不同實(shí)驗(yàn)技術(shù)在多發(fā)性骨髓瘤診斷中的應(yīng)用價(jià)值

周 媛, 陶林靜

(南陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南 南陽 473000)

作為常見血液系統(tǒng)惡性腫瘤,多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者的主要特征為骨髓中惡性漿細(xì)胞發(fā)生異常增生、聚集,臨床多表現(xiàn)為骨質(zhì)破壞、胸痛、貧血及感染等,并無特異性,極易導(dǎo)致誤診、漏診[1]?，F(xiàn)階段,骨髓形態(tài)學(xué)是臨床診斷MM的常用方法,通過觀察單克隆免疫球蛋白表達(dá)及骨性骨質(zhì)破壞情況來判斷,但難以區(qū)分部分情況良好的漿細(xì)胞和正常細(xì)胞形態(tài)學(xué),且存在一定的主觀性,臨床診斷較為困難[2]。免疫組化根據(jù)原抗體特異性結(jié)合的原理,可有效提高診斷準(zhǔn)確性,辨別良惡性及疾病的嚴(yán)重程度[3]。流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)結(jié)合力分子生物學(xué)、生物學(xué)、單克隆抗體激光技術(shù)及分子免疫學(xué),可進(jìn)行多個(gè)物理化學(xué)參數(shù)的檢測(cè),特異性高,可準(zhǔn)確判斷目標(biāo)將細(xì)胞群的單克隆性,可用于檢測(cè)腫瘤性漿細(xì)胞的殘留[4]。這些診斷方法均具有各自優(yōu)劣勢(shì),基于此,本研究選取了78例MM患者,將重點(diǎn)觀察形態(tài)學(xué)、免疫組化及FCM在MM中的診斷價(jià)值,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 資料 回顧性分析2020年1月—2021年12月南陽市人民醫(yī)院診治的78例MM患者臨床資料。其中男48例,女30例;國際分期體系(international staging system,ISS)分期:Ⅲ期7例,Ⅱ期38例,Ⅰ期33例;年齡41～79(59.37±5.62)歲;免疫球蛋白分型:IgG型42例,IgA型22例,輕鏈型8例,不分泌型6例。納入標(biāo)準(zhǔn):符合MM的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5];均接受FCM、形態(tài)學(xué)及免疫組化檢測(cè);資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):存在急性感染性疾病;合并其他惡性腫瘤;有既往精神病史或認(rèn)知功能障礙。

1.2 方法

1.2.1 取材方法 常規(guī)骨髓穿刺,抽取骨髓液(0.2 mL)涂片,進(jìn)行形態(tài)學(xué)及免疫組化檢查,抽取骨髓液(2 mL),放于肝素抗凝管,行FCM檢測(cè)。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 選擇染色清晰、制作良好,并可鑒定細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的形態(tài)特征骨髓涂片,行瑞氏-吉姆薩染色,顯微鏡分類,計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞,漿細(xì)胞≥20%,且出現(xiàn)形態(tài)異常為MM判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 FCM 采用FACS-Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司),獲取20 000個(gè)細(xì)胞,標(biāo)記細(xì)胞表面抗原、細(xì)胞內(nèi)抗原,對(duì)數(shù)取樣,通過CD45/CD138設(shè)門,設(shè)定待檢細(xì)胞群,目的細(xì)胞群的抗原表達(dá)>10%為MM陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 免疫組化 采用直接標(biāo)記法進(jìn)行骨髓細(xì)胞染色;陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為:低倍鏡下選擇涂片(薄厚適中、均勻、抗原表達(dá)顯著),高倍鏡下細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜均表現(xiàn)為棕黃色均勻顆粒,CD138陽性及l(fā)ambda陽性在胞漿、胞膜,Kappa陽性在胞漿;陰性表達(dá)為不顯色或淺淡,顯微鏡鏡下計(jì)數(shù)核細(xì)胞200個(gè),各抗體陽性細(xì)胞所占百分比>10%為陽性。試劑盒均購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.2.5 觀察指標(biāo) 統(tǒng)計(jì)形態(tài)學(xué)、免疫組化及FCM陽性檢測(cè)結(jié)果并比較;觀察FCM、免疫組化檢測(cè)MM異常漿細(xì)胞抗原表達(dá)情況(lambda、CD38、Kappa、CD138、CD45及CD19);對(duì)FCM、免疫組化及形態(tài)學(xué)檢測(cè)異常細(xì)胞群占比進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果 78例MM患者,經(jīng)形態(tài)學(xué)檢查顯示,存在不同程度的免疫球蛋白增加及正色素性貧血,漿細(xì)胞異常增生。

