皖西大別山板栗蒸餾酒釀造工藝優(yōu)化

朱其順,李其琴,顏守保

(淮南師范學(xué)院 生物工程學(xué)院,安徽 淮南 232038)

板栗含有大量淀粉及蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、磷、鐵及多種維生素和微量元素,素有“千果之王”的美稱,同時亦是一種物美價廉、富有營養(yǎng)的滋補(bǔ)品。中醫(yī)認(rèn)為,板栗有養(yǎng)胃健脾,補(bǔ)腎強(qiáng)筋,活血、止血之功能,并有益于高血壓、冠心病的防治。我國板栗種植面積較廣,占世界種植面積的80%,年產(chǎn)量超過100×104t,居世界首位,但板栗貯藏性能差,易損耗。據(jù)調(diào)查,我國每年因貯藏不當(dāng)造成的板栗損耗率在30%以上,這嚴(yán)重地影響了板栗的經(jīng)濟(jì)效益。對于板栗的加工利用,目前國內(nèi)已有相關(guān)的研究成果,如:利用板栗加工面包[1]、釀制板栗果酒[2]、制作板栗飲料[3-4]等。而以板栗為主要原料釀制蒸餾酒,國內(nèi)尚未有相關(guān)文獻(xiàn)研究。

板栗是皖西大別山區(qū)盛產(chǎn)的重要堅果,年產(chǎn)量約25～28萬t[5],淀粉含量較高,適于做釀酒的原料。本研究以濃香型白酒大曲中分離篩選獲得優(yōu)良酵母菌為釀造菌種,通過秸稈纖維素固定化酵母細(xì)胞、原料配比和發(fā)酵工藝優(yōu)化等手段開發(fā)板栗蒸餾酒,并進(jìn)行質(zhì)量評價,為進(jìn)一步應(yīng)用推廣提供參考依據(jù)。

一、材料和方法

(一)供試材料

板栗,一等品,產(chǎn)地安徽金寨;大麥芽,優(yōu)級,產(chǎn)地澳大利亞;玉米,優(yōu)級,產(chǎn)地安徽淮南;糯米,優(yōu)質(zhì),產(chǎn)地安徽鳳臺;α-淀粉酶(3 000 U/m L;p H值,4.0～5.5;溫度:50～60 ℃);糖化酶(100 000 U/m L;p H 值,4.0～4.5;溫度,58～60 ℃);纖維素酶(20 000 U/m L;p H 值,4.8～5.2;溫度,55～60 ℃)。

斜面培養(yǎng)基配制:葡萄糖20 g,蛋白胨10 g,酵母浸膏5 g,瓊脂粉15～20 g,溶化后加蒸餾水定容至1 L,121 ℃滅菌25 min。

YEPD 培養(yǎng)基配制:蛋白胨10 g,葡萄糖50 g,酵母浸膏10 g,瓊脂15～20 g,蒸餾水1 000 m L,自然p H,用于酵母的分離、培養(yǎng)和增殖。

(二)發(fā)酵菌種的獲得

1.菌株篩選

取1 g白酒大曲加入99 m L 的無菌水,制成10-2g/m L的大曲懸液置于三角瓶中。梯度稀釋后,取稀釋菌液1μL,涂布于YEPD 培養(yǎng)基上,在30 ℃下,培養(yǎng)48 h后,對培養(yǎng)皿長出的不同菌落特征和不同聞香氣味的酵母菌做標(biāo)記,再經(jīng)多次平板劃線,獲得純菌株,4 ℃條件下保藏。

2.菌株發(fā)酵能力分析

將200 m L麥芽汁(濃度為250 g/L)加入250 m L三角瓶中,滅菌后,在無菌條件下分別加入10%純種酵母菌種子液(調(diào)整濃度為1×107個/m L),30 ℃下靜置培養(yǎng)7 d,發(fā)酵結(jié)束后檢測酒精度和殘?zhí)橇俊?/p>

