健脾清化方對肥胖小鼠血管內(nèi)皮的保護作用研究

王琳 ，劉亞華 ，韓煦， ，金燊懿 ，陳清光， ，陸灝，

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院糖尿病研究所，上海 201203

肥胖是由遺傳和環(huán)境共同作用導(dǎo)致的慢性代謝性疾病，近年來已成為全球重要公共衛(wèi)生問題之一。2020年我國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報告顯示，18歲及以上成人超重/肥胖超過半數(shù)[1]。肥胖是心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVD）的危險因素，肥胖人群更易出現(xiàn)心臟代謝異常。近年來，過度肥胖導(dǎo)致的血管功能障礙引起眾多研究者關(guān)注[2-3]。中醫(yī)學(xué)認為，肥胖病機為“胃強脾弱”，導(dǎo)致痰濕、氣郁、血瘀。課題組應(yīng)用健脾清化方治療肥胖型糖尿病具有減重作用，給藥6周可降低肥胖小鼠體質(zhì)量、脂肪含量，改善脂肪異位沉積[4]，且對代謝綜合征患者血管內(nèi)皮具有保護作用[5-6]，但其作用機制尚不明確。本研究以高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)肥胖小鼠模型，觀察健脾清化方對肥胖小鼠血管內(nèi)皮的保護作用，并初步探討其作用機制，為后續(xù)研究提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠30只，6周齡，體質(zhì)量（18±2）g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司上海分公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2017-0011。飼養(yǎng)于SPF級實驗室，所有操作嚴(yán)格遵守上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理規(guī)定，并經(jīng)過倫理委員會審批（PZSHUTCM210903001）。高脂飼料，美國Research Diets公司，貨號D12492。

1.2 藥物及制備

健脾清化方（黨參15 g，黃芪15 g，黃芩9 g，黃連3 g，黃精15 g，山藥15 g，葛根15 g，鬼箭羽15 g），飲片購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥房，并委托制劑科制成中藥浸膏。具體方法：飲片加1 000 mL蒸餾水浸泡1 h，常規(guī)煎煮2次，每次30 min，過濾，將2次藥液混合，濃縮成含原藥材1.3 g/g浸膏，置于4 ℃冰箱保存。鹽酸二甲雙胍片，瑞士默克雪蘭諾公司，0.5 g/片，批號LTABQ 2691。將藥片碾碎后溶于生理鹽水，制成30 mg/mL混懸液。

1.3 試劑與儀器

無水乙醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號100092683），二甲苯（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號10023418），HE 染液套裝（武漢塞維爾，批號G1003），Masson 三色染色液（武漢塞維爾，批號G1006），中性樹膠（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號10004160），血小板內(nèi)皮細胞黏附分子-1（PECAM-1/CD31）抗體（武漢塞維爾，批號GB11063-2），NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）抗體（武漢塞維爾，批號GB11300），HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（武漢塞維爾，批號GB23301），HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（武漢塞維爾，批號GB23303），免疫組化試劑盒DAB顯色劑（丹麥DAKO，批號K5007）。

Nikon Eclipse E100 顯微鏡（日本尼康），Nikon DS-U3型成像系統(tǒng)（日本尼康），Pannoramic MIDI病理掃描儀（匈牙利3DHISTECH），Tecnai G2 spirit Bio TWIN透射電子顯微鏡（美國FEI），ST40臺式離心機（美國Thermo），Optima L-90K 高速離心機（美國Beckman），TD6K掌上離心機（湖南湘儀）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

30只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組6只和模型對照組24只，正常組予普通飼料喂養(yǎng)，模型對照組予高脂飼料喂養(yǎng)12周，以模型對照組小鼠體質(zhì)量≥1.2倍正常組為造模成功[7-9]，最終成模率為75%。將成模小鼠再次隨機分為模型組、健脾清化方組和鹽酸二甲雙胍組，每組6只。健脾清化方組予健脾清化方藥液（將浸膏用生理鹽水配制成1.61 g/mL溶液）20.961 g/kg灌胃，鹽酸二甲雙胍組予鹽酸二甲雙胍混懸液300 mg/kg灌胃，灌胃體積0.1 mL/10 g，模型組和正常組予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)6周。

