小葉苦丁枝條提取物的植物乳桿菌發(fā)酵代謝組分析

吳雨烔， 周禮紅*， 方月月， 解文利， 白 雪

（1. 貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州 貴陽 550025；3. 貴州大學(xué) 山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025；4. 貴州泰和現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，貴州 遵義 564400）

我國擁有悠久的別樣茶飲用歷史，其中小葉苦丁最早載于《貴州民間方藥集》[1]，由于其含咖啡因較少，口感層次豐富，飲后不影響睡眠，能清熱解毒，在夏季頗受人們喜愛。 小葉苦丁為木樨科植物，包括粗壯女貞、麗葉女貞、日本毛女貞等屬，本研究中貴州小葉苦丁屬粗壯女貞，在中國、孟加拉國、柬埔寨、越南均有分布。 其在我國分布頗廣，主要生長在海拔400~2 000 m，分布地區(qū)主要有貴州、云南、四川、安徽南部等[2]，其中貴州余慶縣及四川筠連縣產(chǎn)業(yè)規(guī)模較大。

小葉苦丁茶中黃酮、多酚、苯乙醇苷類等生物活性成分在各項(xiàng)研究中表現(xiàn)出優(yōu)異的藥理作用。 氧化應(yīng)激是衰老和許多疾病的誘因，會(huì)給細(xì)胞造成難以修復(fù)的損傷，而小葉苦丁茶在體外抗氧化模型和動(dòng)物模型中效果顯著[3]。 在Caco-2 細(xì)胞腸道模型中能有效保護(hù)細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷[4]，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，增強(qiáng)腸道屏障抵御能力，減輕腸道炎癥[5-6]，而腸道微生態(tài)又通過腦腸軸與肥胖癥、糖尿病、心血管疾病等代謝失調(diào)類疾病相關(guān)聯(lián)。 研究還發(fā)現(xiàn)，小葉苦丁茶能降低血糖濃度和預(yù)防高血壓[7]、降低血脂[8]和改善肥胖人群心血管疾病的相關(guān)指標(biāo)[9]、抑菌抗炎和抗腫瘤活性[10]，可作為功能性食品開發(fā)的原料、天然的食品添加劑和藥用成分的提取原料。

貴州省余慶縣小葉苦丁茶量大質(zhì)優(yōu)，深受市場青睞，遠(yuǎn)銷日、法、東南亞，被稱為“中國小葉苦丁之鄉(xiāng)”。 2020 年，貴州省余慶縣小葉苦丁茶銷售產(chǎn)值超過5 億元，市場需求量超過6 500 t，在全國37個(gè)中大城市開設(shè)了300 余個(gè)銷售網(wǎng)點(diǎn)[11]。 采茶后剩余的大量枝條一般作為廢料焚燒，環(huán)境不友好的同時(shí)還忽略了其可能存在的食用或者藥用價(jià)值。

作者前期研究發(fā)現(xiàn)，小葉苦丁枝條在體外抗氧化模型中表現(xiàn)優(yōu)異，而抗氧化性與多種生理活性相關(guān)聯(lián)， 表明小葉苦丁枝條中存在多種生理活性成分， 且小葉苦丁枝條活性成分水提率較為理想，同時(shí)提取后殘?jiān)捎糜谟袡C(jī)肥生產(chǎn)。 乳酸發(fā)酵可以提高基質(zhì)的生理活性和功能特性，作者所在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了植物乳桿菌發(fā)酵提取物的工藝，故采用植物乳桿菌對(duì)小葉苦丁枝條提取物進(jìn)行發(fā)酵， 通過LC-MS、NRM 非靶向代謝組研究其發(fā)酵前后物質(zhì)構(gòu)成和分布。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 菌種：Lactobacillus plantarum LP-15，專利號(hào)ZL 2016 1 027815.9；小葉苦丁Ligustrum robustum(Rxob.) Blume 枝條：取自貴州省遵義市余慶縣，北緯27°16′29″，東經(jīng)107°48′19″；甲醇、乙腈：純度≥99.9%，Thermo 公司；2-氯苯丙氨酸： 純度98.5%，Aladdin 公司；甲酸：LC-MS 級(jí)，TCI 公司；甲酸銨：純度≥99.9%，Sigma 公司；H2O：Milli-Q 公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 離心機(jī)H1850-R：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；混勻儀QL-866：上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；真空濃縮儀5305：艾本德股份有限公司；濾膜0.22 μm PTFE：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；液相色譜儀UltiMate 3000、質(zhì)譜儀Q Exactive Focus：賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵樣品制備 枝條前處理：余慶縣的小葉苦丁枝條洗凈， 切成約2 cm 長小段后烘干至恒質(zhì)量待用。