3.發(fā)酵產(chǎn)物中可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)評價

稱取一定量的板栗仁,洗凈后置于蒸籠蒸30 min,按照1∶2.5的比例加入水,經(jīng)粉碎打漿后,轉(zhuǎn)入藍(lán)口玻璃瓶中,按照20 U/g板栗的用量加入α-淀粉酶,并在95 ℃水浴中液化0.5～1 h;液化結(jié)束后,將混合物降溫至60 ℃以下并調(diào)整p H至4.5,然后按照100 U/g板栗的添加量加入糖化酶,60 ℃條件下保溫10～12 h。經(jīng)過固液分離得到的糖液分裝入250 m L三角瓶中,113℃條件下滅菌10 min。各組滅菌冷卻后,分別按照10%接種量接入酵母種子液,30℃條件下發(fā)酵7 d后,再分別取100 m L 發(fā)酵液放入蒸餾瓶中,同時加入100 m L 水,加熱蒸餾出100 m L 冷凝液通過GC-MS分析其中可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

4.酵母發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味感官評價

將上述1.2.3中板栗發(fā)酵液經(jīng)壺式二次蒸餾后獲得的酒液進(jìn)行風(fēng)味感官評價,評定樣品的感官特性和整體特征。

(三)玉米秸稈固定化酵母細(xì)胞

1.玉米秸稈的纖維酶修飾

干玉米秸稈纖維組織呈多孔狀,是酵母細(xì)胞固定化的良好載體,能提高乙醇生產(chǎn)率。具有環(huán)境友好、強(qiáng)度高、分批發(fā)酵、無毒、通透性好,適于細(xì)胞生長繁殖的優(yōu)點。研究利用纖維素酶對玉米秸稈表面進(jìn)行適當(dāng)修飾,增大纖維比表面積,解決了酵母細(xì)胞吸附于載體的表面而易脫落、穩(wěn)定性較差的缺點。

干玉米秸稈取自安徽省淮南市郊區(qū),剝除外皮后,然后剪成小塊(約2 cm×2 cm),用水清洗后,放入(50±0.5)℃烘箱中備用。將60 g預(yù)處理后的玉米秸稈小塊、240 g的醋酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L)和纖維素酶(5 000 U)分別轉(zhuǎn)入1 000 m L燒杯中,在55 ℃、p H5.0條件下分別酶解0、2、4和6 h。酶解反應(yīng)結(jié)束后,將玉米秸稈小塊用水清洗至洗液p H 為中性,再放入(50±0.5)℃烘箱烘至恒重,備用。

2.優(yōu)質(zhì)酵母菌增殖培養(yǎng)

取數(shù)環(huán)分離篩選獲得優(yōu)質(zhì)菌株斜面種子接入裝有100 m L增殖培養(yǎng)基的250 m L三角瓶中,30℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)24 h,制得酵母細(xì)胞懸浮液,備用。

3.酵母細(xì)胞的固定化

酵母細(xì)胞經(jīng)過增殖培養(yǎng)后在4 000 r/min、4℃下離心10 min,收集酵母細(xì)胞,配制成濃縮液,并控制酵母細(xì)胞濃度為1.0×108～10.0×108個/m L。將30 g經(jīng)修飾處理后的干玉米秸稈浸入100 m L 酵母細(xì)胞濃縮液(4.6×108個/m L)中,在(30±0.5)℃、160 r/min搖床下振蕩混合24 h 后,轉(zhuǎn)入100 m L 增殖培養(yǎng)基中(30±0.5)℃、160 r/min搖床下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后,在無菌條件下轉(zhuǎn)入三角瓶或固定化細(xì)胞反應(yīng)器中用作乙醇發(fā)酵。

(四)釀造工藝

圖1 板栗蒸餾酒釀造工藝流程圖

板栗蒸餾酒釀造主要工藝流程如下。

(1)配料和預(yù)處理:將板栗、大麥、玉米和糯米按照一定比例配料,其中板栗、玉米和糯米洗凈后分別浸入1.5倍體積水中浸泡約1 h;

