南藥高良姜的分子生藥學(xué)研究進(jìn)展

潘 峰，唐曉敏，潘利明，楊 全，張春榮

（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院/國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點研究室/國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣州綜合試驗站/廣東省南藥規(guī)范化種植與綜合開發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510006）

高良姜（Alpinia officinarumHance）為姜科山姜屬多年生草本植物，其根狀莖是亞歐國家常用的藥材和香辛料，具有溫胃止嘔、散寒止痛的功效，常用于治療脘腹冷痛、胃寒嘔吐、噯氣吞酸等癥[1]。高良姜藥材及其所含的揮發(fā)油、黃酮類、二芳基庚烷類等化學(xué)成分具有鎮(zhèn)痛止嘔、抗炎、抗?jié)?、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、抗消化道出血、抗骨質(zhì)疏松和降脂等藥理活性[2-3]。除了藥用，高良姜也可用于保健食品、香料、果蔬肉類防腐劑、糧面驅(qū)蟲劑、日用化學(xué)品添加劑等，極具開發(fā)價值。

高良姜分布于我國廣東雷州半島、海南和廣西南部等熱帶地區(qū)。進(jìn)入21世紀(jì)以來，高良姜野生資源已瀕臨滅絕，市售商品均來自栽培資源[4,5]。高良姜種植采用根狀莖營養(yǎng)繁殖，種源混雜，如無新品種選育推廣，容易出現(xiàn)種源退化、藥材質(zhì)量降低等問題。分子生藥學(xué)是在分子水平上研究生藥的分類與鑒定、栽培與保護(hù)及有效成分生產(chǎn)的科學(xué)，由中國中醫(yī)科學(xué)院黃璐琦院士于1995 年提出[6]。當(dāng)前，分子生藥學(xué)研究進(jìn)入了快速發(fā)展期，在中藥理論創(chuàng)新、質(zhì)量控制、新品種選育等領(lǐng)域取得了很大進(jìn)展[7]。分子生藥學(xué)是解決高良姜資源鑒定、品種選育、栽培管理、藥效成分生產(chǎn)的關(guān)鍵鑰匙。因此，亟需應(yīng)用高良姜系統(tǒng)進(jìn)化、遺傳多樣性、分子鑒定和功能基因組學(xué)等研究成果，采用生物技術(shù)育種、分子標(biāo)記輔助育種等途徑培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的高良姜新品種，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)高良姜有效成分，促進(jìn)高良姜資源研究與開發(fā)。

1 高良姜的系統(tǒng)進(jìn)化與遺傳多樣性

1.1 系統(tǒng)進(jìn)化

高良姜為姜科姜族山姜屬良姜亞屬植物。袁琳等應(yīng)用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism,SRAP）分子標(biāo)記技術(shù)對采自海南的11種姜科植物進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)高良姜與同屬的紅豆蔻（Alpinia galanga）和光葉山姜（Alpinia intermedia）的遺傳關(guān)系較近，但與益智（Alpinia oxyphylla）、草豆蔻（Alpinia katsumadai）、海南山姜（Alpinia hainanensis）位于不同的分支上[8]。黃瓊林研究基于葉綠體基因組序列的高良姜與17 種單子葉植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)高良姜首先與艷山姜（Alpinia zerumbet）聚集，再與益智聚集，然后與姜科其他屬的植物聚集成姜科分支[9]。Yang 等分析基于19 種姜科植物共有77個葉綠體基因序列的系統(tǒng)發(fā)育，結(jié)果表明山姜屬的物種分布在兩個主要分支中：紅豆蔻和黑果山姜（Alpinia nigra）組成第一個分支，高良姜與其他山姜屬植物組成第二個分支，其中高良姜與益智構(gòu)成姊妹種[10]。Yang 等構(gòu)建基于高良姜、紅豆蔻、黑果山姜、益智4 種山姜屬植物在被子植物mega 353 基因庫中組裝的4 個共有基因（AT4G04780、AT3G53760、AT5G53800、AT1G06240）系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明紅豆蔻是黑果山姜姊妹種，高良姜是益智姊妹種，與基于葉綠體基因標(biāo)記推斷的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果一致[10]。

