醬香型白酒高溫大曲發(fā)酵過程中真菌多樣性研究

吳 成， 程平言， 謝 丹， 黃 魏， 李嶺卓， 張 健， 尤小龍， 胡 峰， 鐘方達

（貴州茅臺酒廠（集團）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州 習(xí)水 564622）

中國白酒種類豐富、風(fēng)味獨特。 醬香型白酒以貴州茅臺、貴州習(xí)酒、四川郎酒為代表，具有醬香突出、幽雅細(xì)膩的特征，該特點的形成與高溫大曲密切相關(guān)[1]。 高溫大曲是以小麥為原料，加入水和母曲，在發(fā)酵過程中品溫最高可達60~70 ℃的一種糖化劑和發(fā)酵劑，具有提供菌源、糖化發(fā)酵、產(chǎn)酒生香的作用[2]。 其中富含功能豐富的真菌微生物，如酵母菌Saccharomyces 和Pichia 可以產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)；絲狀真菌如Aspergillus、Rhizomucor 和Rhizopus可以代謝多種酶類包括α-淀粉酶、葡糖淀粉酶等[3-6]，因此，解析高溫大曲中真菌群落組成對挖掘功能微生物具有重要意義。

傳統(tǒng)的醬香型白酒高溫大曲制作主要是通過人工踩制，存在勞動強度大、生產(chǎn)效率低、人工成本高的缺點[7-8]。 目前，現(xiàn)代生物技術(shù)、自動化和電子信息技術(shù)已應(yīng)用于白酒生產(chǎn)中，以改進傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)工藝、提高白酒質(zhì)量和風(fēng)味，進而推進機械化在高溫大曲制作中的應(yīng)用[9-10]。高溫大曲機械化壓制過程與人工踩制過程類似，其采用獨創(chuàng)氣缸模擬人工腳掌踩曲，降低了勞動強度、提高了生產(chǎn)效率[8]。 近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)由于具有測序方法簡單、通量高、速度快和準(zhǔn)確性較高的特點，被廣泛應(yīng)用于釀造微生物多樣性研究中[11]。 相關(guān)研究者將高通量測序技術(shù)與傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法結(jié)合解析了高溫大曲中真菌群落組成，結(jié)果表明在高溫大曲中優(yōu)勢真菌主要包括Candida、Trichoderma、Aspergillus 和Thermomyces， 但在不同產(chǎn)區(qū)、不同發(fā)酵時期以及小類真菌群落組成上表現(xiàn)出差異性[12-18]，并且其中還存在一定數(shù)量的未知菌屬有待于進一步分析鑒定。 隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，以PacBio（Pacific BioSciences）公司的單分子實 時 測 序 技 術(shù) （single molecule real -time sequencing，SMRT）為代表的三代高通量測序技術(shù)已開始應(yīng)用于釀酒微生物多樣性的研究中[19]。 與二代高通量測序技術(shù)相比，SMRT 具有讀取序列長度長、精確度高的優(yōu)點，可以將更多的微生物注釋到種水平[11,20-21]。 但由于SMRT 成本相對較高，目前較少見到其在高溫大曲微生物多樣性中應(yīng)用的研究報道。

