rh-ES在血管正?；瘯r(shí)間窗內(nèi)聯(lián)合順鉑對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤的抗腫瘤效果*

徐姝玫 嚴(yán)沁 李帥 黎露蔚 何朗

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都 610075;2.成都市第五人民醫(yī)院·成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬第五人民醫(yī)院/第二臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤科·成都市腫瘤防治所,四川 成都 611137;3.成都中醫(yī)藥大學(xué),四川 成都 610075)

實(shí)體腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、侵襲過程與血管生成密不可分[1]。 微血管密度(Microvessel denstity,MVD) 在臨床上被視為評(píng)估惡性腫瘤血管生成最重要的指標(biāo),其反映的是腫瘤誘導(dǎo)血管的生成,一定程度上能預(yù)測(cè)腫瘤的生長、發(fā)展過程[2]。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)作為促血管生成因子中最關(guān)鍵的細(xì)胞因子,是惡性腫瘤血管新生的直接體現(xiàn), 其水平高低可在一定意義上體現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的活性[3]。重組人血管內(nèi)皮抑素(Recombinant human vascular endostatin,rh-ES)通過與信號(hào)通路中VEGF特異性作用,阻止其與受體相互作用,抑制血管的生成,使得腫瘤細(xì)胞難以獲取生長所需營養(yǎng)物質(zhì),進(jìn)而控制了癌細(xì)胞的生長發(fā)育[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)DNp73是一種抗凋亡蛋白,其具有只在癌組織中及相關(guān)血管內(nèi)皮中高表達(dá)的特性,并可促進(jìn)其他內(nèi)皮生長因子的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞增殖[6]。故DNp73被認(rèn)為是檢驗(yàn)?zāi)[瘤血管生成的重要指標(biāo)[7-8]。本實(shí)驗(yàn)采用第1至3天、第4至6天、第7至9天3個(gè)時(shí)間段來探討rh-ES聯(lián)合DDP化療的最佳給藥時(shí)機(jī)、抑瘤效果及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Lewis肺癌細(xì)胞(Lewis lung cancer, LLC)購自腫瘤生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(四川大學(xué)),6～8周齡SPF級(jí)雌性C57/BL6體質(zhì)量15～20 g的實(shí)驗(yàn)小鼠30只(質(zhì)量合格編號(hào):SYXK2013-076)購自川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK (川) 2013-18),重組人血管內(nèi)皮抑素(15 mg/3 mL)購于先聲麥得津生物制藥有限公司(山東),SABC免疫組化試劑盒購于santa cruz,TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于碧云天公司(上海),二氨基聯(lián)苯胺 染色劑(diaminobenzidine, DAB)購于博士德公司(武漢),青霉素-鏈霉素雙抗購于Hyclone公司(美國),順鉑注射液(cisplatin, DDP, 10 mg/2 mL)購于個(gè)舊生物藥業(yè)有限公司(云南),CD34 兔抗小鼠單克隆抗體、VEGF 兔抗小鼠單克隆抗體、DNp73α小鼠抗小鼠單克隆抗體購于邁新生物技術(shù)公司(福建)。

1.2 小鼠LLC皮下移植瘤模型的建立 將小鼠LLC皮下移植瘤模型制成1×106mL-1單細(xì)胞懸液,并取0.2 mL于每只小鼠的左側(cè)腋下皮下注射,記錄腫瘤生長、發(fā)育情況。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及治療 小鼠移植瘤模型建立10天后,將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為6組,每組各5只,d1表示治療開始第1天。NS組在第1至9天小鼠予以腹腔注射生理鹽水(0.2 mL/d);rh-ES組小鼠在第1至9天予以腹腔注射重組人血管內(nèi)皮抑素(5 mg·kg-1·d-1);rh-ES+DDP(d1～3)、rh-ES+DDP(d4～6)、rh-ES+DDP(d7～9)組小鼠分別在第1至9天予以腹腔注射rh-ES(5 mg·kg-1·d-1),并分別于對(duì)應(yīng)時(shí)間段腹腔注射順鉑(2 mg·kg-1·d-1)。

1.4 小鼠惡性腫瘤生長發(fā)育曲線 測(cè)得小鼠腫瘤長徑用(a)、短徑用(b)表示,按照小鼠腫瘤體積(cm3)=a×b2×0.52,橫軸單位為天數(shù)(d),縱軸單位為體積(cm3),繪制曲線圖。

