支氣管平滑肌厚度比較

2.4 各組大鼠肺組織IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac蛋白表達(dá)比較 與健康組比較,模型組、中藥組、抑制劑組、聯(lián)合組肺組織IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac表達(dá)均升高(P<0.05);與模型組比較,中藥組、抑制劑組、聯(lián)合組肺組織IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac表達(dá)均降低(P<0.05);聯(lián)合組肺組織IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac表達(dá)均低于中藥組、抑制劑組(P<0.05)。中藥組與抑制劑組組間各項指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表4。

健康組 模型組 中藥組 抑制劑組 聯(lián)合組

表4 各組大鼠肺組織IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac蛋白表達(dá)比較

2.5 各組大鼠肺組織病理形態(tài) 健康組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整;模型組大鼠肺組織支氣管腔狹窄,肺泡壁斷裂,有大量炎性細(xì)胞浸潤;中藥組、抑制劑組肺泡的病理情況有較大改善,但仍有部分炎性細(xì)胞浸潤;聯(lián)合組僅存在肺泡壁比健康組稍薄的情況,支氣管腔、肺泡腔大小、內(nèi)部纖毛均恢復(fù)正常,炎性細(xì)胞浸潤較少。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織病理形態(tài)(HE,×200)

3 討論

氣道黏液高分泌狀態(tài)與炎癥因子聯(lián)系密切,IL-8/MUC5ac通路具有調(diào)控炎癥因子的作用,IL-8為該通路的上游因子,在疾病中,IL-8水平增加可刺激IKK2活化,活化的IKK2通過磷酸化IKBα激活NF-κB,進一步促進炎癥發(fā)展,導(dǎo)致氣道分泌MUC5ac增多,氣道黏液的分泌增加,加速炎性反應(yīng),出現(xiàn)級聯(lián)效應(yīng),最終形成COPD。另外,吸煙也是COPD產(chǎn)生的重要原因,吸煙會導(dǎo)致MUC5ac增多,氣道黏液分泌增加,造成氣道狹窄,肺功能降低。

近年來,中醫(yī)逐漸成為治療COPD的熱點。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,COPD的病因是“痰”和“瘀”,同時也是致病因素。肺氣虛,則痰濕內(nèi)生,從而閉阻氣道;肺主氣,病邪久留不除,則肺氣更加虛弱,進而導(dǎo)致氣虛、氣滯;氣滯則血瘀,痰瘀互結(jié),則肺臟虛衰[7]。此外,香煙煙霧的吸入也可損傷肺臟,這也是本病發(fā)病的一個重要誘發(fā)因素。香煙燃燒后的煙霧中會產(chǎn)生大量的有毒物質(zhì),結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的觀點[8],認(rèn)為香煙煙霧屬于傳統(tǒng)中醫(yī)理論中“毒”的范疇。煙毒長期薰蒸肺臟,煉液為痰,使肺葉焦痿、肺氣陰受損,出現(xiàn)咳嗽、咯痰、咯血等癥狀;煙塵等異物直接吸入,沉積于肺,耗損肺氣、傷及肺陰,阻礙氣機運行,久則瘀血內(nèi)阻。從總體上看,其病位在肺,涉及脾、心、腎三臟。該病主要病因為水停痰凝,氣虛氣滯,痰瘀互結(jié)。治療應(yīng)以益氣、活血、化痰為主。文中所用藥方以南沙參、黃芪、桔梗、紫菀、杏仁、甘草、百合為基本方,方中南沙參、黃芪補元固氣;桔梗、紫菀、杏仁溫肺下氣;甘草、百合益氣補中,養(yǎng)陰潤肺;法半夏行氣化痰;水蛭可破血逐瘀;茯苓健脾利水滲濕。

有研究表明,沙參、黃芪、茯苓等成分可有效抑制患者機體的炎性反應(yīng),降低IL-8、IL-17、TNF-α等炎癥因子水平,調(diào)節(jié)機體免疫功能[9];益氣活血化痰中藥可有效抑制IL-8、NF-κB p65等水平,進而抑制氣道炎癥并提升COPD患者肺功能及免疫功能[10]。此外,韓敏等[11]研究中發(fā)現(xiàn),PDTC可通過抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位降低細(xì)胞內(nèi)容物乳酸脫氫酶水平,提示PDTC可通過抑制NF-κB信號通路提升細(xì)胞存活比例,降低急性心肌梗死患者的心肌細(xì)胞凋亡程度,從而保護損傷的組織。Zhang Y等[12]研究發(fā)現(xiàn),通過給酮癥奶牛注射PDTC可有效降低其中性粒細(xì)胞中Toll樣受體的表達(dá)水平,并抑制IL-6、IL-1β和TNF-α等炎癥因子的合成與分泌,證實PDTC可有效抑制炎性反應(yīng)發(fā)生,有較好的抗炎效果。以上提示益氣、活血、化痰類方藥能不同程度抑制各類肺病中的NF-κB、IL-8、TNF-α等炎癥因子的釋放,對COPD患者也有類似的治療作用。本實驗中的益氣活血化痰方具有益氣活血、化痰止咳的作用。而PDTC能夠通過抑制NF-κB通路保護并修復(fù)損傷的肺組織,二者聯(lián)合對于抑制COPD患者炎癥效果更佳。本研究結(jié)果顯示,益氣活血化痰方可顯著抑制大鼠肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平,減少氣道黏液的分泌,改善肺組織病理變化,恢復(fù)肺功能;另外蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示,益氣活血化痰方還可抑制肺組織IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac蛋白表達(dá),從而抑制IL-8/MUC5ac的異?；罨?最終達(dá)到緩解和治療COPD的目的。

目前對于COPD的治療,主要從抑制氣道重塑方面入手。氣道重塑主要表現(xiàn)在氣管平滑肌細(xì)胞異常增加,造成氣管管腔狹窄,影響預(yù)后[13]。在COPD發(fā)病過程中,炎癥因子釋放增加,加重了氣道黏膜的炎癥狀態(tài),使得黏膜下的膠原沉積過多以及平滑肌細(xì)胞異常增加,氣道平滑肌細(xì)胞增殖,使氣道收縮強烈以及氣道壁增厚,從而使氣道狹窄,氣流阻塞,形成COPD[14]。在COPD發(fā)生時,IL-8/MUC5ac通路高度活化,高表達(dá)的IL-8會促進MUC5ac活化,促進炎癥發(fā)展,炎癥刺激導(dǎo)致氣管壁反復(fù)損傷,進而導(dǎo)致膠原增生、平滑肌增厚及瘢痕形成等,導(dǎo)致氣管重塑[15]。PDTC可有效降低肺組織中IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac蛋白表達(dá),進而抑制細(xì)胞外膠原增生,保護受損的氣管內(nèi)壁。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)益氣活血化痰方聯(lián)合PDTC治療后,大鼠支氣管平滑肌厚度顯著降低,這提示益氣活血化痰方加PDTC可有效改善COPD的氣道重塑,這可能是通過調(diào)控IL-8/MUC5ac通路活化,抑制炎性反應(yīng)完成的。

綜上所述,益氣活血化痰方干預(yù)COPD模型大鼠可通過抑制IL-8/MUC5ac通路活化,抑制炎癥反應(yīng),降低氣管平滑肌厚度,抑制氣道重塑,改善肺功能。