因此，為解析醬香型白酒仿生機制曲及傳統(tǒng)人工曲發(fā)酵過程真菌多樣性及特征， 以及比較SMRT與二代高通量測序技術(shù)分析結(jié)果異同，作者采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法及SMRT 對醬香型白酒高溫大曲發(fā)酵過程，包括曲坯成型入倉（發(fā)酵0 d）、一次翻曲（發(fā)酵8 d）、二次翻曲（發(fā)酵15 d）、曲坯出倉（發(fā)酵35 d）中真菌多樣性及特征進行研究，旨在解析醬香型白酒高溫大曲制作過程中真菌群落組成及其特征， 為挖掘高溫大曲中功能微生物及進一步闡明高溫大曲發(fā)酵和調(diào)控機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫大曲：采集于貴州茅臺酒廠（集團）習(xí)酒有限責(zé)任公司；Power DNA Isolation Kit 試劑盒： 美國Mibio 公司；孟加拉紅培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；WL 培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司；YPD 培養(yǎng)基：2 g/dL 葡萄糖、2 g/dL 蛋白胨、1 g/dL 酵母浸粉， 固體YPD 培養(yǎng)基中加入2 g/dL 瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F 無菌操作臺： 蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZQPW-70 全溫振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；YXQ-LS-100SII 立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業(yè)有限公司；DM500 光學(xué)顯微鏡：德國LEICA 公司；PCR 儀：美國ThermoFisher 公司；PacBio Sequel 測序平臺：美國PacBio 公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品處理 曲坯成型入倉（AQ）、 一次翻曲（YF）、二次翻曲（EF）和發(fā)酵結(jié)束出倉（CQ）各工藝環(huán)節(jié)按曲倉的門、中、窗不同位置各隨機取3 塊高溫大曲，于4 ℃下立即帶回實驗室粉碎，按質(zhì)量比1∶1∶1 混合為一個綜合樣品，共8 個樣品，其中仿生機制曲4 個、 傳統(tǒng)人工曲4 個； 樣品編號分別為AQ1、YF1、EF1、CQ1、AQ2、YF2、EF2 和CQ2（1 表示仿生機制曲，2 表示傳統(tǒng)人工曲）。

1.3.2 實驗方法

1）真菌的分離及初鑒定 稱取10 g 大曲綜合樣品于90 mL 無菌水中，30 ℃、180 r/min 恒溫振蕩30 min，采用稀釋涂布平板法（稀釋度為10-1、10-2、10-3） 于孟加拉紅培養(yǎng)基上分離篩選絲狀真菌、WL培養(yǎng)基上分離篩選酵母菌， 放置于30 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2~3 d 及5 d 后，記錄菌落總數(shù)。根據(jù)菌落形態(tài)隨機挑取絲狀真菌菌落3~5 株、 酵母菌30~50株，再次純化于孟加拉紅培養(yǎng)基和WL 培養(yǎng)基上進一步觀察菌落形態(tài)特征，同時結(jié)合光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)對分離菌株進行初步鑒定[22]；絲狀真菌純化于PDA 培養(yǎng)基， 于4 ℃斜面保藏、 酵母菌純化于YPD 液體培養(yǎng)基中，－80 ℃甘油保藏 （體積分?jǐn)?shù)40%的甘油與菌液體積比為1∶1）。

2）菌株的分子鑒定 選取代表性菌株1~3 株采用Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒提取DNA， 采用通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTG CGG）和ITS2（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）PCR 擴增后進行ITS 鑒定。 PCR 反應(yīng)體系包括： 引物各1 μL；DNA 模板2 μL；去離子水7 μL；PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，30 次循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，降至4 ℃。將PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測序，采用BLAST 軟件與標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進行比對分析， 將相似度在97%以上的認(rèn)定為同一菌種。

3）單分子實時測序 樣品總DNA 采用PowerSoil DNA Isolation Kit 試劑盒進行提取， 具體操作步驟參照試劑盒說明書， 選擇ITS 全長序列由北京擎科生物科技有限公司進行單分子實時測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 單分子實時測序中，由于測序片段的大小遠遠小于測序長度，因此目標(biāo)片段會重復(fù)測多次（passes），通常當(dāng)passes 數(shù)目大于4 時，環(huán)形一致性序列（circular consensus sequencing，CCS）的準(zhǔn)確性就可達99%以上。 因此，測序完成后，通過SMRT Link 軟件將原始下機數(shù)據(jù)校正得到CCS 序列數(shù)據(jù)，按照最小passes≥5、最低預(yù)測準(zhǔn)確率≥0.9識別CCS 序列。 然后對CCS 序列進行Barcode 識別、過濾、去除嵌合體后，得到有效CCS 序列，使用Usearch 軟件對有效CCS 序列在97.0%相似度水平下進行聚類，獲得OTU。 以UNITE 為參考數(shù)據(jù)庫進行物種注釋，使用QIIME2 軟件計算Chao1、Shannon和Simpson 指數(shù)分析樣品Alpha 多樣性； 基于物種相對豐度使用SPSS 軟件進行主成分分析； 使用CYTOSCAPE 軟件對真菌物種間相關(guān)性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法