2.2 取材

給藥結(jié)束后，小鼠禁食12 h，3%戊巴比妥鈉腹腔注射30 mg/kg麻醉，沿肋弓下緣兩側(cè)向上剪開胸腔，取胸主動脈，每只小鼠取同一部位，用于病理觀察和免疫組化檢測，剩余組織置于液氮中，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

2.3 HE染色

取胸主動脈環(huán)切，于4%多聚甲醛中固定24 h，梯度脫水后包埋，制作石蠟切片，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察胸主動脈結(jié)構(gòu)，使用病理掃描儀掃描切片并拍照。

2.4 Masson染色

制作石蠟切片后進行Masson 染色，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察胸主動脈纖維化改變，使用病理掃描儀掃描切片并拍照。

2.5 透射電鏡觀察

取小鼠胸主動脈環(huán)切，固定于2.5%戊二醛，經(jīng)漂洗、鋨酸固定、再漂洗、脫水、包埋、切片及染色等處理后，觀察胸主動脈內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)。

2.6 免疫組化檢測

石蠟切片脫蠟至水，置于EDTA抗原修復(fù)緩沖液中進行抗原修復(fù)，冷卻后PBS洗滌3次，每次5 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，封閉，洗滌，加CD31一抗（1∶500）、NLRP3一抗（1∶800），4 ℃孵育過夜，加二抗（1∶200），室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細胞核，脫水，封片。各切片隨機選取5個視野，應(yīng)用Image J軟件計算陽性染色面積（area）及積分光密度（IOD），結(jié)果以平均光密度（IOD/area）表示。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.2統(tǒng)計軟件作圖并進行分析。計量資料以±s表示，符合正態(tài)分布且滿足方差齊性，兩組間比較用t檢驗，多組比較用方差分析；不符合正態(tài)分布或方差不齊用Kruskal-WallisH檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 健脾清化方對模型小鼠胸主動脈病理形態(tài)的影響

正常組小鼠主動脈內(nèi)膜表面光滑，內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整，未見泡沫細胞，未見纖維組織增生等病變，內(nèi)膜及中膜彈力膜排列整齊、呈波浪狀；模型組小鼠胸主動脈局部內(nèi)皮細胞脫落，內(nèi)膜層增厚，有泡沫樣細胞聚集，局部管壁平滑肌和彈力纖維萎縮，平滑肌細胞排列紊亂，管壁明顯變??；健脾清化方組和鹽酸二甲雙胍組小鼠胸主動脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)基本完整，內(nèi)膜層無增厚，內(nèi)皮細胞脫落較少，中膜平滑肌細胞排列紊亂及萎縮情況有一定改善，且彈力膜排列較模型組整齊。見圖1。

圖1 各組小鼠胸主動脈形態(tài)（HE染色，標(biāo)尺=50 μm）

4.2 健脾清化方對模型小鼠胸主動脈纖維化的影響

Masson染色膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色。正常組小鼠胸主動脈內(nèi)膜及中膜彈力膜呈波浪狀排列，內(nèi)膜膠原纖維含量極少；模型組小鼠胸主動脈內(nèi)膜較正常組增厚，內(nèi)膜下膠原纖維明顯增加，彈力膜排列紊亂；與模型組比較，健脾清化方組和鹽酸二甲雙胍組小鼠胸主動脈內(nèi)膜及中膜膠原纖維有一定減少，且彈力膜排列整齊。見圖2。

