雪上一枝蒿多糖調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制肝癌肺轉(zhuǎn)移機制的研究

彭 磊，張 霞，左愛學(xué)，張建英，李斯文，方肇勤*，萬春平*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650021；3.個舊市人民醫(yī)院，云南 個舊 661000）

雪上一枝蒿（Aconiturn brachypodum Diels，短柄烏頭）為毛茛科烏頭屬植物短柄烏頭的干燥塊根，性溫，味苦、辛，有大毒，功能祛風(fēng)除濕、消腫止痛、通利關(guān)節(jié)。云南的東北部、西北部以及四川的西南部是其主要的分布產(chǎn)地，系重要的南藥品種之一。雪上一枝蒿具有廣泛藥理作用，主要活性成分是烏頭類生物堿?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究已表明，烏頭類生物堿具有多種藥理作用，如鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等[1-4]。然而目前關(guān)于其多糖成分報道較少，利用率較低，在提取過程中多糖成分通常也作為廢棄物棄用。課題組前期研究以云南東川產(chǎn)雪上一枝蒿作為原材料，從中提取、分離、純化出一種雪上一枝蒿的多糖組分XP-10，免疫活性測試實驗結(jié)果顯示XP-10具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性。相關(guān)研究成果已取得發(fā)明專利（專利號：CN107936130 B，雪上一枝蒿多糖及提取方法以及應(yīng)用）。鑒此，本研究擬通過構(gòu)建原發(fā)性肝癌肺轉(zhuǎn)移小鼠動物模型，進(jìn)一步研究雪上一枝蒿多糖XP-10對于原發(fā)性肝癌肺轉(zhuǎn)移的抑制作用及其作用機理，為雪上一枝蒿多糖抗腫瘤免疫療法及南藥植物資源的合理開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 BALB/c小鼠，雄性，7～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，合格證號：SCXK2017-0004。飼養(yǎng)條件：SPF級動物房，恒溫（22±1）℃，恒濕（55±5）%，飼料、飲水均消毒，自由攝取。實驗動物進(jìn)行1周以上適應(yīng)性飼養(yǎng)后使用。嚴(yán)格按照實驗動物相關(guān)管理條例進(jìn)行所有動物實驗。

雪上一枝蒿多糖XP-10由左愛學(xué)博士（云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院）提供，該化合物性狀：焦糖色固體，純度＞75%，易溶于水，具有黏性。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、刀豆蛋白 A（concanavalin A，ConA）和噻唑蘭（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）均購自美國 Sigma公司；Anti-CD3抗體、Anti-Mouse IL-7A-APC、Anti-Mouse Foxp3-Alexa FluorTM488、PEcy7-CD4、Anti-Mouse CD3-APC抗體均購自美國Biolegend公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國 Gbico公司；青霉素購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。

H22小鼠肝癌細(xì)胞，購自中國科學(xué)院昆明動物研究所。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo-fisher，美國）、CantoII流式細(xì)胞儀（BD，美國）、SpectraMax i3X酶標(biāo)儀（MD，美國）。

1.2 肝癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型的構(gòu)建、分組及給藥 肝癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[5]，采用尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞的方法構(gòu)建肝癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型。BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，用75%乙醇消毒小鼠尾部，尾靜脈注射H22腹水瘤細(xì)胞懸液，5×105個/只。2 h后，隨機分為3組，即：肝癌肺轉(zhuǎn)移病理模型組、XP-10低劑量組（250 mg/kg）和 XP-10高劑量組（500 mg/kg），每組8只。以上各組每天灌胃給藥1次，連續(xù)11 d，每天記錄小鼠的生存狀態(tài)和體重。

1.3 肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)目統(tǒng)計 藥物干預(yù)后，處死小鼠，取出全肺，剝離肺臟，用 Bouin氏液固定24 h，無水乙醇漂洗至黃色褪去，鏡下觀察肺內(nèi)腫瘤情況，以單盲法計數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)。

1.4 脾淋巴細(xì)胞懸液的制備 小鼠酒精消毒后，取其脾臟，無菌載玻片輕輕研磨，濾膜過濾，離心10 min，小心吸棄上清，在每只樣本試管中各加入紅細(xì)胞裂解液1 mL，混勻，以使紅細(xì)胞充分裂解，加入1640培養(yǎng)基終止裂解，PBS洗2次，最后加入10% RPMI-1640培養(yǎng)基，并將脾淋巴細(xì)胞濃度調(diào)至4×105個/mL，備用。