1.5 標(biāo)本的采集及處理 肺組織留取:所有小鼠均留取肺組織,肉眼觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況,使用4%甲醛溶液固定標(biāo)本,大體觀察、脫水、透明、包埋及制片后進(jìn)行HE染色鏡下觀察。小鼠腫瘤標(biāo)本離體30 min內(nèi)置入液氮罐中,后置于超低溫冰箱中保存。

1.6 免疫組化染色檢測(cè)腫瘤組織中CD34及相關(guān)指標(biāo)表達(dá) 免疫組化(IHC)采用SABC法進(jìn)行染色。石蠟切片脫蠟,H2O2封閉,蒸餾水洗5 min,高壓鍋抗原修復(fù)后上搖床,PBS洗滌后血清封閉孵育1 h分別滴加CD34抗體(1∶100)、VEGF抗體(1∶100)、DNp73α(1∶50),4 ℃冰箱過夜。PBS洗滌后先后滴加生物素化的二抗及三抗,行DAB顯色,鏡下觀察,適時(shí)終止。清水充分沖洗,蘇木素復(fù)染,清水沖洗返藍(lán),梯度酒精脫水。陽性對(duì)照采用己知陽性切片;陰性對(duì)照用PBS液代替一抗[9]。

1.7 結(jié)果判斷 ①CD34結(jié)果判斷及MVD的計(jì)數(shù):以腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒為CD34表達(dá)陽性。②VEGF結(jié)果判斷:腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為VEGF表達(dá)陽性。每張切片的陽性細(xì)胞率及陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度參照Tanak的定量積分法進(jìn)行分級(jí)計(jì)分,陽性細(xì)胞率即陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的百分比例,陽性強(qiáng)度即陽性細(xì)胞率與著色強(qiáng)度的乘積。③DNp73α結(jié)果判斷:DNp73α陽性表達(dá)為胞核清晰棕黃色。VEGF、DNp73α染色結(jié)果均按以下標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分:陽性細(xì)胞比例<5%記為0分,5%～25%記為1分,25%～50%記為2分,50%～75%記為3分,>75%記為4分。顯色程度未著色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分?？偡譃殛幮?-),2～4分為弱陽性(+),5～8分為陽性(++),9分以上為強(qiáng)陽性(+++)。染色結(jié)果以標(biāo)記指數(shù)(labeling index, LI)記錄,方法為計(jì)算1000 個(gè)在任意挑選的5個(gè)400倍視野中的腫瘤細(xì)胞的陽性細(xì)胞個(gè)數(shù),LI=(陽性細(xì)胞數(shù)/1000)×100%。

2 結(jié)果

2.1 小鼠LLC成瘤情況 接種Lewis肺癌細(xì)胞的小鼠10天后,皮下均出現(xiàn)質(zhì)地較硬、活動(dòng)度差、呈膨脹性生長的長徑約6 mm的移植瘤。

2.2 移植瘤體積變化 依照前述公式計(jì)算,橫軸以時(shí)間(d)為單位,縱軸以體積(cm3)為單位。6組小鼠腫瘤體積隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)行逐漸增長,NS組腫瘤體積生長最快,rh-ES +DDP(d4～6)組腫瘤體積增長最慢,試驗(yàn)結(jié)束時(shí)NS組、rh-ES 組、DDP組、rh-ES +DDP(d1～3)組、rh-ES+DDP(d4～6)組、rh-ES +DDP(d7～9)組皮下移植瘤體積分別為(5.69±0.80)mm3、(4.95±0.52)mm3、(3.92±0.37)mm3、(3.53±0.44)mm3、2.02±0.32)mm3、(3.69±0.40)mm3。rh-ES+DDP(d4～6)組腫瘤體積與其余5組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

圖1 小鼠腫瘤體積變化曲線圖

2.3 6組肺轉(zhuǎn)移瘤情況 小鼠肺組織中可見細(xì)胞核深染、核分裂象多見的腫瘤細(xì)胞。腫瘤周圍毛細(xì)血管豐富。HE染色切片顯示,除rh-ES +DDP(d4～6)肺轉(zhuǎn)移瘤相對(duì)較少外,其余各組均可明顯見到轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞,NS組最為明顯,見圖2。