枝條水提物制備： 稱取200 g 枝條置于1 000 mL 蒸餾水中煮沸20 min，過濾，補(bǔ)齊蒸發(fā)水分至1 000 mL， 即得小葉苦丁枝條提取物。 提取物用100 mL 錐形瓶分裝，裝樣量為70 mL，在110 ℃下滅菌10 min， 取發(fā)酵前樣品， 編號(hào)LS1、LS2、LS3、LS4、LS5、LS6，記為GPLS1 組。

枝條水提物發(fā)酵方法：取作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏菌種植物乳桿菌LP-15， 在斜面上活化2 次后用無菌水沖洗， 調(diào)整菌懸液OD600值為0.700±0.002，以10%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。 該種子液以5%的接種體積分?jǐn)?shù)接入上述滅菌提取液中，37 ℃下培養(yǎng)24 h， 取發(fā)酵后樣品，編號(hào)FLS1、FLS2、FLS3、FLS4、FLS5、FLS6，記為GPLS2 組。

1.2.2 代謝組檢測樣本制備 上述樣品分別取100 μL 加入400 μL 甲醇中， 振蕩混勻60 s，4 ℃下于12 000 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)行真空濃縮。所得樣品加入4 μg/g 的2-氯苯氨酸和體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液120 μL 復(fù)溶， 經(jīng)0.22 μm 膜過濾后進(jìn)行代謝組檢測。

每個(gè)待測樣本各取20 μL 混合成質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本，用于跟蹤校正信號(hào)漂移的情況，分別在數(shù)據(jù)采集過程中的開始、過程中和結(jié)束時(shí)插入QC 樣本。

色譜條件： 采用ACQUITY HUPLC?HSS T3 1.8 μm（2.1 mm×150 mm）色譜柱,自動(dòng)進(jìn)樣溫度為8℃，流量0.25 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL，流動(dòng)相正離子為0.1 g/dL 甲酸水和0.1 g/dL 甲酸乙腈，負(fù)離子為5 mmol/L 甲酸銨水和乙腈，見表1。

表1 洗脫程序Table 1 Elution procedure

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源電壓分別為正離子噴霧電壓3.5 kV，負(fù)離子噴霧電壓2.5 kV，鞘氣5.25 MPa，輔助氣1.75 MPa。 毛細(xì)管溫度325 ℃，以分辨率70 000 進(jìn)行全掃描，掃描范圍81~1 000，并采用HCD 進(jìn)行二級(jí)裂解，碰撞電壓為30 eV，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除無必要的MS/MS 信息。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 使用Proteowizard 軟件將檢測到的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML 格式后， 通過R 語言的XCMS 程序包進(jìn)行峰識(shí)別、峰過濾、峰對(duì)齊，得到包括質(zhì)核比和保留時(shí)間及峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣；進(jìn)而得到正負(fù)離子模式下的前體分子，導(dǎo)出數(shù)據(jù)至excel， 使用R 語言MetaboanalystR 程序包3.0 版進(jìn)行主成分分析、偏最小二乘法判別分析等多元統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)量控制