采用稀釋平板涂布法，共分離保藏528 株酵母菌、44 株絲狀真菌，結(jié)合其菌落及細(xì)胞形態(tài)特征，可將528 株酵母菌劃分為11 種類型（I~XI）、絲狀真菌4 種類型（XII~XV），見圖1。對代表性菌株進行ITS區(qū)域序列分析后，將其鑒定為Saccharomyces cerevisiae、Wickerhamomyces anomalus、Pichia kudriavzevii、Millerozyma farinose、Candida tropicalis、Trichomo -nascus ciferrii，Kazachstania humilis、Clavispora lusitaniae、Torulaspora delbrueckii、Kodamaea ohmeri、Kluveromyces marxianus 11 種 酵 母 菌， 以 及Aspergillus fumigatus，Aspergillus nidulans，Asper -gillus chevalieri，Rhizomucor pusillus 4 種絲狀真菌。由表1 可知，在AQ 環(huán)節(jié)，仿生機制曲中酵母菌群落較傳統(tǒng)人工曲豐富；YF 至CQ 環(huán)節(jié)， 酵母菌數(shù)量逐漸降低；EF 和CQ 環(huán)節(jié)絕大部分已檢測不出， 這可能與發(fā)酵溫度逐漸升高（YF 環(huán)節(jié)溫度達65 ℃左右）大部分酵母菌不耐高溫有關(guān)。 但也有少部分酵母菌如M. farinosa 和C. lusitaniae 表現(xiàn)出耐高溫的特性。 Jung 等從韓國傳統(tǒng)發(fā)酵劑Nuruk 中篩選到了一株產(chǎn)木糖醇的耐熱M. farinose[23]，F(xiàn)an 等從大曲中分離篩選到一株高產(chǎn)己酸乙酯的C. lusitaniae[24]，表明在高溫大曲發(fā)酵過程中，耐高溫酵母菌可能對大曲風(fēng)味有重要貢獻作用；而絲狀真菌在高溫大曲發(fā)酵整個過程都有檢出，方程等研究表明，大曲中富含種類豐富的絲狀真菌， 除了具有分泌多種功能酶類、降解原料中淀粉和蛋白質(zhì)、產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)作用外，還具有強大的次級代謝產(chǎn)物合成潛力，是挖掘新天然產(chǎn)物的重要來源[25]。

表1 依賴于可培養(yǎng)方法高溫大曲中真菌群落變化情況Table 1 Change of fungal community in high temperature Daqu revealed by cultured-dependent approaches

圖1 醬香型白酒高溫大曲中真菌菌落及顯微特征Fig. 1 Colonies and microscopic characteristics of fungal in high-temperature Daqu of sauce-flavor baijiu