按照傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類觀點，上述山姜屬植物中，高良姜和益智均為良姜亞屬植物，而艷山姜、海南山姜為艷山姜亞屬植物，紅豆蔻與光葉山姜、花葉山姜為山姜亞屬植物，黑果山姜為黑果山姜亞屬植物。袁琳等研究結(jié)果中高良姜與同為良姜亞屬的益智遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，而與山姜亞屬的紅豆蔻、光葉山姜遺傳關(guān)系較近，表明依靠單一引物對的SRAP 分子標(biāo)記進(jìn)行種間遺傳多樣性分析的結(jié)果與傳統(tǒng)分類觀點存在差異[8]。黃瓊林研究結(jié)果中高良姜先與艷山姜聚集，再與益智聚集[9]。Yang 等研究結(jié)果中高良姜的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與傳統(tǒng)分類觀點一致，但紅豆蔻與黑果山姜聚集，而未與華山姜、花葉山姜聚集[10]。由此可見，基于葉綠體基因組全長序列或特定序列進(jìn)行系統(tǒng)分類在科、屬等級上與傳統(tǒng)的分類觀點通常一致，但在亞屬等級上還需要結(jié)合其他基因序列和分類學(xué)依據(jù)。

1.2 遺傳多樣性

遺傳多樣性是同一群體中不同個體或同一物種內(nèi)不同群體遺傳變異的總和，物種遺傳多樣性越高，對環(huán)境變化適應(yīng)能力就越強(qiáng)。DNA 分子標(biāo)記是揭示物種遺傳多樣性的主要方法之一，許多學(xué)者應(yīng)用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)、簡單重復(fù)序列區(qū)間標(biāo)記(inter-simple sequence repeat，ISSR)等分子標(biāo)記技術(shù)研究了高良姜的遺傳多樣性。

1.2.1 AFLP分子標(biāo)記

龐啟華等對13 個高良姜居群進(jìn)行AFLP 分子標(biāo)記研究，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自徐聞縣的高良姜居群內(nèi)的DNA 多態(tài)性比其他地方的低，可能與徐聞縣悠久的高良姜無性繁殖種植歷史有關(guān)[11]。楊全等對8 個種源地的高良姜資源進(jìn)行AFLP 分子標(biāo)記，得到了1044 個多態(tài)性位點，占比達(dá)92.57%，揭示了高良姜種質(zhì)間存在較高多態(tài)性，遺傳多樣性豐富[12]。

1.2.2 SSR分子標(biāo)記

黃瓊林從基于二代測序的高良姜轉(zhuǎn)錄組序列中鑒定到13346 個SSR 位點，隨機(jī)挑選10 對SSR 引物對高良姜基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，有8 對引物可擴(kuò)增出與預(yù)期相符的產(chǎn)物，有1 對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在不同居群高良姜樣品中呈現(xiàn)多態(tài)性[13]。趙全杰等基于三代測序的高良姜全長轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計了100 對SSR 引物，對7 種高良姜栽培類型進(jìn)行EST-SSR 分析，有21 對引物的擴(kuò)增條帶清晰且穩(wěn)定，由此構(gòu)建了高良姜栽培類型的EST-SSR數(shù)字指紋圖譜及鑒別方法[14]。

1.2.3 ISSR分子標(biāo)記

潘坤等采用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對來自海南8 個居群的96份高良姜樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)?？诘? 個居群聚為一類，瓊山、澄邁、興隆、儋州、臨高等6 個居群聚為第二類，說明這些產(chǎn)地的高良姜種源較一致，存在引種遷移和混合栽培現(xiàn)象[15]。由于種源單一且長期依靠無性繁殖造成海南高良姜在居群水平和物種水平的遺傳多樣性均不豐富。

2 高良姜的分子鑒別與功能基因組學(xué)

2.1 分子鑒別

許多姜科植物的器官形態(tài)相似，藥材性狀相近，混淆品較為常見?；贒NA 序列的分子鑒定技術(shù)是鑒別性狀相似藥材的常用方法。許多學(xué)者對高良姜及其混淆品的核基因組中的核糖體DNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）和葉綠體基因組中的成熟酶基因（maturase，matK）、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶大亞基編碼基因（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/ oxygenase large subunit，rbcL）、細(xì)胞色素b6-f 復(fù)合體亞單位VIII-光系統(tǒng)II 蛋白M 基因間隔區(qū)（cytochrome b6-f complex subunit VIII-photosystem II protein M intergenic spacer，petN-psbM）、psaJ 和核糖體蛋白L33 基因（ribosomal protein L33）間隔區(qū)（psaJ-rpl33）序列差異進(jìn)行了分析，尋找鑒別高良姜及其混淆品的DNA條形碼標(biāo)記。