1.5 MTT法檢測各組淋巴細(xì)胞增殖功能 常規(guī)制備各組脾淋巴細(xì)胞懸液，按照4×105個/孔接種于96孔板，同時加入2.5 μg/mL絲裂原刀豆蛋白 A（Con A）刺激細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，采用MTT法測定各組OD值，以檢測脾淋巴細(xì)胞的活力。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞表面分子和胞內(nèi)表達(dá)水平 流式細(xì)胞術(shù)檢測參考文獻(xiàn)[6]。對淋巴細(xì)胞表面分子標(biāo)志的染色：各組分別取2×106個脾淋巴細(xì)胞懸液，1 200 rpm離心5 min，棄上清，封閉FcR，再加入帶熒光標(biāo)記的抗體，室溫15 min，進(jìn)行淋巴細(xì)胞表面分子標(biāo)志染色，F(xiàn)AC冼液清冼1次，收集細(xì)胞，完成上機檢測。對淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的染色：各組分別取2×106個小鼠脾淋巴細(xì)胞，加入刺激素PMA、Ionomycin以及阻斷劑BFA，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞，洗液清冼2次，棄上清，封閉FcR，進(jìn)行淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的染色。固定液固定、穿膜液清洗，加入帶有熒光標(biāo)記的抗干擾素γ（interferon gamma，IFN-γ）和白介素 17A（interleukin-17A，IL-17A）抗體。流式細(xì)胞儀檢測胞內(nèi)特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，F(xiàn)lowjo軟件進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，組間差異使用One-Way ANOVA單因素方差分析；若方差不齊，采用LSD法分析；所有實驗數(shù)據(jù)以表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 XP-10干預(yù)能減少肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的肺轉(zhuǎn)移病灶結(jié)節(jié)數(shù) 體外免疫活性篩選結(jié)果提示：XP-10具有顯著的免疫增強活性。為進(jìn)一步評價XP-10體內(nèi)給藥抗腫瘤免疫作用，我們構(gòu)建了肝癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型。結(jié)果顯示，與模型組比較，XP-10（250 mg/kg和500 mg/kg）組顯著減少肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠肺轉(zhuǎn)移病灶結(jié)節(jié)數(shù)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），結(jié)果見圖1和表1。結(jié)果提示：雪上一枝蒿的多糖組分XP-10對H22原發(fā)性肝癌肺轉(zhuǎn)移具有明顯抑制作用且療效顯著，預(yù)測XP-10的臨床應(yīng)用價值較好，具有開發(fā)前景。

圖1 XP-10對肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)的影響

表1 XP-10對肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠肺轉(zhuǎn)移病灶結(jié)節(jié)數(shù)的影響（±s，n=8)

表1 XP-10對肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠肺轉(zhuǎn)移病灶結(jié)節(jié)數(shù)的影響（±s，n=8)

注：與模型組比較，**P<0.01。

組別 劑量（mg/kg） 腫瘤結(jié)節(jié)（個）模型對照組 - 13.63±4.14 XP-10 250 7.00±2.51**500 6.17±4.40**

2.2 XP-10能促進(jìn)肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖 采用MTT法測定各組細(xì)胞在570 nm的OD值，以檢測肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠脾淋巴細(xì)胞的活力，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示：與模型組比較，XP-10低劑量（250 mg/kg）和高劑量（500 mg/kg）組肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的脾淋巴細(xì)胞的活力得到顯著提高（P<0.01）。結(jié)果提示：雪上一枝蒿的多糖組分XP-10可能是通過提高機體的抗腫瘤免疫能力而發(fā)揮抑制H22原發(fā)性肝癌肺轉(zhuǎn)移的作用。

圖2 MTT法檢測XP-10對肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.3 XP-10對肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)無明顯影響 在機體的抗腫瘤免疫效應(yīng)中，T淋巴細(xì)胞，尤其是CD4 T細(xì)胞亞群起到至關(guān)重要的作用，與腫瘤密切相關(guān)。采用流式細(xì)胞術(shù)對XP-10對肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示：與模型組比較，XP-10低劑量（250 mg/kg）和XP-10高劑量（500 mg/kg）組肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞的比例均沒有受到明顯影響，沒有顯著變化（P＞0.05）。提示：XP-10主要影響肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠T淋巴細(xì)胞增殖功能，而對CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)無明顯影響。

圖3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測XP-10對肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)的影響

2.4 XP-10能夠顯著下調(diào)肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠Treg細(xì)胞的表達(dá)水平 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregulatorycells，Treg）是T細(xì)胞的一個亞群，發(fā)揮重要的免疫抑制作用，在免疫逃逸、抗腫瘤免疫及誘導(dǎo)免疫耐受等方面起著很重要的作用。采用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示：相較于模型組，XP-10兩個劑量灌胃組Treg細(xì)胞（Foxp3+CD4+T細(xì)胞）的表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)，其中XP-10低劑量（250 mg/kg）給藥組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.05）。