2.2 單分子實時測序

2.2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量及Alpha 多樣性指數(shù)分析 各樣品采用PacBio Sequel 測序后， 對序列進行識別、過濾、 去除嵌合體后共獲得58 410 條有效CCS 序列，每個樣品至少有7 046 條有效序列，樣品平均序列長度為554~596 bp，見表2。 使用QIIME2 軟件分析各樣品Alpha 多樣性指數(shù)，Chao1 指數(shù)可以反映樣品中物種數(shù)量，Shannon 和Simpson 指數(shù)可以反映樣品中物種多樣性。 從AQ 到CQ 環(huán)節(jié)，仿生機制曲和傳統(tǒng)人工曲的真菌多樣性呈逐漸降低趨勢。 對于仿生機制曲而言，Chao1 指數(shù)逐漸下降，Shannon和Simpson 指數(shù)在AQ 和EF 環(huán)節(jié)較高， 在YF 和CQ 較低； 而在傳統(tǒng)人工曲中，Chao1、Shannon 和Simpson 指數(shù)在YF 和CQ 環(huán)節(jié)較高， 在AQ 和EF環(huán)節(jié)較低，表明真菌群落組成在2 種高溫大曲中存在較大差異。 同時，各樣品中的覆蓋率（coverage）在96.99%~99.97%，表明測序深度足夠、各樣品測序量充分，測序結(jié)果能夠真實反映各樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性。

表2 樣品測序及Alpha 多樣性指數(shù)結(jié)果Table 2 Results of sample sequencing and Alpha-diversity indexes

2.2.2 真菌多樣性分析 使用Usearch 軟件對有效CCS 序列在97.0%相似度水平下進行聚類， 共得到178 個操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU），進一步采用UNITE 數(shù)據(jù)庫對每個OTU 進行注釋比對，最終檢測到6 個門、17 個綱、32 個目、64個科、114 個屬和162 個種。

在種水平上，將相對豐度在1%以上的真菌認(rèn)定為優(yōu)勢菌種， 共檢出包括Thermoascus aurantiacus、Thermoascus crustaceus、Byssochlamys spectabilis、Thermomyces lanuginosus、P. kudriavzevii、K. humilis、W. anomalus、Geotrichum silvicola、C. tropicalis 和A. subflavus 等24 個優(yōu)勢菌種， 總的相對豐度在88.74%以上，部分菌種與傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法鑒定結(jié)果一致，見圖2。 在AQ 環(huán)節(jié)，酵母菌P.kudriavzevii（10.34%/49.10%）、K. humilis（33.64%/21.64% ）、W. anomalus（20.61%/9.81%）和C.tropicalis（7.09%/1.59%）為主要優(yōu)勢菌種；隨著發(fā)酵溫度升高，酵母菌數(shù)量及種類逐漸下降， 至YF 環(huán)節(jié)，T. auarntiacus（65.48%/39.53%）成為主要優(yōu)勢菌種；到EF 環(huán)節(jié)，仿生機制曲中真菌群落組成較傳統(tǒng)人工曲豐富，EF1 與EF2 相比，除T. aurantiaus 和B. spectabilis外， 還檢出了一定量的T. crustaceus、W. anomalus和A. subflavus，各相對豐度在10.00%以上，同時還檢 出 了 少 量 的 Hyphopichia burtonii、Wallemia canadensis 和A. versicolor 等； 在CQ 環(huán) 節(jié)，以T.aurantiacus（27.64%/6.31%）、T. crustaceus（55.77%/61.03%）、B. spectabilis（1.15%/2.11%）、T.lanuginosus（1.50%/30.12%） 為主的耐高溫絲狀真菌成為優(yōu)勢菌種。

圖2 種水平上高溫大曲中真菌群落組成Fig. 2 Composition of fungal community in high-temperature Daqu at species level