2.4 6組CD34及MVD表達(dá)狀況 CD34陽性區(qū)域癌巢中央少見,周圍分布較廣,瘤內(nèi)微血管形態(tài)欠規(guī)則,個(gè)別呈蔟狀,見圖3。通過計(jì)數(shù),NS組、rh-ES組、DDP組、rh-ES +DDP(d1～3)組、rh-ES +DDP(d4～6)組、rh-ES +DDP(d7～9)組MVD分別為(28.56±6.55)、(25.32±5.04)、(24.10±4.28)、(17.50±3.12)、(8.32±1.48)和(19.06±3.58)。各聯(lián)合組MVD均較單藥組減少,以rh-ES+DDP(d4～6)組減少最明顯(P<0.05),見圖4。

2.5 VEGF檢測(cè)的免疫組化(IHC)結(jié)果 IHC顯示,NS組中VEGF在腫瘤中的表達(dá)LI明顯高于其他各組(P<0.05),見圖5。rh-ES組、DDP組、rh-ES +DDP(d1～3)組、rh-ES+DDP(d4～6)組以及rh-ES +DDP(d7～9)組5組間比較,rh-ES+DDP(d4～6)組的VEGF表達(dá)率最低(P<0.05),見圖6。

圖5 6組VEGF表達(dá)情況 (IHC,400×)

圖6 6組VEGF的表達(dá)積分

2.6 IHC檢測(cè)腫瘤新生血管標(biāo)志物DNp73α的結(jié)果 各組按預(yù)定時(shí)間處死小鼠行腫瘤標(biāo)本IHC檢測(cè)DNp73α。結(jié)果發(fā)現(xiàn),NS組、rh-ES組、DDP組、rh-ES+DDP(d1～3)組、rh-ES +DDP(d4～6)組及rh-ES +DDP(d7～d9)組DNp73α表達(dá)率分別為(80.65±3.36)%、(73.47±3.69)%、(78.12± 3.98)%、(60.89±4.01)%、(30.42±3.02)%和(54.18±3.68)%,rh-ES+DDP(d4～d6)組DNp73α表達(dá)顯著低于另5組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖7、8。

圖7 6組DNp73α表達(dá)情況(IHC,400×)

圖8 6組DNp73α表達(dá)評(píng)分

3 討論

腫瘤微生態(tài)系統(tǒng)理論認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為是腫瘤微生態(tài)系統(tǒng)重建其系統(tǒng)內(nèi)營養(yǎng)聯(lián)系的結(jié)果,而腫瘤的血管化是其重建營養(yǎng)聯(lián)系的一種表現(xiàn)。人體內(nèi)血管生成受到復(fù)雜的控制系統(tǒng)調(diào)控,在正常人體內(nèi)血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子受到嚴(yán)格的調(diào)控,保證體內(nèi)血管生成維持在一種受控制的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。但在腫瘤患者體內(nèi)這一平衡被打破,促血管生成因子明顯增多,尤其VEGF使腫瘤組織內(nèi)新生血管生成呈不受控制、無序的生長狀態(tài)。血管內(nèi)皮生長因子及血管內(nèi)皮生長因子受體(Vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)所介導(dǎo)的信號(hào)通路是其中最重要的調(diào)節(jié)通路,通過旁分泌途徑進(jìn)行聯(lián)合調(diào)控,若此動(dòng)態(tài)平衡失衡,腫瘤將脫離休眠狀態(tài)[10]。

