蘆筍試管苗莖段組培生根的關(guān)鍵技術(shù)初探

包艷存，李保華，牟 萌，牛曉雪，路 遠，李 霞

（濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘆筍研究所 山東濰坊 261071）

蘆筍（Asparagus officinalisL.）學(xué)名石刁柏，屬百合科天冬門屬多年生草本宿根性植物，被譽為“蔬菜之王”“世界十大名菜”之一[1-2]。蘆筍雌雄異株，親本繁殖比較困難，單靠無性分株法繁殖速度太慢。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，加快了蘆筍優(yōu)良單株的擴繁速度，新品種的選育進入了新的階段，蘆筍育種因此取得了較大成就[3-5]。但在蘆筍組織培養(yǎng)快繁中普遍存在著生根率低、移栽不易成活的難題，制約著蘆筍新品種的推廣與應(yīng)用[6-8]。蘆筍屬遺傳雜合型蔬菜，在組培快繁過程中不同蘆筍品種，甚至同一個品種的不同單株的培養(yǎng)基各個成分的配比濃度各不相同。Wilmar 等[9]最早通過單細胞培養(yǎng)對蘆筍的生長發(fā)育和器官發(fā)生進行了研究，由此培養(yǎng)出了完整的蘆筍植株。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對蘆筍莖尖分生組織培養(yǎng)、離體腋芽培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)等做了相關(guān)研究[10-13]，但是對蘆筍莖段生根培養(yǎng)的研究較少。筆者為了進一步提高蘆筍親本組培快繁及育種效率，對蘆筍莖段組培生根的關(guān)鍵技術(shù)進行了研究，以期通過莖尖、莖段同步生根，從而提高親本組培快繁效率，加快新品種選育進程。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來源于濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘆筍組培實驗室，分別為GF（荷蘭全雄，優(yōu)異雄株）、CM（魯蘆筍七號，優(yōu)異雌株）、FD（豐島一號，優(yōu)異雄株）、LC（荷蘭全雄，自交一代超雄株）。

1.2 方法

試驗于2021 年在濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘆筍組培實驗室進行。

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 在無菌培養(yǎng)室內(nèi)，生根培養(yǎng)基以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，瓊脂質(zhì)量濃度5 g·L-1，蔗糖質(zhì)量濃度35 g·L-1，pH 值5.8，添加不同濃度的NAA、KT、IBA、PP333、Ancymidol 等激素，培養(yǎng)溫度恒溫28 ℃，培養(yǎng)光線以自然光為主，輔以日光燈，光照度3000 lx 左右，光照時間14 h·d-1。

1.2.2 不同部位莖段對生根的影響 將4 份供試材料去除莖尖，切分成帶1～2 個腋芽的莖段，依據(jù)莖段所處的位置，分為莖尖下1～2 節(jié)、莖尖下3～4節(jié)、莖中段、莖基部4 個不同部位的材料，接種在課題組多年經(jīng)驗篩選的莖尖生根培養(yǎng)基（1/2MS+0.1 mg·L-1NAA + 0.5 mg·L-1IBA+0.05 mg·L-1KT+1.0 mg·L-1PP333）上，每個處理的莖段數(shù)為70 個，每瓶裝14 個，共5 瓶，3 次重復(fù)，具有5 條以上優(yōu)質(zhì)根的完整植株計為生根苗，培養(yǎng)28 d后統(tǒng)計生根率，生根率/%=生根株數(shù)/試驗株數(shù)×100。

1.2.3 不同莖段直徑大小對生根的影響 將4 份供試材料切取莖尖下1～4 節(jié)部位莖段，依據(jù)莖段的直徑大小（Φ）將材料分為1.0 mm≤Φ≤1.5 mm、1.5 mm＜Φ≤2.0 mm、2.0 mm＜Φ≤2.5 mm、Φ＞2.5 mm 4 個級別，接種在課題組多年經(jīng)驗篩選的莖尖生根培養(yǎng)基（1/2MS+ 0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA+0.05 mg·L-1KT+1.0 mg·L-1PP333）上，每個處理的莖段數(shù)為70 個，每瓶裝14 個，共5瓶，3 次重復(fù)，培養(yǎng)28 d 后統(tǒng)計其生根率（統(tǒng)計方法同1.2.2）。