QC 樣本用于跟蹤和校正數(shù)據(jù)采集過程中產(chǎn)生的信號(hào)漂移，如圖1~2 所示，在正負(fù)離子模式下QC樣本均包含于95%置信區(qū)間內(nèi)，聚集良好，說明檢測方法穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。

圖1 正離子模式QC 樣本PCA 得分Fig. 1 PCA score of QC sample in positive ion mode

圖2 負(fù)離子模式QC 樣本PCA 得分Fig. 2 PCA score of QC sample in negative ion mode

2.2 主成分分析

通過主成分分析(principal component analysis,PCA)，樣本自然聚集成明顯分離的2 組，即發(fā)酵前樣本組與發(fā)酵后樣本組， 與研究者的人為分組吻合。 樣本均被包含在95%的置信區(qū)間內(nèi)，不存在離群值， 在66.7%的概率上解釋了小葉苦丁枝條提取物在植物乳桿菌發(fā)酵前后物質(zhì)變化上存在的差異。

2.3 偏最小二乘法判別分析

PCA 適用于組間差異大的情況，當(dāng)組間差異較小時(shí)， 用偏最小二乘法判別分析 （Partial Least Squares Discriminant Analysis,PLS-DA)補(bǔ)充分析，可以更好地確定樣本關(guān)系。GPLS1 和GPLS2 樣品均包含于95%置信區(qū)間內(nèi)，無離群值，兩組點(diǎn)云明顯分離，說明發(fā)酵前后代謝物有顯著差異，Compnent1 能在54.7%的概率上解釋GPLS1 和GPLS2 的組間差異，Compnent1 和Compnent2 累計(jì)貢獻(xiàn)率為61.3%，見圖3。 用置換檢驗(yàn)n=100 來判斷PLS-DA 模型的區(qū)分效果，結(jié)果見圖4。觀測檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量在隨機(jī)分布右側(cè)， 說明對(duì)GPLS1 和GPLS2 的判別結(jié)果并不完全由隨機(jī)導(dǎo)致。 P＞0.05，說明模型判別效果不顯著，有必要進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析減少噪音干擾，見圖5。

圖3 PCA 得分圖Fig. 3 Score plot of PCA

圖4 PLS-DA 得分圖Fig. 4 Score plot of PLS-DA

圖5 PLS-DA 置換檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量分布及P 值Fig. 5 PLS-DA permutation test statistics distribution and P value

2.4 正交偏最小二乘法判別分析

與PLS-DA 結(jié)果一致，GPLS1 和GPLS2 所有樣本點(diǎn)均被包含于95%的置信區(qū)間內(nèi)，無離群點(diǎn)，2 組點(diǎn)云明顯分離， 在61.3%的概率上可以解釋2 組代謝物變化上的差異。交叉檢驗(yàn)R2Y=0.995，Q2=0.983，均接近于1，說明模型穩(wěn)定可靠。對(duì)正交偏最小二乘判 別 分 析 （orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA） 模型 進(jìn) 行頻 次100 次的置換檢驗(yàn)，結(jié)果見圖6~7。 觀測檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量位于隨機(jī)分布右尾后，且P＜0.05，說明OPLS-DA 模型能夠有效判別不同分組，小葉苦丁枝條發(fā)酵前后存在差異顯著的代謝物。

圖6 OPLS-DA 得分圖Fig. 6 Score plot of OPLS-DA

圖7 OPLS-DA 置換檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量分布及P 值Fig. 7 OPLS-DA permutation test statistics distribution and P value

2.5 單變量分析

多元分析結(jié)果顯示，GPLS1 和GPLS2 間存在顯著差異，單變量分析通過代謝物變化倍數(shù)來衡量差異的大小。 如圖8 所示， 粉色點(diǎn)代表了變化倍數(shù)（fold change,FC）絕對(duì)值大于2 且P＜0.05 的代謝物，這些代謝物在發(fā)酵前后變化較大，發(fā)酵后顯著上調(diào)的代謝物106 種，顯著下調(diào)的代謝物92 種。 為了篩選出重要代謝物并直觀顯示其發(fā)酵前后的變化，以FC≥2 或FC≤0.5 且P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出單維統(tǒng)計(jì)排名前25 的代謝物作箱式圖，見圖9。 發(fā)酵后相對(duì)含量大幅度上調(diào)的16 種，下調(diào)的9 種，這些代謝物在GPLS1 組和GPLS2 組的組間差異極顯著。