在醬香高溫大曲發(fā)酵過程中， 在AQ 環(huán)節(jié)2 種高溫大曲中以酵母菌為主要優(yōu)勢菌種，其可能是來源于母曲和周圍環(huán)境[26]；隨著發(fā)酵溫度的升高（YF至EF 環(huán)節(jié)）， 由于大多數(shù)真菌不能在高溫下存活，耐熱絲狀真菌及少部分耐熱酵母菌成為主要優(yōu)勢菌種。 有研究表明，在醬香型白酒高溫大曲發(fā)酵過程中，大多真菌類微生物易受高溫環(huán)境的調(diào)控[14]；到CQ 環(huán)節(jié)，2 種大曲中真菌群落組成類似但在相對豐度上存在差異，可能與曲坯發(fā)酵結(jié)束后仿生機制曲和傳統(tǒng)人工曲水分和酸度存在差異有關(guān)[27]。同時，與二代高通量測序結(jié)果相比，貴州茅臺高溫大曲中主要 優(yōu) 勢 菌 屬 包 括 Aspergillus，Mucor，Rhizopus，Candida，Pichia 和Sacccharomyces 等[28-29]；沈毅等從四川郎酒高溫大曲中發(fā)現(xiàn)T. languginosus、A.cibarius 和Thermoascus sp.為主要優(yōu)勢菌種，且還存在一定數(shù)量的未知菌屬[30]。 可知在種水平上SMRT 測序技術(shù)更有利于揭示真菌群落組成情況，特別是小類菌種的組成（相對豐度＜1%）。

2.2.3 主成分及物種相關(guān)性分析 基于優(yōu)勢菌種的相對豐度對樣品進行主成分分析，見圖3。結(jié)果表明，AQ1 和AQ2 樣品真菌群落結(jié)構(gòu)組成相似。到Y(jié)F環(huán)節(jié)后，仿生機制曲與傳統(tǒng)人工曲中真菌群落組成差異明顯，YF 與EF 環(huán)節(jié)可能是由于B、C、D 類別中真菌含量上的差異導(dǎo)致2 種大曲真菌群落組成差異明顯；CQ 環(huán)節(jié)可能是由于A 類別中真菌含量存在差異導(dǎo)致2 種大曲真菌群落組成差異明顯，即2 種大曲中優(yōu)勢菌種由于含量的差異從而造成仿生機制曲與傳統(tǒng)人工曲在YF 至CQ 環(huán)節(jié)呈現(xiàn)出差異性。

圖3 基于優(yōu)勢菌種相對豐度的主成分分析Fig. 3 PCA analysis based on relative abundance of the dominant species

為進一步研究上述主要微生物之間的相互關(guān)系，選取屬水平相對豐度大于1%的物種，計算其物種之間的斯皮爾曼等級相關(guān)系數(shù)，并篩選相關(guān)性大于0.1 且P<0.05 的數(shù)據(jù)構(gòu)建物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖4。多數(shù)真菌屬之間呈顯著正相關(guān)調(diào)節(jié)機制，其中包括55 個真菌屬呈顯著正相關(guān)，6 個真菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)。 這些復(fù)雜的生物學(xué)關(guān)系構(gòu)成了高溫大曲發(fā)酵過程的基本生物學(xué)調(diào)控機制，也是高溫大曲發(fā)酵過程發(fā)酵動力、風(fēng)味動力形成和調(diào)控機制的基本組 成。 由 圖 4 可 知，Thermoascus 與 Pichia、Filobasidium、Eremothecium 和Fusarium 等4 種真菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)，這4 種菌屬不管是仿生機制曲還是傳統(tǒng)人工曲的含量都呈下降趨勢，至曲坯發(fā)酵結(jié)束出倉已基本檢測不出。 Bassochlamys 與Kazachstania、Geotrichum 呈 顯 著 負(fù) 相 關(guān)，Pichia、Kazachstania、Candida、Wickerhamomyces 等4 種 酵母呈顯著正相關(guān)，它們在曲坯成型入倉環(huán)節(jié)含量最多，隨著發(fā)酵的進行含量逐漸降低，這可能主要是受發(fā)酵溫度的影響。

圖4 高溫大曲制作過程真菌群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖（屬水平）Fig. 4 Correlation network diagram of fungal communities in the process of high-temperature Daqu making at genus level