2.1.1 ITS序列

龐啟華等對高良姜、華山姜、山姜（Alpinia japonica）和大高良姜（紅豆蔻）的ITS 序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地野生和栽培高良姜的ITS 序列高度一致，同源性極高，不能用于鑒別高良姜的產(chǎn)地和品種，但高良姜與三種混淆品的ITS 序列有11 個位點存在明顯差異，可作為鑒別高良姜真?zhèn)蔚姆肿訕?biāo)記[16]。牛憲立也比較了不同來源的高良姜與大高良姜的ITS序列，二者存在32個變異位點，可作為鑒別高良姜和大高良姜的分子標(biāo)記[17]。羅焜等比較了高良姜等16種山姜屬植物的37 個樣本的ITS2 序列，發(fā)現(xiàn)ITS2 不能用來鑒別高良姜種內(nèi)差異，但可用于鑒別高良姜和其他山姜屬植物[18]，與龐啟華等[16]的結(jié)論一致。

2.1.2matK基因

黃瓊林等比較了高良姜等11 種山姜屬植物的24條matK 基因序列，發(fā)現(xiàn)了41 處變異位點，其中，85 bp 處的A-G 變異位點可以鑒別高良姜與除水山姜(Alpinia aquatica)外的其他物種，336 bp處的G-A 變異位點可以區(qū)別高良姜與除紅豆蔻外的其他物種；基于matK序列進(jìn)行聚類分析可將高良姜與其他山姜屬植物明顯區(qū)分開來[19]。龐啟華等發(fā)現(xiàn)高良姜matK序列的種內(nèi)變異很小，不能用來鑒別高良姜產(chǎn)地，但有18 個matK差異位點可以區(qū)別高良姜與大高良姜[20]。

2.1.3rbcL基因

黃瓊林等比較了高良姜與其偽品大高良姜的rbcL基因序列，發(fā)現(xiàn)了3 處堿基差異，基于rbcL 基因的聚類樹能較好地區(qū)分高良姜和大高良姜[21]。

2.1.4petN-psbM和psaJ-rpl33序列

Yang 等利用葉綠體基因組的2 個高變基因間隔區(qū)petN-psbM 和psaJ-rpl33 分別開發(fā)了2 個DNA 標(biāo)記Alpp和Alpr，用于鑒別高良姜、紅豆蔻、黑果山姜、益智、海南山姜5 種山姜屬植物。Alpp 標(biāo)記不能將高良姜和益智區(qū)分開來，但可將高良姜與其他山姜屬植物區(qū)分出來，而Alpr 標(biāo)記可將高良姜與其他4 種山姜屬植物區(qū)分開來[10]。

2.2 功能基因組學(xué)

基因組學(xué)包括以全基因組測序為目標(biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和以基因功能鑒定為目標(biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)，是解析藥用動植物分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育、次級代謝途徑、生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制、藥材道地性機(jī)制等關(guān)鍵科學(xué)問題的主要方法。

2.2.1 功能基因表達(dá)模式

揮發(fā)油成分是高良姜作為香辛料的重要質(zhì)量指標(biāo)和藥效成分，單萜和倍半萜是高良姜揮發(fā)油的主要成分。張春榮等從高良姜根莖中克隆了萜類生物合成關(guān)鍵酶1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductase，DXR）的全長cDNA（AoDXR）；AoDXR在高良姜葉片中的表達(dá)量最強(qiáng)，其次是根，在根莖中的表達(dá)量較低，反應(yīng)了AoDXR催化終產(chǎn)物的多樣性和表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性；外源茉莉酸甲酯處理提高了高良姜根莖AoDXR的轉(zhuǎn)錄水平和單萜成分1,8-桉油精的含量，對提高藥材品質(zhì)有應(yīng)用價值[22]。黃瓊林等從高良姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中得到了2 個倍半萜合成酶（sesquiterpene synthase，SES）基因（AoSES3 和AoSES6），二者在高良姜葉片、莖和根莖中均有表達(dá)，AoSES3 在葉片中的表達(dá)量最高，而AoSES6 則在根莖中的表達(dá)量最高，兩者在莖中的表達(dá)量均為最低[23]。

黃酮類化合物也是高良姜重要的藥效成分。苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）是黃酮類化合物生物合成上游途徑的關(guān)鍵限速酶。黃瓊林從高良姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘到一個AoPALcDNA 序列，在高良姜根莖中的表達(dá)量最強(qiáng)，遠(yuǎn)高于莖和葉中的表達(dá)量，與根莖中藥效成分含量較高并以根莖部位入藥相一致[24]。查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是植物黃酮類化合物生物合成途徑的第一步關(guān)鍵限速酶。黃瓊林從高良姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘到一個AoCHScDNA 序列，在根莖中的表達(dá)量最高，其次為莖，最低的是葉片，提示根莖中黃酮類化合物的生物合成較為活躍[25]。

