microRNA-124過(guò)表達(dá)對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)的影響

朱鍵?陳天天?劉智勇?鄭常龍

【摘要】 目的 研究過(guò)表達(dá)微RNA-124（miR-124）對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)的影響及初步探索其可能機(jī)制。方法 使用野百合堿（MCT）經(jīng)腹腔注射建立大鼠肺動(dòng)脈高壓模型，氣管內(nèi)滴注腺相關(guān)病毒（AAV） 介導(dǎo)的miR-124進(jìn)行干預(yù)，記錄大鼠心臟右室收縮壓（RVSP）、平均動(dòng)脈壓和心率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠肺組織中miR-124的表達(dá)，van Gieson染色觀察肺內(nèi)小動(dòng)脈的重構(gòu)程度并計(jì)算血管外徑在25～50 μm以及51～100 μm的肺小動(dòng)脈的中膜/外徑比值，蛋白免疫印跡法檢測(cè)肺組織中IL-6與 p-STAT3的蛋白水平。結(jié)果 miR-124在肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中呈低表達(dá)；過(guò)表達(dá)miR-124可導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓大鼠RVSP下降，肺內(nèi)小動(dòng)脈中膜/外徑明顯降低，肺組織中IL-6和p-STAT3的表達(dá)下調(diào)。結(jié)論 AAV介導(dǎo)的miR-124過(guò)表達(dá)可明顯減輕肺動(dòng)脈高壓的大鼠的RVSP以及肺血管重構(gòu)，其機(jī)制可能與下調(diào)IL-6和p-STAT3的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 微核糖核酸-124；肺血管重構(gòu)；肺動(dòng)脈高壓

Effect of overexpression of microRNA-124 on pulmonary vascular remodeling in rats with pulmonary arterial hypertension Zhu Jian△， Chen Tiantian， Liu Zhiyong， Zheng Changlong. △Department of Emergency， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Zheng Changlong， E-mail： zhchl5@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】 Objective To evaluate the effect of overexpression of microRNA-124 （miR-124） on pulmonary vascular remodeling， and to unravel the potential mechanism in rats with pulmonary arterial hypertension （PAH）. Methods In the monocrotaline （MCT）-induced PAH rat models， intratracheal infusion of miR-124 carried by adeno-associated virus （AAV） was performed. The right ventricular systolic blood pressure （RVSP）， mean systolic arterial pressure and heart rate were recorded. The expression level of miR-124 in lung tissues of rats was detected by real-time quantitative PCR. The histological morphology of pulmonary arterioles was observed by van Gieson staining. The ratios of medium to outside diameter of pulmonary arterioles with vessel diameters in 25-50 μm and 51-100 μm were calculated. The expression levels of IL-6 and p-STAT3 protein in lung tissues were detected by Western blot. Results The expression level of miR-124 was down-regulated in pulmonary tissues of rats with PAH. RVSP was significantly decreased， the ratios of medium to outside diameter of pulmonary arterioles were significantly attenuated， and the expression levels of IL-6 and p-STAT3 proteins were significantly down-regulated by overexpression of miR-124. Conclusion AAV-mediated overexpression of miR-124 can significantly reduce RVSP and pulmonary vascular remodeling in rats with PAH， probably by down-regulating the expression levels of IL-6 and p-STAT3.

【Key words】 MicroRNA-124； Pulmonary vascular remodeling； Pulmonary arterial hypertension