圖2 各組小鼠胸主動脈形態(tài)（Masson染色，標(biāo)尺=50 μm）

4.3 健脾清化方對模型小鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

正常組小鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞形態(tài)規(guī)則，基膜完整，細胞核形態(tài)基本正常，內(nèi)彈力膜厚度均勻；模型組小鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞腫脹，基膜不連續(xù)，內(nèi)皮下間隙增大，部分異染色質(zhì)有邊集現(xiàn)象，細胞核減小且有輕度固縮，部分胞體突向管腔，內(nèi)彈力膜密度不均勻；健脾清化方組小鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞形態(tài)基本規(guī)則，細胞無明顯腫脹，基膜部分不連續(xù)，內(nèi)皮下間隙增大，染色質(zhì)分布較模型組好轉(zhuǎn)，細胞核形態(tài)基本正常，內(nèi)彈力膜密度基本一致；鹽酸二甲雙胍組小鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞完整，形態(tài)基本規(guī)則，內(nèi)皮下細胞間隙增大，細胞核形態(tài)基本正常，內(nèi)彈力膜厚度較均勻。見圖3。

圖3 各組小鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)

4.4 健脾清化方對模型小鼠胸主動脈組織CD31 蛋白表達的影響

CD31為血管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物，免疫組化染色表現(xiàn)為黃色或棕黃色。正常組小鼠胸主動脈內(nèi)膜有大量棕黃色顆粒沉積，CD31呈強陽性表達；模型組小鼠胸主動脈內(nèi)膜CD31表達降低，部分未見CD31表達，提示血管內(nèi)皮細胞有脫落和損傷；健脾清化方組和鹽酸二甲雙胍組小鼠胸主動脈內(nèi)膜CD31蛋白表達更接近正常組。見圖4。

圖4 各組小鼠胸主動脈組織CD31蛋白表達（免疫組化染色，×400）

4.5 健脾清化方對模型小鼠胸主動脈組織NLRP3蛋白表達的影響

正常組小鼠胸主動脈組織幾乎不表達NLRP3；與正常組比較，模型組小鼠胸主動脈組織NLRP3棕黃色顆粒沉積明顯增加（P＜0.01），主要分布在胸主動脈平滑肌細胞胞質(zhì)中；與模型組比較，健脾清化方組和鹽酸二甲雙胍組小鼠胸主動脈組織NLRP3 表達顯著降低（P＜0.01）。見圖5、圖6。

圖5 各組小鼠胸主動脈組織NLRP3蛋白表達（免疫組化染色，×400）

圖6 各組小鼠胸主動脈組織NLRP3表達比較（±s，每組4只）

5 討論

肥胖是糖尿病和CVD的主要危險因素，血管內(nèi)皮是血液與血管壁之間的重要屏障，內(nèi)皮功能受損發(fā)生在肥胖的最早階段，是導(dǎo)致CVD血管改變的基礎(chǔ)[10]。大量證據(jù)表明，肥胖伴隨血管內(nèi)皮功能障礙和血管密度降低[11-12]。研究還發(fā)現(xiàn)，肥胖可以使嗜中性粒細胞重編程，從而破壞血管內(nèi)皮細胞黏附，增加血管通透性，促進癌細胞擴散[13]。作為與血液直接接觸的細胞，血管內(nèi)皮細胞在感知及調(diào)控機體代謝變化過程中起重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞和脂肪細胞的相互作用是維持白色脂肪組織穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)，而血管內(nèi)皮細胞分泌代謝信號對白色脂肪組織穩(wěn)態(tài)和機體代謝非常重要[14]。因此，修復(fù)血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能對治療肥胖及其引起的繼發(fā)性疾病有重要意義。