(2)蒸煮:將浸泡好的板栗、玉米和糯米撈出,分別置于蒸籠蒸30 min;

(3)打漿:蒸煮后的板栗和玉米移入組織勻漿機(jī)中,加入適量水進(jìn)行粉碎打漿;

(4)液化:將板栗、玉米漿液與蒸熟后的糯米(不需打漿)轉(zhuǎn)入藍(lán)口玻璃瓶中,按照20 U/g混合原料的用量加入α-淀粉酶,95 ℃水浴液化0.5～1 h;

(5)糖化:將上述液化混合物料降溫至60 ℃以下并調(diào)整p H 至4.5,添加粉碎后的大麥芽,60℃保溫10～12 h;

(6)固液分離:糖化后混合物料經(jīng)過濾后獲得糖化醪液,調(diào)節(jié)p H 至5.0;

(7)接種:向上述糖化醪液中接入一定量的固定化酵母細(xì)胞,混勻后30℃條件下靜置發(fā)酵7 d;

(8)固液分離:將發(fā)酵成熟醪液再次過濾,過濾后剩余固定化酵母細(xì)胞用無菌水洗滌后用于下一批次發(fā)酵;

(9)蒸餾:將過濾后的發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾。采用二次蒸餾法,第一次蒸餾將其中揮發(fā)性成分蒸出,酒精度大約為20%vol～25%vol;將一次蒸餾酒液繼續(xù)二次蒸餾,獲得酒精度約為60%vol原酒;

(10)儲藏、調(diào)配:將流程(9)中所獲得原酒放入新橡木桶中儲藏6 個月后,移出降度調(diào)配成40%vol左右的成品酒。

(五)釀造原料配比優(yōu)化

試驗基于1.4中板栗蒸餾酒釀造方法,將板栗、大麥芽、糯米、玉米按照不同比例配料,各試驗處理總固體重量為300 g,液化時固液比為1∶2.5。對獲得板栗蒸餾酒原酒進(jìn)行感官評價,確定最佳原料配比。

(六)釀造工藝參數(shù)優(yōu)化

1.固定化細(xì)胞不同接種量對板栗蒸餾酒釀造的影響

基于1.5中的最佳試驗條件,將糖化醪液中分別接入2%、4%、6%和8%(m/v)的固定化酵母細(xì)胞,按照1.4中方法獲得板栗蒸餾酒原酒,并進(jìn)行感官評價。

2.不同溫度對板栗蒸餾酒釀造的影響

基于1.6.1中的最佳試驗條件,將1.4(7)中糖化醪液接入固定化酵母細(xì)胞,分別置于20、25、30、32和34 ℃條件下,靜置發(fā)酵7 d,對成熟發(fā)酵醪液測定酒精度,按照1.4(9)中方法蒸餾獲得板栗蒸餾酒原酒,并進(jìn)行感官評價。

3.不同起始p H 對板栗蒸餾酒釀造的影響

基于1.6.2中的最佳試驗條件,將1.4(6)中糖化醪液p H 分別調(diào)節(jié)至4.0、4.5、5.0、5.5 和6.0;其它步驟同1.6.2。獲得的成熟發(fā)酵醪液測定酒精度,按照1.4(9)中方法蒸餾獲得板栗蒸餾酒原酒,并用于感官評價。

4.不同發(fā)酵時間對板栗蒸餾酒釀造的影響

基于1.6.3中的最佳試驗條件,將1.4(7)中糖化醪液分別接入最佳量固定化酵母細(xì)胞,置于最佳溫度條件下,分別靜置發(fā)酵5、6、7、8、9 和10 d;其他步驟同1.6.3。獲得的成熟發(fā)酵醪液測定酒精度,按照1.4(9)中方法蒸餾獲得板栗蒸餾酒原酒,并用于感官評價。

(七)確定糖化后濾渣清洗次數(shù)