肺動(dòng)脈高壓（PAH）是一種由肺血管重構(gòu)引起的逐漸加重、病死率較高、預(yù)后較差的心血管疾?。?］。PAH的一個(gè)重要特征是肺微血管床進(jìn)行性減少、肺小動(dòng)脈重構(gòu)進(jìn)行性增加，導(dǎo)致肺的血管阻力也進(jìn)行性增加，氣血交換減少，缺氧進(jìn)行性加重，最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓明顯升高和右心衰竭，嚴(yán)重者可致死亡［2］。目前，臨床上針對(duì)肺血管張力增加的藥物，如磷酸二酯酶抑制劑和內(nèi)皮素受體拮抗劑，可以緩解部分PAH患者的臨床癥狀和改善血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，但其作用靶點(diǎn)并不能逆轉(zhuǎn)肺血管重塑，療效有限，無(wú)法有效降低PAH患者的病死率［3］。因此，抑制或逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)的治療策略可能是治療PAH的新方法。微RNA-124（miR-124）被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)細(xì)胞中大量表達(dá)、在神經(jīng)發(fā)育中具有重要作用［4］。既往研究結(jié)果表明，miR-124可抑制PAH患者的血管平滑肌細(xì)胞的增殖，并可降低肺血管成纖維細(xì)胞的增殖和遷移［5-6］。然而，通過(guò)腺相關(guān)病毒（AAV）介導(dǎo)miR-124持續(xù)過(guò)表達(dá)能否有效抑制外膜成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖，從而進(jìn)一步減輕肺血管重構(gòu)、治療PAH呢？miR-124在PAH中的作用及其作用機(jī)制如何亦尚不明確。因此，本研究擬用miR-124過(guò)表達(dá)的方法干預(yù)野百合堿（MCT）誘導(dǎo)的PAH大鼠模型，觀察其對(duì)PAH大鼠肺血管重構(gòu)的變化，并初步探索其可能的分子機(jī)制，為臨床治療PAH提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

Sprague Dawley（SD）雄性大鼠32只，無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)，體重180～200 g，購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，由該中心SPF級(jí)動(dòng)物房負(fù)責(zé)飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。本研究經(jīng)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：IACUC-DB-16-1113），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均按國(guó)家相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)和動(dòng)物使用指南進(jìn)行。

MCT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（p-STAT3）、STAT3及GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，IL-6抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。AAV-U6-ZsGreen購(gòu)自漢恒生物科技（上海）有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 實(shí)驗(yàn)分組與大鼠PAH模型的建立

32只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照（control）組、MCT+生理鹽水（MCT）組、MCT+

AAV-綠色熒光蛋白（MCT+AAV-GFP）組和MCT+

miR-124（MCT+AAV-miR-124）組，每組8只。MCT+

NS組、MCT+GFP組和MCT+miR-124組大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，采用自制氣管導(dǎo)管套管插管，分別抽取100 μL生理鹽水、AAV-GFP（滴度為2.0×1015 vg/L）和AAV-miR-124（滴度分別為1.4×1015 vg/L）通過(guò)微量注射器緩慢滴入氣管 （vg為病毒基因組）。1 d后，MCT+NS組、MCT+GFP組和MCT+miR-124經(jīng)腹腔注射MCT（60 mg/kg）制作大鼠PAH模型。

2. 大鼠血流動(dòng)力學(xué)和右心室肥厚指數(shù)的監(jiān)測(cè)

MCT給藥后35 d（實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)），經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠后，分離右側(cè)頸內(nèi)靜脈，置入PE-100聚乙烯導(dǎo)管，連接換能器測(cè)量右心室收縮壓（RVSP）以反映肺動(dòng)脈收縮壓。隨后分離出右側(cè)頸動(dòng)脈，置入PE-50聚乙烯導(dǎo)管測(cè)量平均收縮動(dòng)脈壓（mSAP）和心率（HR）。血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后處死大鼠，分離并取出大鼠心臟和肺，4 ℃磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，將左右心房剪去，分別分離出右心室（RV）、左心室及室間隔（LV+S）進(jìn)行稱重（本部分操作由不清楚實(shí)驗(yàn)分組的實(shí)驗(yàn)員完成以避免主觀性偏倚），計(jì)算右心室與左心室加上室間隔之和的比值即為右心室肥厚指數(shù)（RVHI），RVHI=RV/（LV+S）。

3. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)肺組織中miR-124的表達(dá)

將約100 mg大鼠右肺組織剪碎加入1 mL含RNA降解酶的TRIzol液中，研磨裂解，隨后加入氯仿提取肺組織總RNA，經(jīng)純化后用紫外分光光度法測(cè)定RNA濃度及純度。使用RT-qPCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表1，擴(kuò)增條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 32 s，40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增完成后，采用按2-ΔΔCt相對(duì)定量計(jì)算miR-124及內(nèi)參U6 RNA的表達(dá)。