2.3 傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法與SMRT 測序結(jié)果比較

采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和SMRT 測序技術(shù)在醬香型白酒高溫制曲過程中都檢出了W. anomalus、P. kudriavzevii、C. tropicalis、K. ohmeri、K. humilis、K. marxianus 以及Aspergillus 屬絲狀真菌，但2 種方法鑒定結(jié)果存在差異。 在SMRT 測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了大 量 的Thermoascus、Byssochlamys 及Thermomyces屬絲狀真菌和其他小類菌屬，而傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法沒有檢出， 卻發(fā)現(xiàn)了一定量的S. cerevisiae、M. farinosa、T. ciferrii、C. lusitaniae、T. delbruecki 和R. pusillus。 2 種方法鑒定分析結(jié)果存在差異性的原因主要是：1）傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法中使用的培養(yǎng)基類別太少，有待于進一步優(yōu)化；2）在傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法中無法僅通過ITS 區(qū)域測序分析實現(xiàn)對絲狀真菌在種水平上準(zhǔn)確的鑒定，如Aspergillus 屬絲狀真菌。

作者選擇WL 培養(yǎng)基對高溫大曲中酵母菌進行篩選分離，并結(jié)合菌落及顯微形態(tài)對其進行初步分類，但同一種酵母菌由于菌株代謝差異，可能在WL培養(yǎng)基上呈現(xiàn)不同的菌落形態(tài)導(dǎo)致分類結(jié)果有偏差，但選擇代表性菌落并結(jié)合ITS 區(qū)域測序分析，可以較好地實現(xiàn)對酵母菌鑒定至種水平；而對絲狀真菌進行分析鑒定時， 作者發(fā)現(xiàn)ITS 區(qū)域測序分析可能不適用于Aspergillus 屬絲狀真菌種水平上的鑒定，這可能是導(dǎo)致在傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和SMRT 測序結(jié)果中出現(xiàn)的Aspergillus 屬不同種的原因，這在李營等的研究結(jié)果中也得到證實[31]，他們發(fā)現(xiàn)該屬的A. lentulus 和A. udagawae 無法通過ITS 測序進行準(zhǔn)確區(qū)分鑒定。 SMRT 測序技術(shù)與二代高通量測序技術(shù)相比，雖然具有讀取序列長度長，精確度較高的優(yōu)點，但其通量較低。 同時，SMRT 測序結(jié)果準(zhǔn)確性有賴于參考序列的長短及數(shù)據(jù)庫的完整性。 唐勇等研究發(fā)現(xiàn)， 在16S rRNA 基因的SMRT 測序中，RDP 數(shù)據(jù)庫在屬及以上水平注釋準(zhǔn)確性較高，而greengene 數(shù)據(jù)庫具有種水平的注釋優(yōu)勢，其建議在進行SMRT 測序時，參考序列應(yīng)該選擇更長的基因序列或者綜合多個數(shù)據(jù)庫進行注釋[20-21]。 基于此，我們也同時采用UNITE 和Genbank 數(shù)據(jù)庫對測序數(shù)據(jù)進行注釋比對，結(jié)果表明UNITE 較Genbank 數(shù)據(jù)庫更適用于ITS 區(qū)域全長序列的注釋比對。 但相關(guān)研究表明， 在二代高通量測序技術(shù)中，Genbank 與RDP、SILVA 數(shù)據(jù)庫相比，更適用于真核微生物鑒定尤其是酵母菌的鑒定[32]，這可能與測序時選擇的參考序列長短有關(guān)。 因此，在后續(xù)的研究中，本課題組將進一步比較不同的真菌數(shù)據(jù)庫結(jié)果。