糖化后過濾殘渣中殘留較多的糖分,為充分利用原料,基于1.6.4中的最佳試驗條件,于上一批次1.4(6)中固液過濾后獲得的殘渣加入70 ℃熱水(固液比為1∶1),70 ℃條件下攪拌混合30 min后,3 000 r/min離心10 min,獲得濾液用于本批次板栗蒸餾酒釀造工藝水。按照相同方法分別洗滌0 次、1 次、2 次和3 次,其他步驟同1.6.4。清洗后的濾渣測定殘留還原糖含量,獲得的成熟發(fā)酵醪液測定酒精度。

(八)分析方法

酒精度測定采用蒸餾比重法[6](P653);還原糖含量的測定采用DNS 法(APHA,American Public Health Association);固定化載體中細(xì)胞生物量的測定采用重力法[7]。

1.可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

(1)頂空固相微萃取(HS-SPME)條件。選取50μm/30μm DVAB/CAR/PDMS 固相微萃取頭,第一次使用需要在氣相色譜進(jìn)樣口在230 ℃下老化5 min。

萃取條件:精確稱取3.0 g樣品放入頂空瓶中,蓋上瓶蓋,于60℃水浴超聲波震蕩儀中平衡15 min,然后于60 ℃水浴頂空萃取30 min,將萃取頭取出插入GC-MS 進(jìn)樣口解吸4 min,進(jìn)行GC-MS分析。

(2)氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析條件。

氣相色譜條件:DB-WAX 色譜柱(60 m×250μm×0.25μm);手動不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣口溫度230 ℃;程序升溫:40 ℃保持1 min,5 ℃/min的升溫速率到180 ℃,保持1 min,最后以8 ℃/min升溫到230 ℃,保持7 min;載氣:高純度氦氣,流速為1 m L/min。

質(zhì)譜條件:EI電離源,電子能量70 e V,掃描質(zhì)量范圍20～550 u,離子源溫度230 ℃,接口溫度230 ℃。

GC-MS分析:用50μm/30μm DVAB/CAR/PDMS固相微萃取頭,美國Agligent公司;自動SPME進(jìn)樣器,美國Agligent公司;15 m L 帶硅橡膠墊的樣品瓶,美國Agligent公司;Agligent 7890N-5975B氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Agligent公司。

(3)定性與定量分析。

定性:對質(zhì)譜揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行檢測,并與標(biāo)準(zhǔn)庫的物質(zhì)(NIST)匹配,匹配度超過800的判定結(jié)果保存。

半定量:以2-辛醇為內(nèi)標(biāo),先將各階段樣品中鑒定的揮發(fā)性化合物的峰面積與2-辛醇峰面積之比來初步判斷,再進(jìn)一步計算這些揮發(fā)性化合物的含量。

2.風(fēng)味感官評價

本研究邀請A 省H 學(xué)院20位食品質(zhì)量與安全專業(yè)的學(xué)生(男生和女生各10名)對酒樣的香氣、口感、風(fēng)味、酸度的感官特性以及產(chǎn)品的整體特征進(jìn)行評定。采用10分制的評價方法對試樣進(jìn)行感官評價。(對香氣、口感、風(fēng)味、酸度進(jìn)行綜合性評定,其中1～4分:綜合體驗感低;5～7分:及格;8～10分:綜合體驗感良好,口感佳。)

3.理化指標(biāo)測定

依據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 12456—2021分析方法測定總酸,依據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10345—2007分析方法測定總酯和可溶性固形物的含量,依據(jù)GB/T 5009.48分析方法檢測甲醇和氰化物的含量。

二、結(jié)果與討論

(一)優(yōu)質(zhì)酵母菌的篩選

通過分離篩選,獲得11株菌落形態(tài)不同和聞香不同的酵母菌。以10%的接種量(調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/m L),分別添加到麥芽汁(30 ℃、糖度250 g/L)中,發(fā)酵7 d,每天觀察發(fā)酵情況(氣泡的產(chǎn)生量和顯微鏡鏡檢),7 d后檢測酒精度和殘?zhí)橇?結(jié)果見表1。

