壇紫菜洞頭傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系和新品系遺傳多樣性分析

吳曉雯 王鐵桿 劉穎 張鵬

摘?要：為探究壇紫菜（Neoporphyra haitanensis）溫州洞頭傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系與兩個(gè)新品系（SW-81，HR-5）的遺傳差異，利用CO I和rbcL基因片段對(duì)這3個(gè)品系共60株個(gè)體進(jìn)行了遺傳多樣性分析研究。經(jīng)過(guò)比對(duì)分析，得到398 bp的CO I基因序列和488 bp的rbcL基因序列等長(zhǎng)同源序列，聯(lián)合分析長(zhǎng)度為886 bp，所有獲得的序列中T、C、A、G 4種堿基的相對(duì)含量分別為35.100%、14.220%、34.320%和16.360%；變異位點(diǎn)共6個(gè)，其中單變異位點(diǎn)5個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)1個(gè)；3個(gè)品系的核苷酸多樣性為0.000 30±0.001，單倍型多樣性為0.249±0.074；60株個(gè)體定義了6個(gè)單倍型（Hap1～Hap6），其中Hap3是核心單倍型，占全部個(gè)體的88.600%；單倍型構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，各品系存在基因交流，尚未發(fā)生遺傳分化。研究結(jié)果表明，壇紫菜新品系的遺傳多樣性較低，因此應(yīng)加大種質(zhì)保護(hù)和選育范圍，防止種質(zhì)退化。建議在壇紫菜育苗生產(chǎn)過(guò)程中采用多個(gè)品系聯(lián)合應(yīng)用，以適應(yīng)多變的海洋環(huán)境。

關(guān)鍵詞：壇紫菜；新品系；CO I基因；rbcL基因；遺傳多樣性

壇紫菜（Neoporphyra haitanensis）隸屬于紅藻門(mén)（Rhodophyta）、紅藻綱（Rhodophyceae）、紅毛菜科（Bangiaceae）、紫菜屬（Neoporphyra）［1］，其味美價(jià)廉，富含多種人體必需氨基酸、維生素和微量元素，是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)藻類，在浙江、福建等地大規(guī)模養(yǎng)殖。根據(jù)《2021中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》［2］，浙江省壇紫菜養(yǎng)殖面積已達(dá)1.5萬(wàn)hm2，鮮紫菜產(chǎn)量在7.5萬(wàn)t以上。壇紫菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對(duì)浙江省水產(chǎn)品發(fā)展、近海岸環(huán)境改善和東海漁場(chǎng)振興有著積極的作用。

在育種技術(shù)的不斷進(jìn)步與選育工作的逐步推進(jìn)下，壇紫菜育種工作已卓有成效。SW-81是經(jīng)過(guò)紫外人工誘變的野生型突變壇紫菜新品種，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)好、耐高溫且殼孢子放散量大等優(yōu)點(diǎn)。HR-5是紅色雜交品系，具有葉狀體薄、生長(zhǎng)快等優(yōu)良特性。劉穎等［3］通過(guò)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)浙江省臺(tái)州市玉環(huán)市箬笠礁海域中的壇紫菜養(yǎng)殖品系與新品系“浙南3號(hào)”進(jìn)行了比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同品系間存在一定的基因交流。測(cè)序技術(shù)的流行和成熟使提供更為準(zhǔn)確的核苷酸序列結(jié)果成為可能，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS-5.8S rDNA和RUBISCO技術(shù)［4-6］均在藻類研究中有了應(yīng)用。線粒體和葉綠體分子標(biāo)記技術(shù)等也得到了應(yīng)用。線粒體的細(xì)胞色素氧化酶亞基I基因（CO I基因）變異較大，是研究種群遺傳變異較好的標(biāo)記；光合作用第一關(guān)鍵酶——核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（rubisco）的大亞基由葉綠體基因組編碼，簡(jiǎn)稱rbcL基因。CO I基因和rbcL基因經(jīng)常被作為分子條形碼標(biāo)記，用于評(píng)估遺傳多樣性，揭示隱藏物種的多樣性或揭示藻類的種群結(jié)構(gòu)［7-8］。