圖8 變化倍數(shù)火山圖Fig. 8 A volcano map of multiple variations

圖9 TOP 25 代謝物差異箱式圖Fig. 9 Box plot of top 25 differential metabolites

2.6 差異代謝物篩選

根據(jù)OPLS-DA 的分析結(jié)果，變量重要性（value importance in projection）VIP＞1 且P＜0.05 的代謝物共286 種， 這286 種代謝物對(duì)OPLS-DA 判別結(jié)果有重要作用。 為了進(jìn)一步篩選差異顯著的代謝物，結(jié)合OPLS-DA 和單變量分析結(jié)果， 以FC≥2 或FC≤0.5 且P＜0.05、VIP＞1 為指標(biāo)，共篩選出175 種代謝物， 其中顯著上調(diào)的100 種， 顯著下調(diào)的75種， 篩選出單維統(tǒng)計(jì)排名前25 的代謝物作為差異較大的代謝物，見表1。 其中肽類3 種，碳水化合物1 種，核酸類4 種，脂類1 種，有機(jī)酸1 種，黃酮類1種，其他14 種。慶大霉素C1a、川皮苷、鵝肌肽、莽草酸分別上調(diào)22 672 倍、915 倍、11 倍、20 倍；普魯卡因、尿嘧啶、奧西那林分別下調(diào)33 倍、16 倍、15 倍。

表1 TOP 25 代謝物Table 1 Top 25 metabolites

2.7 代謝通路分析

上述篩選出的差異代謝物作為關(guān)鍵代謝物通過富集分析和拓?fù)浞治龅玫?1 條差異顯著的代謝通路，其中氨基酸代謝通路6 條，說明發(fā)酵過程中氨基酸代謝相關(guān)物質(zhì)前后變化較為豐富。 如圖10藍(lán)色區(qū)域所示，在顯著富集的前11 條通路中：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝的氣泡最大，通路中關(guān)鍵代謝物包括L-谷氨酰胺，琥珀酸半醛等；其次是β-丙氨酸代謝通路，關(guān)鍵代謝物包括差異代謝物鵝肌肽、尿嘧啶等。 苯丙氨酸代謝包括苯乙醇、富馬酸等；絡(luò)氨酸代謝包括富馬酸、4-羥基苯乙醇、琥珀酸鹽等； 泛酸鹽和輔酶A 的生物合成包括尿嘧啶、L-纈氨酸、維生素B5等。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成包括莽草酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸等。TCA 循環(huán)是好氧生物體內(nèi)各大代謝的重要樞紐部分，包括差異代謝物富馬酸、順烏頭酸等；氮素代謝的關(guān)鍵代謝物包括L-谷氨酰胺、 一磷酸腺苷等；精氨酸和脯氨酸代謝通路中包括了顯著差異的代謝物L(fēng)-谷氨酰胺、2-琥珀酰-L-谷氨酸-5-半醛、胍丁胺等； 亞油酸代謝包括γ-亞麻酸、12,13-DHOME等；丁酸鹽代謝途徑包括關(guān)鍵代謝物富馬酸、琥珀酸等。

圖10 代謝通路富集分析和拓?fù)浞治鯢ig. 10 Enrichment analysis and topology analysis of metabolic pathway