表1 不同酵母菌發(fā)酵能力測試結(jié)果

從表1可以看出,各酵母菌發(fā)酵能力差異很大,其中編號為HN006 的酵母菌綜合發(fā)酵能力最強(qiáng),其酒精度高,殘?zhí)橇康汀?/p>

本研究分別以該11 株菌為發(fā)酵菌株,按照1.4中方法獲得板栗蒸餾酒原酒,通過GC-MS分析其中可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。研究結(jié)果(表2)表明,11種酵母菌發(fā)酵所獲得的板栗蒸餾酒原酒中主要含有11 種可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),包括醇類(4種)、酸類(3種)、酯類(3種)和硅氧烷化合物(1種)。醇類包括丙三醇、異戊醇、2,3-丁二醇、苯乙醇。其中異戊醇為酒中的雜醇油,含量較高時會使酒體辛辣苦澀,并導(dǎo)致“上頭”;丙三醇和2,3-丁二醇有醇甜感;苯乙醇具有玫瑰香氣的風(fēng)味。因此,相對高含量的丙三醇、2,3-丁二醇、苯乙醇對香氣和口感有促進(jìn)作用。從表3中可以看出,酵母菌HN006所獲得的板栗蒸餾酒原酒中含有較高的丙三醇、2,3-丁二醇、苯乙醇,而異戊醇含量相對較少。此外,較高含量的乙酸、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯對形成酒體風(fēng)味具有積極作用。

表2 不同酵母菌種所獲得的板栗蒸餾酒可揮發(fā)性風(fēng)味成分(μg/10 m L)

表3 不同原料配比對板栗蒸餾酒釀造的影響

分別對其11種酵母菌獲得的板栗蒸餾酒原酒進(jìn)行感官風(fēng)味評價,并用Origin 8軟件繪制不同酵母菌種釀造原酒風(fēng)味雷達(dá)圖。結(jié)果(圖2)顯示,酵母菌株HN006 所產(chǎn)板栗蒸餾酒原酒評價得分為:口感8.6分,香氣8.7分,風(fēng)味8.4分,酸度8.3分,總體評價8.5分,均較優(yōu)于其他菌株。綜合上述分析,選擇菌株HN006 為最佳釀造菌株。

圖2 不同酵母菌種釀造原酒風(fēng)味雷達(dá)圖

(二)釀造原料配比優(yōu)化

不同原料配比對板栗蒸餾酒釀造的影響見表3。由表3可見,板栗添加量一定條件下,隨著大麥芽比例的增加,感官評價得分增大,相應(yīng)發(fā)酵液中酒精含量也較高,主要是大麥芽有顯著的麥香以及含有較多的糖分。其中板栗:大麥芽:糯米:玉米為6∶2∶1∶1時,獲得蒸餾酒原酒的感官評價得分最高,為9.2,此時發(fā)酵液中酒精度較高,為7.7(v/v,%)。因此,最佳釀造原料配比為板栗∶大麥芽∶糯米∶玉米=6∶2∶1∶1。

(三)工藝參數(shù)優(yōu)化

1.不同溫度的影響

酵母菌的最適生長溫度一般在20～30 ℃,超過35℃其生長將會受到抑制,種屬之間存在較大的差異。本試驗考察了不同發(fā)酵溫度對板栗蒸餾酒釀造的影響,結(jié)果(圖3)表明,發(fā)酵溫度為25 ℃時獲得了較高的乙醇含量,會生成更多的風(fēng)味物質(zhì),整體感官評價最好,故選擇25 ℃為最佳釀造溫度。

2.不同初始p H 的影響

p H 對菌體的生長和產(chǎn)物的合成具有很大的影響。選擇最適p H 的原則既有利于微生物菌體的生長繁殖,又能獲得較高的產(chǎn)量。本實驗考察了不同初始p H 對板栗蒸餾酒釀造的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同pH 對板栗蒸餾酒釀造的影響