4. 肺動(dòng)脈組織van Gieson染色

左肺組織經(jīng)4%多聚甲醛-PBS液中固定，石蠟切片后行van Gieson染色，由2名研究人員在光鏡下觀察肺組織病理變化。在高倍鏡（400倍）下觀察肺血管形態(tài)，對(duì)外徑在25～100 μm的肺小動(dòng)脈進(jìn)行拍照（為避免偏倚，拍照者對(duì)實(shí)驗(yàn)分組情況不知情）。使用圖片處理軟件測(cè)量肺內(nèi)小動(dòng)脈的中膜以及血管外徑的長(zhǎng)度，計(jì)算二者的比值即為中膜/外徑比值。每張切片隨機(jī)選取10～15個(gè)肺小動(dòng)脈，分別選取血管外徑在25～50 μm、51～100 μm

肺內(nèi)小動(dòng)脈，對(duì)其中膜/外徑比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以了解不同大小的肺內(nèi)小動(dòng)脈重構(gòu)嚴(yán)重程度。

5. 蛋白免疫印跡法檢測(cè)

取約50 mg大鼠右肺組織，剪碎后加入組織蛋白裂解液裂解，置于冰上反復(fù)充分研磨，離心后取上清液，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)濃度。按試劑盒說(shuō)明書步驟操作，分別加入抗IL-6、GAPDH、STAT3及p-STAT3抗體（均為1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入山羊抗兔IgG（1∶2 000）孵育，TBST溶液再次洗膜后用ECL發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光顯影。凝膠成像系統(tǒng)拍照后，使用Image J軟件對(duì)各條帶進(jìn)行測(cè)量和分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 23.0分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，以表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法。P <

0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、miR-124在4組大鼠肺組織中的表達(dá)

4組大鼠肺組織中miR-124表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 192.843，P < 0.05）。相比于control組，miR-124在MCT+ NS組和MCT+GFP組大鼠的肺組織中表達(dá)減少（P均< 0.05）；相比于MCT+GFP組，miR-124在MCT+miR-124組大鼠的肺組織中表達(dá)增加（P < 0.05）。見(jiàn)圖1。

二、miR-124過(guò)表達(dá)對(duì)PAH大鼠RVSP和RVHI的影響

MCT注射5周后達(dá)到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，control組大鼠均存活，MCT+NS組、MCT+AAV-GFP組和MCT+AAV-miR-124組分別有2、2、1只大鼠死亡，死亡原因考慮為右心衰竭。各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)及RVHI結(jié)果提示，MCT+NS組大鼠的RVSP高于control組［（71.9±9.9） vs. （23.2±1.9） mmHg，P < 0.01）；MCT+miR-124組RVSP低于MCT+GFP組［（49.3±7.7） vs. （75.1±17.9） mmHg，P < 0.01）］（圖2A）。MCT+NS組大鼠右心肥厚指數(shù)（RVHI）高于control組（0.60±0.10 vs. 0.24±0.02，P < 0.01），

MCT+miR-124組RVHI低于MCT+GFP組（0.45±

0.08 vs. 0.59±0.08，P < 0.01）（圖2B）。4組大鼠的平均動(dòng)脈壓和心率的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為2.371、0.837，P均> 0.05）（圖2C、D）。

三、miR-124過(guò)表達(dá)對(duì)PAH大鼠肺血管重構(gòu)的影響

肺組織切片行van Gieson染色結(jié)果提示，control組大鼠肺內(nèi)血管外徑在25～50 μm（圖3A）和51～100 μm（圖3C）的小肺動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)清楚，厚度正常，中膜未見(jiàn)明顯增厚，MCT+NS組和MCT+AAV-GFP組肺小動(dòng)脈中膜明顯增厚、管腔變窄，提示MCT+NS組和MCT+AAV-GFP組大鼠肺內(nèi)小動(dòng)脈發(fā)生肺血管重構(gòu)，而MCT+miR-124組大鼠肺動(dòng)脈中膜肥厚程度明顯減輕。

血管外徑在25～50 μm （圖3B）和51～100 μm（圖3D）的肺內(nèi)小動(dòng)脈中膜/外徑比值統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示：MCT+NS組和MCT+GFP組肺內(nèi)小動(dòng)脈中膜/外徑比值高于control組，而MCT+miR-124肺內(nèi)小動(dòng)脈中膜/外徑比值低于MCT+GFP組。4組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為33.170和49.680，P均< 0.05）。