中醫(yī)藥治療肥胖在控制體質(zhì)量、減少反彈等方面具有一定優(yōu)勢。對于肥胖引起的血管內(nèi)皮損傷，中醫(yī)學(xué)認為其病位在脈，脈功能正常是保證血液循行正常的重要條件。朱丹溪提出“痰挾瘀血，遂成窠囊”之說，以氣病日久成痰化瘀闡明痰濁與瘀血相互膠結(jié)，附于脈絡(luò)，破壞血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而共同為患的病機，益氣活血或活血化瘀中藥具有保護血管內(nèi)皮功能的作用[15]。健脾清化方是蔡淦教授在李東垣“陰火”概念指導(dǎo)下，結(jié)合臨床經(jīng)驗制定的基礎(chǔ)方。方中黨參、黃芪為君藥，可大補中氣；黃連、黃芩清泄陰火，山藥、黃精補脾益陰，共為臣藥；葛根升提陽氣、升清止渴，鬼箭羽清郁久深入血分之邪熱，活血化瘀，為佐使。全方可益氣養(yǎng)陰、活血化瘀。課題組前期研究表明，健脾清化方具有減重、調(diào)脂作用[4]。本實驗發(fā)現(xiàn)，健脾清化方能改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠受損的血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和炎癥狀態(tài)，體現(xiàn)在恢復(fù)主動脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整性、減少內(nèi)皮細胞脫落、減輕血管內(nèi)皮細胞腫脹、縮小內(nèi)皮細胞間隙等。

肥胖者血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)受損與缺氧、炎癥、氧化應(yīng)激和免疫失衡等因素相關(guān)[16]。CD31在循環(huán)的血小板和白細胞中主要作為抑制受體，通過調(diào)節(jié)其細胞質(zhì)域的連續(xù)磷酸化，限制細胞激活反應(yīng)。同時也在血管內(nèi)皮細胞之間的連接處高表達，因此，可作為血管內(nèi)皮細胞的特異性標(biāo)記物[17-18]。CD31參與維持血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)完整性，同時作為黏附性應(yīng)激反應(yīng)蛋白，在炎癥或血栓形成后加速血管通透性屏障的恢復(fù)，可能是治療血管通透性障礙的靶點[19]。臨床前研究認為，CD31激動劑對動脈粥樣硬化患者具有一定治療潛力，或可作為動脈粥樣硬化的治療靶點[20]。CD31免疫組化染色主要定位在血管內(nèi)皮細胞胞漿及血管內(nèi)皮細胞之間的連接處。因血管內(nèi)皮細胞是長梭形單層細胞，染色結(jié)果呈一條線，目前文獻中缺乏較好的定量評價方法，因此本研究未做定量分析。本研究發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠胸主動脈內(nèi)膜CD31呈強陽性表達，而模型組小鼠胸主動脈內(nèi)膜CD31表達明顯降低，提示血管內(nèi)皮細胞脫落和損傷。而健脾清化方和鹽酸二甲雙胍干預(yù)后，模型小鼠血管內(nèi)皮細胞CD31表達有所升高，說明健脾清化方對血管內(nèi)皮細胞有一定保護作用。

炎癥因子有助于全身性低度炎癥的發(fā)展，異常的NLRP3激活可驅(qū)動體內(nèi)慢性炎癥狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)疾病進程[21]。多種內(nèi)外因子均可激活NLRP3[22]，適度調(diào)節(jié)NLRP3活性對維持細胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者皮下脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織中NLRP3 表達上調(diào)[23]。NLRP3 可感知肥胖相關(guān)危險信號，并參與肥胖誘導(dǎo)的炎癥和胰島素抵抗[24]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3在冠狀動脈粥樣硬化患者主動脈中高表達，且與冠狀動脈病變嚴(yán)重程度及動脈粥樣硬化危險因素相關(guān)[25-27]。本研究中模型組小鼠胸主動脈組織NLRP3表達較正常組升高，而健脾清化方和鹽酸二甲雙胍可降低模型小鼠NLRP3表達，說明健脾清化方可以通過下調(diào)NLRP3表達減輕肥胖小鼠血管炎癥。

綜上所述，健脾清化方能在一定程度上改善肥胖小鼠受損的內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)，改善內(nèi)皮細胞功能，抑制炎癥狀態(tài)，這種作用可能是通過抑制NLRP3表達實現(xiàn)的，同時對于重要靶點CD31具有靶向作用。后續(xù)將以NLRP3上下游通路聯(lián)合CD31的調(diào)控機制作為研究切入點，深入探索健脾清化方保護肥胖小鼠血管內(nèi)皮細胞的機制，為健脾清化方的臨床應(yīng)用提供參考。