由圖4 可知,在初始p H 為4～5.0 范圍內(nèi)[8](P45),發(fā)酵醪液中乙醇含量隨p H 值的增加而增加;在p H 值為5.0時,乙醇濃度最大為8.2%(v/v);當(dāng)p H 值＞5.0,乙醇含量隨初始p H 值的增加而下降。因此,獲得最佳的發(fā)酵初始p H 值為5.0。

3.不同發(fā)酵時間的影響

由圖5可知,前期隨著發(fā)酵時間的增加,乙醇含量不斷增加,到第7 天時,達(dá)到最大值,為8.2% (v/v),第8天時,乙醇含量變化不明顯,但整體感官評價最佳;隨后,乙醇含量和整體感官評價逐漸下降。因此,選用8 d為最佳發(fā)酵時間。

圖5 不同發(fā)酵時間對板栗蒸餾酒釀造的影響

(四)濾渣清洗次數(shù)的影響

由圖6可知,隨著糖化后濾渣清洗次數(shù)的增加,濾渣中還原糖含量不斷降低,相應(yīng)發(fā)酵醪液中乙醇含量不斷增加,當(dāng)清洗次數(shù)為2時,乙醇含量最高,因此確定糖化后濾渣清洗次數(shù)為2次,并將清洗濾液用于板栗蒸餾酒釀造。

圖6 濾渣清洗次數(shù)對板栗蒸餾酒釀造的影響

(五)成品酒質(zhì)量特性

將成熟發(fā)酵醪液通過壺式蒸餾“兩次蒸餾”工藝獲得板栗蒸餾酒原酒,經(jīng)過新橡木桶儲存6個月后,降度調(diào)配為40%vol蒸餾酒產(chǎn)品。感官評價結(jié)果表明:酒度數(shù)適中,產(chǎn)品呈淺黃色、外觀澄清透明無沉淀;具有板栗、大麥芽、玉米和糯米的復(fù)合香氣以及橡木桶儲存而產(chǎn)生的橡木香氣;香氣濃郁、入口細(xì)膩、滋味醇厚、爽口,具有優(yōu)級威士忌酒感官特征。

對板栗蒸餾酒降度調(diào)配產(chǎn)品主要理化指標(biāo)進(jìn)行測定,結(jié)果詳見表4。

表4 板栗蒸餾酒主要理化指標(biāo)

由表4可知,總酸和總酯含量達(dá)到《威士忌》(GBT 11857—2008)優(yōu)級標(biāo)準(zhǔn),甲醇和氰化物含量均符合食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《蒸餾酒及其配制酒》(GB 2757—2012)的規(guī)定。其中含有微量可溶性固形物,主要與儲酒過程中酒液汲取橡木桶芳香物質(zhì)成分有關(guān)系。

三、結(jié) 論

本研究從濃香型白酒大曲中分離篩選獲得優(yōu)良酵母菌株,然后以板栗、大麥、玉米、糯米為主要原料,在傳統(tǒng)蒸餾酒釀造工藝基礎(chǔ)上,通過秸稈纖維素固定化酵母細(xì)胞、釀造原料配比優(yōu)化、發(fā)酵工藝優(yōu)化和確定糖化后濾渣清洗次數(shù)等手段開發(fā)大別山板栗蒸餾酒,并獲得最佳工藝參數(shù):發(fā)酵溫度為25℃,初始發(fā)酵p H 為5.0,發(fā)酵時間為8 d;通過壺式“兩次蒸餾”工藝獲得的優(yōu)質(zhì)板栗蒸餾酒原酒,經(jīng)過橡木桶儲藏、降度調(diào)配后獲得成品酒。獲得的板栗蒸餾酒成品酒,復(fù)合香氣充足,口感佳;主要理化指標(biāo)均達(dá)到食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)級水平。研究結(jié)果為板栗蒸餾酒釀造和應(yīng)用推廣提供了一定的基礎(chǔ)依據(jù)。