本研究采用CO I和rbcL基因?qū)喜藴刂荻搭^地區(qū)傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系和兩個(gè)新品系的遺傳多樣性進(jìn)行分析，旨在了解目前該地區(qū)壇紫菜傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系與兩個(gè)新品系的遺傳多樣性差異，并評(píng)估壇紫菜新品系的遺傳背景，為選育更優(yōu)的新品系和育苗生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1?材料和方法

1.1?試驗(yàn)材料

于2020年分別采集溫州洞頭壇紫菜傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系、新品系SW-81和HR-5的新鮮葉狀體17、18、25株，洗凈晾干后，密封保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?壇紫菜DNA提取

用雙蒸水再次沖洗試驗(yàn)用壇紫菜葉狀體后，用吸水紙吸干，按照操作說(shuō)明用DN 14-植物基因組DNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司，DN 1401）提取總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，再利用微量分光光度計(jì)（Nano-400）測(cè)定DNA的質(zhì)量濃度，于-20 ℃分管保存。

1.2.2?PCR擴(kuò)增和測(cè)序

本試驗(yàn)引物序列參考NCBI相關(guān)序列：CO I-F：GATGCTGTACCCGGTAGAT，CO I-R：GTTGTAATTGTTTAGCTGTTTTT，rbcL-F：GACTCCAACAGCAAACATCTAG，rbcL-R：TTAATAYCTAGCTCCTTCAGGC。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

本試驗(yàn)PCR擴(kuò)增反應(yīng)選用25 μL反應(yīng)體系，包括：超純水9.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，2×A8 FastHiFi PCR Master（北京艾德萊生物科技有限公司）12.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，CO I基因引物49 ℃、rbcL基因引物52.5 ℃，退火15 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸5 min。每次反應(yīng)均設(shè)置陰性對(duì)照，以檢驗(yàn)是否有污染。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定PCR產(chǎn)物為目的基因條帶后，送至杭州擎科生物科技有限公司進(jìn)行純化及雙向測(cè)序，以確保序列的可靠性。

1.3?數(shù)據(jù)處理

將獲得的原始序列放在DNAstar 5.0軟件包中的Seqman軟件中進(jìn)行拼接，并結(jié)合峰圖進(jìn)行人工校對(duì)，確保每個(gè)位點(diǎn)都準(zhǔn)確無(wú)誤。兩組數(shù)據(jù)（CO I和rbcL）經(jīng)過(guò)NCBI的BLAST驗(yàn)證，所得的序列均為目的基因。采用DnaSP 5.0［9］分析多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣性和核苷酸多樣性，統(tǒng)計(jì)單倍型［10］。采用MEGA 6.0［11］分析堿基組成，計(jì)算簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)、單突變位點(diǎn)，根據(jù)K2P兩參數(shù)模型（Kimura-2-Parameter，K2P）［12］計(jì)算群體間的遺傳距離以及單倍型遺傳距離，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)各個(gè)節(jié)點(diǎn)支持度計(jì)算采用bootstrap方法，進(jìn)行1 000次自檢。利用PopART 1.7［13］構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，探討本試驗(yàn)研究的壇紫菜單倍型譜系關(guān)系。利用DnaSP 5.0中的Tajimas D值推斷物種基因序列的變異類型［14］。使用Arlequin 3.5［15］進(jìn)行分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）。