2.2 免疫組化、FCM檢查結(jié)果 78例MM患者經(jīng)免疫組化檢查顯示,CD138陽性表達(dá)率為100.00%,Kappa、Lambda陽性表達(dá)率分別為71.78%、25.64%。經(jīng)FCM檢查顯示,CD38、CD138陽性表達(dá)均為100.00%,CD45表達(dá)異常。見表1。

表1 免疫組化、FCM檢查在MM異常漿細(xì)胞抗原的表達(dá)

表2 免疫組化、FCM檢測(cè)MM陽性情況

2.4 形態(tài)學(xué)、免疫組化、FCM檢測(cè)異常細(xì)胞群比較 形態(tài)學(xué)檢查骨髓瘤細(xì)胞占比為(59.82±6.73)%;免疫組化檢查骨髓瘤細(xì)胞占比為(34.67±5.62)%;FCM檢查骨髓瘤細(xì)胞占比為(36.22±6.74)%。形態(tài)學(xué)檢查骨髓瘤細(xì)胞占比高于免疫組化、FCM檢查,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=380.063,P<0.001)。免疫組化、FCM檢查骨髓細(xì)胞瘤占比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

MM是惡性免疫分泌異常性疾病常見類型,主要因骨髓中的漿細(xì)胞異常增生、單克隆免疫球蛋白分泌過度所致。據(jù)有關(guān)流行病學(xué)研究[6]顯示,該疾病在所有惡性腫瘤中占比約為1%,在所有血液惡性腫瘤中占比在13%左右,全球每年新發(fā)MM病例可達(dá)86 000例。MM患者臨床表現(xiàn)復(fù)雜,起病情況各不相同,且缺乏特異性,有較高的誤診率[6]。隨著國際骨髓瘤工作小組對(duì)MM診斷標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步更新,使得MM的診斷也更加精細(xì)化,其重要性也逐漸得到人們的認(rèn)可。臨床可用于MM診斷的方法較多,傳統(tǒng)采用血清學(xué)檢測(cè),通過實(shí)施血清蛋白電泳和免疫固定電泳(SPEP/IFE)及輕鏈檢測(cè),能夠在大部分患者檢測(cè)出單克隆蛋白。但是在采用該方法時(shí),還需輔助應(yīng)用其他方法來確定疾病狀態(tài)。雖然24 h尿SPEP/IFE在MM患者的疾病監(jiān)測(cè)過程中具有一定作用,但是該實(shí)驗(yàn)方法相對(duì)較為繁瑣,且標(biāo)本采集方面不完備,檢驗(yàn)結(jié)果可靠性較低。因此,隨著現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷進(jìn)步,24 h尿SPEP/IFE的應(yīng)用也變得不再重要。所有新診斷的MM都需要經(jīng)歷骨髓活檢,骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、免疫組化、FCM檢測(cè)免疫表型等成為臨床診斷MM的重要手段。

骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查是MM的重要診斷方法,獲取骨髓液容易,細(xì)胞形態(tài)清楚,操作簡單,在臨床應(yīng)用廣泛,通過骨髓穿刺、涂片,對(duì)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)情況進(jìn)行觀察,可有效判斷MM,觀察患者的骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變情況,可有效診斷MM[7]。但因腫瘤性漿細(xì)胞形態(tài)多樣,MM細(xì)胞大小既可以是大于正常漿細(xì)胞,也可以小于正常漿細(xì)胞或正常大小,骨髓瘤細(xì)胞與正常漿細(xì)胞的相似度較高,尤其是對(duì)于反應(yīng)性漿細(xì)胞增多癥、巨球蛋白血癥進(jìn)行鑒別診斷時(shí),患者的骨髓形態(tài)表現(xiàn)為MM相似,通過形態(tài)學(xué)特征無法做出準(zhǔn)確的診斷[8]。另外,由于骨髓涂片以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ),缺乏免疫表型支持,具有較強(qiáng)的主觀性。在漿細(xì)胞數(shù)量較少,異型性較小的情況下,骨髓涂片的診斷價(jià)值較低,難以與正常骨髓和反應(yīng)性漿細(xì)胞增生區(qū)別開來。因此,臨床僅依靠骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)對(duì)MM進(jìn)行診斷較為困難,可考慮將其作為輔助手段。