四、miR-124過(guò)表達(dá)對(duì)PAH大鼠肺組織中IL-6和p-STAT3表達(dá)的影響

蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果提示，MCT+NS組和MCT+AAV-GFP組大鼠肺組織中IL-6和p-STAT3蛋白的相對(duì)表達(dá)量高于control組（P < 0.05）；MCT+AAV-miR-124組IL-6和p-STAT3蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于MCT+NS組和MCT+AAV-GFP組（P <

0.05），IL-6和p-STAT3蛋白在4組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為21.94和31.88，P均< 0.05）。見(jiàn)圖4。

討 論

本研究顯示，MCT經(jīng)腹腔注射后可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的PAH和肺血管重構(gòu)，而采用AAV作為載體介導(dǎo)miR-124過(guò)表達(dá)可降低MCT誘導(dǎo)的大鼠右心室收縮壓和肺血管重構(gòu)程度。模型組IL-6和p-STAT3的表達(dá)與正常對(duì)照組相比明顯上調(diào)，而miR-124的過(guò)表達(dá)可下調(diào)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織中IL-6和p-STAT3的表達(dá)，提示AAV介導(dǎo)的miR-124過(guò)表達(dá)降低PAH的機(jī)制可能與其下調(diào)IL-6和p-STAT3的表達(dá)有關(guān)。

miRNA是一類長(zhǎng)度18～23 nt的非編碼單鏈小分子RNA，參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等多種病理生理過(guò)程［7］。miRNA在呼吸系統(tǒng)可通過(guò)不同的信號(hào)通路和靶點(diǎn)影響氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移、上皮細(xì)胞的增殖和黏附、成纖維細(xì)胞增生、氣道血管生成、杯狀細(xì)胞的分泌和氣道炎癥的發(fā)生，從而影響氣道重構(gòu)［8］。miR-124是在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)最豐富的微RNA。但近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)miR-124在PAH中起著非常重要的作用［9］。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)：不管是在PAH患者還是PAH動(dòng)物模型中，肺動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞和肺血管平滑肌細(xì)胞的miR-124表達(dá)均下調(diào)，而過(guò)表達(dá)miR-124能減輕肺血管成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移［10］。本研究提示，AAV介導(dǎo)的miR-124的過(guò)表達(dá)降低了MCT誘導(dǎo)的PAH，減輕了肺內(nèi)小動(dòng)脈血管中膜/外徑比，即改善了肺血管重構(gòu)，其機(jī)制可能與miR-124的過(guò)表達(dá)抑制了肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的異常增殖和遷移有關(guān)，其具體機(jī)制仍需更多研究明確。

STAT3是一種參與多種生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄因子，其能將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，將靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活、凋亡和炎癥［11］。多項(xiàng)研究表明，促炎細(xì)胞因子IL-6在PAH的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［12-13］。IL-6和受體結(jié)合后，可以使STAT3的酪氨酸705位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，p-STAT3可促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖并減少其凋亡［14］。Wang等［15］的研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-124可以通過(guò)靶向調(diào)節(jié)STAT3降低促炎細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在口腔扁平苔蘚間充質(zhì)干細(xì)胞中，miR-124-3p類似物過(guò)表達(dá)可降低IL-6和STAT3的表達(dá)，而miR-124-3p的低表達(dá)則會(huì)產(chǎn)生相反的結(jié)果［16］。本研究中，與control組相比，加入MCT的肺組織中p-STAT3和IL-6的表達(dá)增加。與MCT+GFP組相比，MCT+miR-124組IL-6和p-STAT3蛋白的表達(dá)均下調(diào)。這提示miR-124過(guò)表達(dá)改善MCT誘導(dǎo)的PAH的作用機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)IL-6/STAT3信號(hào)通路分子的表達(dá)有關(guān)，未來(lái)仍需要更多的研究予以明確。

綜上所述，AAV介導(dǎo)的miR-124過(guò)表達(dá)可減輕野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓和肺血管重構(gòu)，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控IL-6/STAT3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。本研究有望為肺動(dòng)脈高壓和肺血管重構(gòu)的基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2023-03-01）

（本文編輯：林燕薇）