2?結(jié)果

2.1?堿基組成

本試驗(yàn)共獲得120條序列，經(jīng)過(guò)比對(duì)去除測(cè)序起始兩端的部分序列，得到398 bp的CO I基因序列和488 bp的rbcL基因序列等長(zhǎng)同源序列。3個(gè)群體CO I基因序列的T、C、A、G 4種堿基的相對(duì)含量分別為37.940%、13.570%、33.920%、14.570%，C+G含量為28.140%，符合線粒體組成特征。上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得的序列號(hào)為ON533891～ON533895。rbcL基因的T、C、A、G 4種堿基的相對(duì)含量分別為32.790%、14.760%、34.640%、17.810%，上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得的序列號(hào)為ON533896～ON533898。聯(lián)合分析長(zhǎng)度為886 bp，所有獲得的序列中，T、C、A、G 4種堿基的相對(duì)含量分別為35.100%、14.220%、34.320%、16.360%（見(jiàn)表1）。

2.2?遺傳多樣性分析

CO I基因序列有394個(gè)保守位點(diǎn)，4個(gè)變異位點(diǎn)，其中單變異位點(diǎn)4個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)0個(gè)，定義了5個(gè)單倍型，單倍型多樣指數(shù)為0.130±0.059，核苷酸多樣性指數(shù)為0.000 34±0.002，平均核苷酸差異度為0.133，Tajimas D值為-1.844（P＜0.05）。

rbcL基因序列保守位點(diǎn)485個(gè)，變異位點(diǎn)2個(gè)，其中單變異位點(diǎn)1個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)1個(gè)，定義了3個(gè)單倍型，單倍型多樣性指數(shù)為0.128±0.057，核苷酸多樣性指數(shù)為0.000 27±0.001，平均核苷酸差異度為0.130，Tajimas D值為-1.191（P＞0.10）。

CO I和rbcL基因聯(lián)合遺傳多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，壇紫菜洞頭傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均高于兩個(gè)新品系，新品系HR-5的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均最低。

2.3?遺傳距離分析

壇紫菜洞頭傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系和兩個(gè)新品系的遺傳距離見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，壇紫菜洞頭傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系與新品系SW-81的遺傳距離大于與新品系HR-5的遺傳距離，SW-81和HR-5的遺傳距離較小。

2.4?群體遺傳結(jié)構(gòu)

分子方差分析（AMOVA）的結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，壇紫菜洞頭傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系和新品系的遺傳變異大多來(lái)自群體內(nèi)，表明研究的壇紫菜群體的遺傳分化主要表現(xiàn)為群體內(nèi)分化（FST=0.017，P＞0.05）。群體間的遺傳分化見(jiàn)表2。

Tajimas D值通常用于推斷物種基因序列的變異類型。所有個(gè)體，無(wú)論是CO I基因（Tajimas D值為-1.844，P＜0.05）、rbcL基因（Tajimas D值為-1.191，P＞0.10），還是 CO I和rbcL基因的聯(lián)合分析（Tajimas D值為-1.954，P＜0.05），結(jié)果顯示，Tajimas D值均為負(fù)值（見(jiàn)表1），壇紫菜群體在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了瓶頸效應(yīng)，說(shuō)明環(huán)境的選擇作用對(duì)有害變異進(jìn)行了清除。

6個(gè)變異位點(diǎn)定義了6個(gè)單倍型（Hap1～Hap6），其中Hap3為核心單倍型，占全部個(gè)體的88.600%。本地傳統(tǒng)養(yǎng)殖壇紫菜品系的單倍型數(shù)量多于其他兩個(gè)品系定義的單倍型數(shù)量（見(jiàn)表1）。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖1。其他單倍型均由Hap3衍生出來(lái)。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖沒(méi)有出現(xiàn)明顯的地理譜系結(jié)構(gòu)。

以條斑紫菜（Pyropia yezoensis）（CO I：KF561997.1；rbcL：AB818919.1）和紫菜（Pyropia fucicola）（CO I：KF561997.1；rbcL：KJ776837.1）為外群，構(gòu)建壇紫菜單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖2）。

由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，3個(gè)品系的種群尚未形成明顯的譜系現(xiàn)象。