3 討 論

通過LC-MS 非靶向代謝組檢測手段， 共檢測出代謝物543 種，其中多肽類相對(duì)含量在發(fā)酵后由32.5%增加至70.8%； 碳水化合物由39.2%減少至7.8%；有機(jī)酸發(fā)酵前為9.4%，發(fā)酵后為9.1%；核酸由7.9%下調(diào)至1.9%； 維生素和輔酶類發(fā)酵前為5.6%，發(fā)酵后為3.6%；脂類在發(fā)酵前為4.2%，發(fā)酵后為2.6%； 類固醇發(fā)酵前為0.63%, 發(fā)酵后升高到4.3%；激素由0.046%降至0.023%。

發(fā)酵后小肽相對(duì)含量大幅增加，通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生的小肽可能表現(xiàn)出一系列親代蛋白質(zhì)不具有或效果一般的生理活性：如抗氧化活性、降低血液膽固醇、血管緊張素Ⅰ抑制活性[12]、α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制作用[13]，有在體內(nèi)拮抗炎癥、多種心腦血管疾病、糖尿病的潛能。 肽類中鵝肌肽、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺被鑒定為差異代謝物。 鵝肌肽是一種組氨酸二肽，能有效降低高尿酸血癥小鼠的尿酸水平[14]，具有抗氧化活性，人體補(bǔ)充鵝肌肽對(duì)促進(jìn)健康有著積極作用[15]。L-亮氨酸是人體必需的21 種氨基酸之一，參與調(diào)節(jié)氨基酸和蛋白質(zhì)代謝、改善糖代謝和脂代謝紊亂[16-17]。 L-谷氨酰胺雖然是非必需氨基酸，但其參與蛋白質(zhì)代謝，能夠有效減輕腸道炎癥和氧化應(yīng)激[18]。 植物乳桿菌的生理代謝活動(dòng)消耗碳源，碳水化合物的相對(duì)含量大幅下降，產(chǎn)生有機(jī)酸。 有機(jī)酸是發(fā)酵后枝條酸味的來源，代謝物中檢測到L-蘋果酸、富馬酸、順烏頭酸、沒食子酸、奎尼酸等，研究表明有機(jī)酸具有多種生物活性[19]。鑒定到的有機(jī)酸中，順烏頭酸為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物， 莽草酸是芳香族類物質(zhì)生物合成途徑的中間體，連接糖代謝和多酚代謝[20]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血栓作用[21]。核酸相對(duì)含量明顯下調(diào)，差異代謝物中幾種核酸類物質(zhì)降低倍數(shù)超過2 倍，核苷酸參與體內(nèi)許多代謝，嘌呤最終代謝物尿酸升高是疾病的生化基礎(chǔ)。 25 種差異代謝物中，川皮苷變化倍數(shù)為915倍，川皮苷是一種黃酮類脂分子，苦味化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌[22]及神經(jīng)保護(hù)作用[23]。 γ-亞麻酸變化倍數(shù)為9 倍，同樣具有抗炎、抗氧化、降低血糖[24-25]等一系列生理活性。 2-苯乙醇是一種芳香化合物，有苦味、花卉味、蜂蜜味，與糖結(jié)合形成苯乙醇苷類，苯乙醇苷類具有很強(qiáng)的生物活性如抗氧化性[26]。

4 結(jié) 語

通過對(duì)植物桿乳桿菌發(fā)酵小葉苦丁枝條前后的代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前后代謝物差異顯著，說明發(fā)酵改變了小葉苦丁枝條提取物的物質(zhì)構(gòu)成， 提高了某些生理活性代謝物的相對(duì)含量。而抗生素慶大霉素C1a 與林可霉素及其他藥用成分的大幅增加，也為植物乳桿菌發(fā)酵小葉苦丁枝條提取物的安全問題帶來了不確定性。 作者初步分析了小葉苦丁枝條提取物發(fā)酵前后的差異組成，證明了乳酸菌發(fā)酵對(duì)小葉苦丁枝條的資源化利用是可行的，而慶大霉素C1a 等成分帶來的安全風(fēng)險(xiǎn)和川皮苷等幾種生物活性成分精確定量還需要進(jìn)一步的評(píng)估和研究。