免疫組化根據(jù)原抗體特異性結(jié)合的原理,可有效提高診斷準(zhǔn)確性,辨別良惡性及疾病的嚴(yán)重程度[9]。FCM是診斷MM的重要手段,可準(zhǔn)確、快捷、敏感的定量檢測(cè)單核細(xì)胞膜上或胞內(nèi)表達(dá)的多種抗原,具有很高的客觀性,全面評(píng)估骨髓瘤的髓外浸潤、復(fù)發(fā)等多個(gè)方面,為MM的診斷提供重要參考依據(jù)[10]。FCM免疫表型檢測(cè)主要依賴于表面蛋白的差異表達(dá),能夠幫助臨床醫(yī)生準(zhǔn)確區(qū)分正常漿細(xì)胞與惡性漿細(xì)胞。有研究[11]表明,正常情況下的漿細(xì)胞,會(huì)表達(dá)CD138、CD45以及CD19,而MM患者的漿細(xì)胞會(huì)表達(dá)CD56、CD38、CD117與CD138,但是不會(huì)表達(dá)CD27。在骨髓標(biāo)本制備欠佳,漿細(xì)胞在骨髓內(nèi)表現(xiàn)為間質(zhì)性及灶性浸潤時(shí),準(zhǔn)確識(shí)別及定量漿細(xì)胞的難度較大,會(huì)增加臨床對(duì)MM的難度。在這種情況下,骨髓活檢可同時(shí)聯(lián)合免疫組化等方式,進(jìn)一步提高疾病診斷率,降低漏診率。

本研究結(jié)果顯示,78例MM患者,經(jīng)形態(tài)學(xué)檢查顯示,存在不同程度的免疫球蛋白增加及正色素性貧血,漿細(xì)胞異常增生;經(jīng)免疫組化檢查顯示,CD138陽性表達(dá)率為100.00%,Kappa、Lambda陽性表達(dá)率分別為71.78%、25.64%。經(jīng)FCM檢查顯示,CD38、CD138陽性表達(dá)均為100.00%,CD45表達(dá)異常,免疫組化、FCM診斷MM陽性符合率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明形態(tài)學(xué)、免疫組化及FCM在MM的診斷中均有較高診斷符合率。分析原因:形態(tài)學(xué)檢測(cè)具有操作簡單、快速的優(yōu)點(diǎn),固定骨髓細(xì)胞后,形態(tài)一般清晰,利于辨認(rèn),更利于對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)染色及免疫組化進(jìn)一步檢查,不僅可判斷骨髓細(xì)胞形態(tài)是否正常,明確骨髓增生情況,有效診斷MM[11]。但MM漿細(xì)胞呈單克隆表達(dá)模式,κ和λ為多克隆模式,多以少量至中等量κ為主,僅依靠形態(tài)學(xué)診斷MM較為困難[12]。而免疫組化存在一定主觀性,對(duì)于漿細(xì)胞數(shù)量少,其診斷價(jià)值低下,對(duì)于正常骨髓及反應(yīng)性漿細(xì)胞增生難以區(qū)分。FCM對(duì)所有組織細(xì)胞均可進(jìn)行分析,并同時(shí)并列分析單個(gè)細(xì)胞的多方面特征,并定量分析細(xì)胞,但也會(huì)受到操作的影響,降低對(duì)MM的診斷效果[13]。

此外,本研究結(jié)果還顯示,形態(tài)學(xué)檢查骨髓瘤細(xì)胞占比高于免疫組化、FCM檢查,說明在檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞占比中形態(tài)學(xué)檢查更具優(yōu)勢(shì)。分析其原因可能在于:細(xì)胞形態(tài)學(xué)所得標(biāo)本為涂片,溫室狀態(tài)下烘干較快,骨髓液中的細(xì)胞相對(duì)穩(wěn)定,標(biāo)本存放時(shí)間及運(yùn)輸過程對(duì)標(biāo)本本身影響較小;受各種因素影響免疫組化會(huì)造成細(xì)胞分布不均勻,引起不同計(jì)數(shù)區(qū)域的骨髓瘤細(xì)胞所占比例有較大的差異性[14]。而FCM所需骨髓液抽出后放置在試管中,在運(yùn)輸過程可能會(huì)因碰撞導(dǎo)致漿細(xì)胞或其他細(xì)胞破裂,或因抽取骨髓液未輕輕搖試管促使血液凝固,加上標(biāo)本送檢不及時(shí)導(dǎo)致長時(shí)間的標(biāo)本存放,導(dǎo)致血液細(xì)胞成分發(fā)生變化或細(xì)胞表型發(fā)生改變,導(dǎo)致FCM測(cè)得的骨髓瘤細(xì)胞占比較低[15]。

綜上所述,形態(tài)學(xué)、免疫組化及FCM在MM的診斷中均有較高診斷符合率,應(yīng)根據(jù)患者的具體情況,結(jié)合三者的特點(diǎn)或聯(lián)合使用,以提高臨床診斷價(jià)值。