3?討論

3.1?堿基組成

線粒體DNA的一個(gè)突出特點(diǎn)是鳥(niǎo)嘌呤（G）和胞嘧啶（C）相對(duì)含量低。在已經(jīng)測(cè)定的藻類線粒體DNA中，G+C的相對(duì)含量范圍為13.300%～53.200%，平均值為38%。但大多數(shù)藻類的G+C相對(duì)含量集中在20%～40%［16］。本研究中，3個(gè)壇紫菜群體的G+C相對(duì)含量為28.140%，該結(jié)果符合藻類線粒體DNA的組成特征，如紅毛菜綱中紅藻（Cyanidioschyzon merolaede）的G+C相對(duì)含量為27%，紅藻門(mén)中皺波角叉菜（Chondrus crispus）的G+C相對(duì)含量為27%，紫色紫菜（Porpgyra purpurea）的G+C相對(duì)含量為33%［16］。

3.2?遺傳多樣性

物種或種群的遺傳多樣性一般來(lái)源于長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中積累的豐富遺傳變異。一個(gè)物種的遺傳多樣性越豐富，其對(duì)生存環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，而物種的適應(yīng)能力越強(qiáng)，其進(jìn)化潛力也會(huì)越大。遺傳多樣性不僅是生物多樣性的內(nèi)在表現(xiàn)形式，還是物種保持進(jìn)化潛能的基本條件，對(duì)生物多樣性的形成、發(fā)展或者維持有重要的意義［17-18］。單倍型多樣性是衡量群體遺傳變異的重要指標(biāo)之一。本次檢測(cè)的60株壇紫菜個(gè)體只獲得了6個(gè)單倍型，表明3個(gè)壇紫菜養(yǎng)殖品系的遺傳多樣性水平較低。群體單倍型多樣度是評(píng)價(jià)該群體多態(tài)程度的重要指標(biāo)之一，數(shù)值越大，群體遺傳多樣性越高。本研究3個(gè)群體的核苷酸多樣性為0.000 30±0.001，單倍型多樣性為0.249±0.074，出現(xiàn)了高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的現(xiàn)象，符合Grant等［19］提出的海洋類生物具有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性的模式。溫州洞頭傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系的單倍型多樣性和核苷酸多樣性最高，其次為新品系SW-81，新品系HR-5最低。劉穎等［3］利用AFLP技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，臺(tái)州玉環(huán)地區(qū)壇紫菜傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系的多態(tài)位點(diǎn)比例高于新品系“浙南3號(hào)”，這可能是因?yàn)橛癍h(huán)本地傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系的種菜來(lái)源多樣且范圍大，而新品系“浙南3號(hào)”選育品系的種菜來(lái)源范圍較小，所以玉環(huán)品系的遺傳多樣性較高。由此可見(jiàn)，本研究與之前的研究結(jié)果是相吻合的，即壇紫菜種群遺傳多樣性整體處于較低水平；人工培育新品系的遺傳多樣性低于本地傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系，本地養(yǎng)殖品系的遺傳多樣性又低于野生品系［20］。