3 結(jié) 語

作者采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法與SMRT 測序技術(shù)對醬香型白酒仿生機制曲及傳統(tǒng)人工曲發(fā)酵過程中真菌多樣性及其特征進行了研究。 結(jié)果表明，W. anomalus、P. kudriavzevii、C. tropicalis、K. ohmeri、K. humilis、K. marxianus 以及Aspergillus 屬絲狀真菌，可同時通過傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法與SMRT 測序技術(shù)檢出，但在小類菌屬鑒定分析上SMRT 測序技術(shù)更顯優(yōu)勢。通過SMRT 測序共檢出6 個門、17 個綱、32個目、64 個科、114 個屬和162 個種，且從曲坯成型入倉到發(fā)酵結(jié)束出倉，真菌多樣性呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，與傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法結(jié)果一致。 主成分分析表明，仿生機制曲和傳統(tǒng)人工曲僅在曲坯入房環(huán)節(jié)真菌群落組成相似。 但從一次翻曲到曲坯發(fā)酵結(jié)束出倉，2 種大曲中真菌群落組成差異較大。主要表現(xiàn)為優(yōu)勢菌種豐度及小類菌種組成上存在差異，這可能與曲坯中水分、酸度和發(fā)酵溫度有關(guān)。 物種相關(guān)性分析結(jié)果表明，多數(shù)真菌屬之間呈顯著正相關(guān)調(diào)節(jié)機制， 其中包括55 個真菌屬呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，6 個真菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)，真菌群落微生物之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，在后續(xù)研究中我們將進一步闡明微生物演替代謝與大曲中風(fēng)味物質(zhì)之間的聯(lián)系。

雖然傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法具有耗時較長、工作量大的缺點，但是采用WL 培養(yǎng)基可對高溫大曲中酵母菌進行了快速初步分類，因此，WL 培養(yǎng)基可作為快速分類鑒定酵母菌的有效手段，我們將在后續(xù)的研究工作中構(gòu)建酵母菌在WL 培養(yǎng)基上菌落形態(tài)的數(shù)據(jù)庫，以期更好地對酵母菌進行快速分類鑒定。 對絲狀真菌鑒定后僅發(fā)現(xiàn)了種類較少的絲狀真菌，同時發(fā)現(xiàn)僅通過ITS 區(qū)域測序分析無法實現(xiàn)對部分絲狀真菌種水平上的準(zhǔn)確鑒定。 我們將在后續(xù)的研究中進一步對選擇培養(yǎng)基進行優(yōu)化，并結(jié)合絲狀真菌的生長代謝特點，以期在后續(xù)的研究中分離篩選到種類更加豐富的絲狀真菌，為構(gòu)建醬香型高溫大曲分類標(biāo)準(zhǔn)提供參考。 此外，傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法鑒定結(jié)果表明， 部分酵母菌呈現(xiàn)出耐高溫的特性， 如M.farinosa 和C. lusitaniae， 它們在醬香型白酒中的作用相關(guān)研究報道較少，有待于進一步闡明。

SMRT 測序技術(shù)作為第三代高通量測序技術(shù)的代表，同時具有測序序列長且測序錯誤率較低的優(yōu)點[20-21]。 本研究結(jié)果表明，與第二代高通量測序技術(shù)相比，SMRT 測序技術(shù)更適合于在種水平上對真菌多樣性進行分析。目前以Roche454 和Illumina 測序平臺為主的第二代高通量測序技術(shù)在微生物多樣性研究中仍是主力[11]，因為盡管SMRT 測序錯誤率較低，且可以通過提高循環(huán)測序深度（passes）降低錯誤率，但是目前SMRT 存在的系統(tǒng)錯誤及無法完全排除嵌合體序列干擾等問題仍是SMRT 測序技術(shù)在微生物多樣性研究中的挑戰(zhàn)[33]。

綜上所述，醬香型白酒高溫大曲發(fā)酵過程真菌群落組成豐富，仿生機制曲和傳統(tǒng)人工曲在優(yōu)勢菌種豐度和小類菌種群落組成上存在較大差異，從而導(dǎo)致2 種大曲從一次翻曲到發(fā)酵結(jié)束出倉呈現(xiàn)較大的差異性。 本研究為挖掘高溫大曲中功能酵母菌和絲狀真菌以及進一步闡明高溫大曲發(fā)酵機理提供了理論依據(jù)。