1.2.4 不同激素濃度配比對生根的影響 在現(xiàn)有蘆筍莖尖生根培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，查閱相關(guān)文獻資料[14-17]，將NAA（質(zhì)量濃度分別為0、0.05、0.10 mg·L-1）、IBA（質(zhì)量濃度分別為0.50、1.00 mg·L-1）、KT（質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10 mg·L-1）、PP333（質(zhì)量濃度分別為1.00、1.50、2.00 mg·L-1）、Ancymidol（質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.15 mg·L-1）多種不同質(zhì)量濃度的激素隨機配比，組配成不同的生根培養(yǎng)基，切取適宜的莖段，接種在生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。每個處理的莖段數(shù)為60 個，每瓶接種12 個莖段，每個處理5 瓶，3 次重復(fù)。培養(yǎng)28 d 后統(tǒng)計其生根率（統(tǒng)計方法同1.2.2）。

1.2.5 莖段生根苗與莖尖生根苗過渡移栽比較試驗 馬秀蘭等[18]提出，蘆筍試管苗的根系分為3 種類型，第1 種類型的根粗細適宜，是直接從基部增生出來的，與莖部維管束相通，根系吸收的水分和養(yǎng)分可直接提供地上部，移栽成活率高；第2 種類型的根多是從愈傷組織增生出來的非正常的肥大貯藏根，與莖部的維管束脫離，輸導(dǎo)渠道不暢通，移栽成活率很低；第3 種類型的根也是從基部增生出來的，但根系較細弱，吸收能力差，移栽不易成活。將過渡培養(yǎng)21 d 的每個品種2 種試管苗各150 株，在大棚內(nèi)閉瓶煉苗3 d，再開瓶煉苗2 d，移栽至30%泥炭+30%土+30%椰糠+10%珍珠巖的基質(zhì)中，覆蓋保濕、保溫，保持晝夜溫差，1～7 d 空氣相對濕度100%，8～14 d 空氣相對濕度80%以上，15～21 d空氣相對濕度60%以上，以后逐漸降低濕度。試驗設(shè)3 次重復(fù)，每個重復(fù)50 株，60 d 后比較2 種蘆筍試管苗的成活率，成活率/%=成活株數(shù)/試驗株數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 20對試驗數(shù)據(jù)進行Duncan 法方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位莖段對生根的影響

將4 種不同部位莖段的試管苗接種在生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)14 d 左右（圖1-A），發(fā)現(xiàn)莖段明顯變粗、變長，原先鱗片包裹處分生出嫩莖，莖段基部也已膨大；有些莖尖下1～2 節(jié)、3～4 節(jié)莖段的基部開始露出白點。培養(yǎng)20 d 左右就陸續(xù)生出白色的肉質(zhì)根。培養(yǎng)28 d 左右有些組培苗已經(jīng)形成完整的植株（圖1-B）。

圖1 莖段接種培養(yǎng)14 d（A）及28 d（B）時的生長情況Fig.1 Growth of stems inoculated for 14 days（A）and 28 days（B）

對每個材料不同部位生根率進行統(tǒng)計分析（圖2），發(fā)現(xiàn)4 個材料莖尖下1～2 節(jié)、3～4 節(jié)與中段和基部的生根率存在明顯差異，而且均呈現(xiàn)出莖尖下1～2 節(jié)的生根率最高，3～4 節(jié)次之，基部生根率最低的現(xiàn)象?；可示陀?0%，其中CM 的基部生根苗符合統(tǒng)計條件的一共只有4 株。材料CM 和FD 莖尖下1～2 與3～4 節(jié)的生根率差異不顯著，材料GF 和LC 莖尖下1～2 節(jié)的生根率顯著高于莖尖下3～4 節(jié)。為此，在后續(xù)試驗中，將選擇莖尖下1～4 節(jié)莖段作為生根材料。