2.2.2 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)

葉綠體基因組結(jié)構(gòu)明確，序列相對保守，在物種形成和進(jìn)化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可用于物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究。黃瓊林[9]和Yang 等[10]基于第二代測序技術(shù)獲得了高良姜葉綠體基因組序列。黃瓊林獲得的高良姜葉綠體基因組全長為162137 bp，編碼基因有132 個，包括86 個蛋白質(zhì)編碼基因，38 個tRNA 基因，8 個rRNA 基因[9]。Yang 等獲得的高良姜葉綠體基因組長度為162140 bp，編碼基因有111 個，包括79個蛋白質(zhì)編碼基因，28 個tRNA 基因，4 個rRNA 基因[10]。Yang 等在高良姜葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)了296 個SSR、49 個散在的長重復(fù)序列（序列長度≥30 bp 的重復(fù)）和28個串聯(lián)重復(fù)序列，可用于高良姜分子標(biāo)記的開發(fā)[10]。

2.2.3 轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)

黃瓊林基于第二代測序技術(shù)對高良姜根莖、莖、葉片等組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和分析，從高良姜不同組織中共獲得147652 條unigenes，53.19%的基因獲得功能注釋，有589 個unigenes 參與萜類、黃酮類和苯丙素類等次級代謝產(chǎn)物的生物合成[26]?；虮磉_(dá)模式分析表明[27]，差異表達(dá)基因主要集中在葉與根莖、莖之間，而根莖與莖之間的差異表達(dá)基因較少；挖掘到9個參與萜類生物合成的關(guān)鍵酶基因，這9個基因在根莖中的表達(dá)量顯著高于葉片，與萜類揮發(fā)油在根莖中的含量高于葉片相一致。

3 小結(jié)

雖然在高良姜系統(tǒng)進(jìn)化、遺傳多樣性、分子鑒定和功能基因組學(xué)等領(lǐng)域取得了一定的進(jìn)展，但目前高良姜分子生藥學(xué)研究尚處于初步階段，仍存在許多不足之處：1）揭示了高良姜與其他山姜屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，但尚存在與傳統(tǒng)形態(tài)分類觀點不一致的地方，還需要挖掘其他分子標(biāo)記和分類學(xué)方法深入探究姜科植物的系統(tǒng)演化關(guān)系。2）發(fā)現(xiàn)了不同地區(qū)分布或栽培的居群間高良姜遺傳多樣性較為豐富，而同一地域栽培的局群內(nèi)高良姜因無性繁殖和種苗的地域內(nèi)傳播導(dǎo)致遺傳多樣性低；高良姜野生資源瀕臨枯竭，用于遺傳多樣性研究的野生樣本較少，也缺乏不同高良姜栽培品系間的遺傳多樣性研究，阻礙了高良姜品種選育進(jìn)程。3）開發(fā)了基于ITS、petN-psbM、psaJrpl33、matK、rbcL 等序列鑒別高良姜及其山姜屬混淆品的方法，但尚未開發(fā)高良姜特異性PCR 鑒別引物和通用的DNA 條形碼序列，尚未建立高效快速的高良姜分子鑒別方法。4）解析了基于二代測序的高良姜葉綠體基因組和營養(yǎng)器官轉(zhuǎn)錄組的結(jié)構(gòu)，挖掘到高良姜萜類、黃酮類等活性成分生物合成相關(guān)的部分功能基因，并對部分關(guān)鍵酶基因的序列特征和表達(dá)模式進(jìn)行初步分析；尚未發(fā)表基于三代測序的全長基因組和轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)，挖掘到的與高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)表型相關(guān)的功能基因較少，特別是與藥效成分生物合成相關(guān)的功能基因缺乏功能驗證，限制了高良姜在分子育種和合成生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。

因此，當(dāng)前亟需利用多組學(xué)技術(shù)加快高良姜結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的研究步伐，完成優(yōu)質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)基因的功能驗證和染色體定位，從而為高良姜的分子標(biāo)記輔助育種、藥材生產(chǎn)的環(huán)境調(diào)控、藥效成分的合成生物學(xué)生產(chǎn)等實踐活動奠定基礎(chǔ)。