重組人血管內(nèi)皮抑素是在內(nèi)皮抑素(Endostatin,ES)于N-端附加9個(gè)氨基酸序列而合成,相比于ES,rh-ES具有更高的穩(wěn)定性,更長的半衰期和更多的作用靶點(diǎn),通過抑制VEGF及VEGFR的結(jié)合,阻斷信號(hào)通路的激活,特異性的抑制內(nèi)皮細(xì)胞活性,從而使腫瘤血管生成減少,降低MVD[11]。根據(jù)血管正?；瘯r(shí)間窗理論:運(yùn)用抗血管生成藥物后,腫瘤內(nèi)部結(jié)構(gòu)、功能紊亂的血管將在一段時(shí)間內(nèi)趨于正?；?這一時(shí)間段即為血管正?；瘯r(shí)間窗[12]。在該時(shí)間窗內(nèi), 腫瘤紊亂的血管結(jié)構(gòu)得到糾正、血管基底膜增厚、血管周細(xì)胞覆蓋率增加,腫瘤乏氧細(xì)胞比例降低,對(duì)放、化療敏感性提高,可最大程度發(fā)揮化、放療的抗腫瘤療效[13-14]。血管正常化時(shí)間窗理論已得到國內(nèi)外眾多研究支持[15-16]。不同的血管生成抑制劑具有不同的血管正常化窗口期,是否所有的血管生成抑制劑在血管正?；陂g聯(lián)合用藥均能達(dá)到增強(qiáng)療效的作用,仍不明確。因此,驗(yàn)證rh-ES在時(shí)間窗內(nèi)聯(lián)合用藥是否有效提高化放療療效對(duì)指導(dǎo)臨床合理、規(guī)范用藥具有重要意義。本研究結(jié)果顯示,rh-ES +DDP(d4～6)組小鼠腫瘤體積最小、增長速度最慢,腫瘤壞死最明顯,肺轉(zhuǎn)移瘤也最少(P<0.05)。說明rh-ES聯(lián)合DDP于第4至6天對(duì)腫瘤抑制作用最強(qiáng),此時(shí)期是抗腫瘤作用的最佳時(shí)相,是腫瘤血管正?；翱谄?。

CD34是穩(wěn)定的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物之一,能準(zhǔn)確反應(yīng)MVD數(shù)量,腫瘤組織內(nèi)CD34明顯增高,已有研究證實(shí)VEGF與MVD具有明顯相關(guān)性[17]。rh-ES通過抑制VEGF等促血管生成因子作用,而減少腫瘤新生血管形成,降低MVD,抑制腫瘤細(xì)胞增殖[18]。本研究發(fā)現(xiàn)VEGF與MVD在各聯(lián)合治療組中的表達(dá)均較單藥治療組減少,尤其在rh-ES +DDP(d4～6)組,VEGF與MVD表達(dá)率均明顯降低,且顯著低于其他治療組(P<0.05)。

p53 是經(jīng)典的腫瘤抑制因子,其突變頻率是抑癌基因中最高的基因之一[19-20]。p73 已被鑒定為腫瘤抑制蛋白 p53 的結(jié)構(gòu)和功能同源物,其具有一個(gè)內(nèi)在的 P2 啟動(dòng)子,剪切生成N-端缺失的蛋白DNp73α。由于氨基末端反式激活結(jié)構(gòu)域的截短,DNp73α表達(dá)通常與對(duì)細(xì)胞凋亡和治療的抗性有關(guān)[21-22]。已有研究發(fā)現(xiàn),DNp73α在肺癌、乳腺癌、食管癌等腫瘤血管內(nèi)皮中高表達(dá),正常人體組織中幾乎不表達(dá)[23]。DNp73α也是腫瘤中VEGF表達(dá)和有效血管形成的重要調(diào)節(jié)因子,可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[24-25]。目前國內(nèi)外關(guān)于DNp73α與新生血管關(guān)系的研究甚少,本研究通過對(duì)腫瘤標(biāo)本行IHC檢測(cè)DNp73α,結(jié)果發(fā)現(xiàn)rh-ES各聯(lián)合組DNp73α表達(dá)均較單藥組減少,以rh-ES +DDP(d4～6)組的 DNp73α表達(dá)率最低(P<0.05)。說明rh-ES聯(lián)合治療可通過抑制DNp73α的表達(dá)來抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖,降低微血管通透性,從而改善腫瘤微環(huán)境,增強(qiáng)細(xì)胞毒藥物的抑瘤效果。DNp73α的促瘤作用可能通過上調(diào)VEGF的表達(dá)來抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,而rh-ES能夠抑制VEGF高表達(dá)[26]。因此,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,rh-ES可通過抑制DNp73α和VEGF的高表達(dá)促使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,聯(lián)合順鉑化療時(shí),在rh-ES作用后的第4天至6天時(shí)期達(dá)到高峰。

4 結(jié)論

在rh-ES使用后第4天至6天血管正?；翱谄诩佑庙樸K能增強(qiáng)抑瘤療效,其可能的機(jī)制之一是通過抑制DNp73α、VEGF的表達(dá),降低腫瘤微環(huán)境內(nèi)微血管密度而增強(qiáng)化療藥物療效。