圖2 不同部位莖段的生根率比較Fig.2 Comparison of rooting rate of stem segments of different parts

2.2 不同直徑大小對莖段生根的影響

對每個材料不同直徑大小莖段的生根率進行統(tǒng)計分析（圖3），不同粗細的莖段之間生根率存在差異，GF、CM 和FD 的莖段直徑為1.5～2.5 mm 的生根率顯著高于1.0～1.5 mm 和2.5 mm 以上的生根率。只有LC 表現(xiàn)出莖段直徑為1.0～2.0 mm 時生根率顯著高于2.0 mm 以上的生根率，LC 屬于株型特別細類型的特異材料。此外，當(dāng)莖段直徑大于2.5 mm 時，4 份材料均出現(xiàn)部分生根苗的生根條數(shù)在5 條以上，但生出的根多在膨大基部的邊緣，與莖部維管束不相通，予以舍棄。

圖3 不同直徑大小的莖段生根率比較Fig.3 Comparison of rooting rate of stem segments of different diameter

2.3 不同激素配比對生根的影響

適宜的蘆筍莖段在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d，就開始陸續(xù)生根，28 d 調(diào)查統(tǒng)計，結(jié)果見表1 和圖4。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中添加PP333能促進試管苗莖段生根，當(dāng)添加質(zhì)量濃度為1.00～1.50 mg·L-1時，生根率較高，在31.67%～68.33%。CM、LC 和FD 材料在PP333的質(zhì)量濃度為1.50 mg·L-1時的生根率高于1.00 mg·L-1時的生根率；而GF 在PP333的質(zhì)量濃度為1.00 mg·L-1時生根率顯著高于1.50 mg·L-1時生根率，當(dāng)PP333添加質(zhì)量濃度為2.00 mg·L-1時，生根率顯著降低。

表1 不同激素配比對4 份材料生根率的影響Table 1 Effect of different hormone ratio on rooting rate for four materials %

圖4 不同質(zhì)量濃度的Ancymidol（A）和PP333（B）對生根率的影響Fig.4 Effect of Ancymidol（A）and PP333（B）of different mass concentrations on rooting rate

在生根培養(yǎng)基中添加Ancymidol（0.10～0.15 mg·L-1）較添加PP333（1.00～2.00 mg·L-1）的4 份材料莖段生根率都顯著提高。GF、LC 和FD 材料在Ancymidol 添加質(zhì)量濃度為0.10 mg·L-1時，生根率最高，其中FD 在N0.05I0.50K0.10A0.10培養(yǎng)基上的生根率能達到96.11%。CM 在Ancymidol 質(zhì)量濃度為0.15 mg·L-1時，生根率比0.10 mg·L-1時略高，均值達到了83.06%。4 份材料在Ancymidol 添加質(zhì)量濃度為0.10 mg·L-1和0.15 mg·L-1時生根率差異不顯著。綜合2 種激素的添加效果和試驗成本等因素，蘆筍試管苗莖段生根培養(yǎng)宜選擇添加0.1 mg·L-1的Ancymidol。

2.4 莖段生根苗和莖尖生根苗移栽成活率的比較

筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，在試管苗生根和過渡培養(yǎng)過程中，莖段生根試管苗與莖尖生根試管苗從外形上看，存在明顯差異，莖段生根試管苗的基部明顯比莖尖試管苗粗大，株型矮壯，生出的根也比莖尖試管苗粗且短（圖5）。

圖5 莖段生根苗與莖尖生根苗對比（A,B 的培養(yǎng)時間分別為14 d，28 d）Fig.5 Comparison of rooting seedlings between stem segment and stem tip（The culture time of A and B was 14 days and 28 days,respectively）