壇紫菜是一種喜浪海藻。野生壇紫菜大多分布于高潮帶，在受風(fēng)浪沖擊的外海礁石上生長(zhǎng)特別旺盛［21］。潮間帶受潮汐影響，微生境條件惡劣，該區(qū)域生物會(huì)受到溫度、鹽度和干露等條件的考驗(yàn)，而野生壇紫菜的遺傳多樣性程度較高，可以更好地適應(yīng)變化多樣的生存環(huán)境。壇紫菜新品系是選自于某株特殊材料，經(jīng)過(guò)誘變、裂解、擴(kuò)繁培養(yǎng)后得到的純系種質(zhì)，該方法使得新品系的遺傳多樣性較低。在為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)選育優(yōu)良品種時(shí)，一方面需確保穩(wěn)定高產(chǎn)，另一方面則應(yīng)擴(kuò)大選育材料來(lái)源，以提高種質(zhì)的遺傳多樣性，確保其適應(yīng)性更強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)壇紫菜品系間的遺傳分化水平較低，這與劉穎等［3］的研究結(jié)果相吻合。壇紫菜大部分為雌雄異體，繁育類型主要為異交，而且生活史中的果孢子及殼孢子都可以通過(guò)海流的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行長(zhǎng)距離傳播。我國(guó)沿海同時(shí)存在南向和北向兩種主要的洋流模式，一是黑潮的支流，沿我國(guó)臺(tái)灣北上入東海，即臺(tái)灣暖流；二是季節(jié)性的浙閩沿岸流，在冬季和夏季分別自北向南和自南向北流動(dòng)，促使不同海區(qū)間的聯(lián)系加強(qiáng)［22］。溫州洞頭海域受江浙沿岸流、臺(tái)灣暖流、地表徑流等3大洋流的影響，使得壇紫菜果孢子和殼孢子可以隨著洋流漂流，促進(jìn)壇紫菜不同養(yǎng)殖群體間發(fā)生基因交流，從而減少了群體間的遺傳分化［20］。另外，目前壇紫菜養(yǎng)殖品系間相互混雜，也增加了品種間基因交流的機(jī)會(huì)［3］。

4?結(jié)論

本研究使用線粒體CO I和葉綠體rbcL基因片段對(duì)壇紫菜溫州洞頭地區(qū)傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系和兩個(gè)新品系（SW-81和HR-5）進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)新品系的遺傳多樣性較低。因此，應(yīng)加大種質(zhì)保護(hù)和選育范圍，防止種質(zhì)退化。在壇紫菜育苗生產(chǎn)過(guò)程中，建議采用多個(gè)品系聯(lián)合應(yīng)用，以適應(yīng)多變的海洋環(huán)境。

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Abstract： In order to explore the genetic differences between the traditional and new strains（SW-81，HR-5） of Neoporphyra haitanensis in Dongtou district，Wenzhou，the genetic diversity of 60 individuals in these three strains was studied using CO?I and rbcL gene fragments.After comparative analysis，the 398 bp CO?I gene sequence and 488 bp rbcL gene sequence were obtained with an isologous sequence，the joint analysis length was 886 bp，and the content of T，C，A and G in all obtained sequences was 35.100%，14.220%，34.320% and 16.360%，respectively.There were 6 mutation sites，including 5 single mutation sites and 1 simple information site;The nucleotide diversity of the three strains was 0.000 30±0.001，and the haplotype diversity was 0.249±0.074.60 individuals defined 6 haplotypes，and Hap3 was the core haplotype，accounting for 88.600% of all individuals，respectively;The haplotype-constructed NJ phylogenetic tree showed that there was gene communication in each strain，and genetic differentiation had not yet occurred.The results showed that the genetic diversity of the new strain of N. haitanensis was low，so the scope of germplasm protection and breeding should be improved to prevent germplasm degradation.It is recommended to use multiple strains in the production process of seaweed seedlings to adapt to the changing marine environment.

Key words： Neoporphyra haitanensis; new strain; CO?I gene;?rbcL?gene; genetic diversity

作者簡(jiǎn)介：吳曉雯（1993—），女，助理研究員，研究方向?yàn)楹Ｑ笊锒鄻有?。E-mail：xwen0106@126.com

通信作者：張鵬（1982—），男，高級(jí)工程師，主要從事海洋生物生理生態(tài)研究。E-mail：zhangpeng20011918@163.com

項(xiàng)目資助：浙江省農(nóng)業(yè)（水產(chǎn)新品種選育）新品種選育重大科技專項(xiàng)（2021C02069-9）；溫州市科研項(xiàng)目（S2020008）；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部藻類產(chǎn)?業(yè)技術(shù)體系（CARS-50）。