基于此現(xiàn)象，做了2 種試管苗的過渡移栽比較試驗，比較2 種試管苗的移栽成活率。結(jié)果表明（圖6），2 種試管苗移栽成活率沒有顯著差異，GF、CM 和FD 表現(xiàn)出莖段生根苗成活率稍低于莖尖生根苗，LC 的莖段生根苗比莖尖生根苗成活率高7.7%。以上結(jié)果證明莖段生根這種方式具有可操作實用性，完全可以和莖尖生根同步進行，這樣將大大提高蘆筍親本快繁率，降低工作強度。

圖6 2 種試管苗移栽成活率比較Fig.6 Comparison of survival rate of transplanting for two cuvette plantlet

3 討論與結(jié)論

Ancymidol 是一種重要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，它能夠通過抑制GA 合成的中間反應(yīng)，延緩植物生長[19-20]。Yang 等[10]采用蘆筍繼代試管苗的基部莖段作為生根材料，培養(yǎng)90 d，生根率為62%。Desjardins[21]用Ancymidol（0.50 mg·L-1）9 周后生根率達到90%。郭春慧等[16]在生根培養(yǎng)基中添加1.00 mg·L-1的PP333，蘆筍芽苗平均生根率達到了90%。筆者試驗的前期參照郭春慧等[16]的方法，以1/2 MS 添加1.00 mg·L-1PP333的培養(yǎng)基作為生根培養(yǎng)基做了不同莖段部位和莖段直徑大小試驗，平均生根率最高的僅為56%。后期通過不同激素配比試驗，4 份材料均表現(xiàn)為在生根培養(yǎng)基中添加0.10～0.15 mg·L-1的Ancymidol 莖段生根率顯著高于添加1.0～1.5 mg·L-1的PP333。當(dāng)Ancymidol 的質(zhì)量濃度為0.10 mg·L-1時，GF、LC、FD 3 份材料的平均生根率都達到了83%以上，最高達93%；當(dāng)Ancymidol 的質(zhì)量濃度為0.15 mg·L-1時，材料CM 的生根率也達到了83%以上。分析其原因，這可能與試驗所用材料的基因型不同或前期的繼代增殖激素配比不同等因素有關(guān)。

在不同直徑大小對莖段生根率影響和2 種試管苗移栽成活率比較試驗中，材料LC 都表現(xiàn)出了與其他3 個材料不一樣的特性。在直徑大小對莖段生根率影響的試驗中，LC 表現(xiàn)為直徑為1.0～2.0 mm 時生根率顯著高于2.0 mm 以上的；在試管苗移栽成活率比較試驗中，LC 表現(xiàn)為莖段生根成活率略高于莖尖生根成活率，這可能與LC 材料株形有關(guān)，下一步將開展蘆筍不同株型材料組培快繁比較試驗，研究株型與蘆筍快繁之間的關(guān)系。

雖然莖段生根試管苗較莖尖生根苗從外形上看存在顯著差異，但通過移栽成活率比較試驗，發(fā)現(xiàn)兩者成活率沒有顯著差異，GF、CM 和FD 莖段生根苗成活率稍低于莖尖生根苗，LC 卻是莖段生根苗比莖尖生根苗成活率高7.7%。在這4 個材料中，GF、CM 和FD 從株型粗細上來說，是屬于常規(guī)類型，只有LC 是屬于分枝多、株型細的類型。莖段生根試管苗成活率與株型粗細有無直接關(guān)系，還有待進一步驗證。

綜上所述，經(jīng)過4 代以上繼代培養(yǎng)的增殖蘆筍試管苗可以通過莖段生根培養(yǎng)獲得完整植株。取材部位、直徑大小和激素濃度是影響其生根的關(guān)鍵因素。對于常規(guī)蘆筍材料，選取直徑1.5～2.5 mm 莖段；對于一些莖條特別細的材料，選取直徑1.0～2.0 mm 莖段，取莖尖下1～4 節(jié)莖段，接種于添加1.00 mg·L-1Ancymidol 的生根培養(yǎng)基中，28 d 能生成具有5 條以上優(yōu)質(zhì)根的完整植株，移栽成活率高。