圖4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測XP-10對肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠Treg細(xì)胞表達(dá)水平的影響

2.5 XP-10對肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠Th1和Th17細(xì)胞的表達(dá)水平無明顯影響 T淋巴細(xì)胞作為細(xì)胞免疫功能的承擔(dān)者，在生物體的免疫反應(yīng)中占據(jù)重要地位，同時T淋巴細(xì)胞亦是免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)者，具有多種生物學(xué)功能。其中Th1和Th17細(xì)胞在機體抗腫瘤免疫方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+的表達(dá)，結(jié)果如圖5所示：與模型組比較，XP-10干預(yù)后，Th1細(xì)胞（IFNγ+CD4）和 Th17細(xì)胞（IL-17+CD4）表達(dá)無顯著變化（P＞0.05）。

圖5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測XP-10對肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠Th1、Th17表達(dá)水平的影響

3 討論

肝癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，死亡率高，在常見消化道腫瘤中排名第3[7]。肝癌也是最難治的惡性腫瘤之一，其難治性表現(xiàn)除惡性程度高，起病隱匿，病情進(jìn)展快等常見惡腫瘤特征外，主要還體現(xiàn)于其高復(fù)發(fā)性和高轉(zhuǎn)移性。肺部器官中血管和淋巴管豐富，因此肺是最常見的肝外轉(zhuǎn)移器官，占肝外轉(zhuǎn)移的39.5%～53.8%，一旦發(fā)生肺轉(zhuǎn)移則治療棘手，嚴(yán)重影響患者預(yù)后，死亡率高[8]。目前西醫(yī)臨床尚無可靠的肝癌肺轉(zhuǎn)移防治方法。大量研究已表明，中醫(yī)藥在對抗化療誘導(dǎo)的副作用、增效減毒和防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等方面具有獨特優(yōu)勢。熱毒、瘀毒證候是肝癌中醫(yī)學(xué)臨床基本證候之一，毒邪致病峻烈、頑固、易相兼為病，臨床治療集中體現(xiàn)為其難治性。研究雪上一枝蒿多糖對于肝癌肺轉(zhuǎn)移的作用及機制可在一定程度上豐富肝癌中醫(yī)證候、治法方藥等方面的理論依據(jù)與科學(xué)證據(jù)。

為評價雪上一枝蒿的多糖組分XP-10對肝癌肺轉(zhuǎn)移的影響，我們通過小鼠尾靜脈注射H22肝腹水瘤細(xì)胞成功構(gòu)建肺轉(zhuǎn)移腫瘤動物模型，造模后可見模型小鼠肺上腫瘤結(jié)節(jié)，體現(xiàn)H22腹水瘤細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況。該方法造模簡單，成模率高，是評價肝癌肺轉(zhuǎn)移模型經(jīng)典模型[3]。從研究結(jié)果來看，使用雪上一枝蒿多糖組分XP-10對肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠進(jìn)行藥物干預(yù)，能顯著減少肝癌肺轉(zhuǎn)移的病灶結(jié)節(jié)數(shù)。結(jié)果提示：XP-10能夠針對H22原發(fā)性肝癌肺轉(zhuǎn)移起到顯著療效。腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸與機體的免疫功能密切相關(guān)，MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖功能顯示，XP-10灌胃給藥顯著激活模型小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，提示XP-10具有顯著抗肝癌肺轉(zhuǎn)移效應(yīng)，其作用機制與提高荷瘤小鼠抗腫瘤免疫效應(yīng)有關(guān)。

T淋巴細(xì)胞在機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在不同刺激因素的作用下，CD4+T細(xì)胞能夠進(jìn)一步分化為Th1、Th17、Treg等功能性T細(xì)胞亞群，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的免疫效應(yīng)，在機體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮不同的功能。Th1細(xì)胞亞群主要在細(xì)胞因子IFN-γ+與IL-12條件下分化，介導(dǎo)機體的細(xì)胞免疫反應(yīng)。Th17主要分泌細(xì)胞因子IL-17，其主要功能是介導(dǎo)機體的炎性反應(yīng)（防御胞外病原菌的感染），具有高致病性[9]。Treg細(xì)胞主要通過分泌免疫抑制因子IL-10和TGF-β發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用，其主要功能介導(dǎo)機體免疫耐受和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性[10]。大量的研究已表明，這些CD4+T細(xì)胞亞群之間的平衡與抗腫瘤免疫反應(yīng)息息相關(guān)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示，雪上一枝蒿多糖組分XP-10能顯著下調(diào)肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞），然而對介導(dǎo)炎癥反應(yīng)Th17細(xì)胞（CD4+IL-17A+T細(xì)胞）和Th1細(xì)胞（CD4+IFN-γ+T細(xì)胞）免疫反應(yīng)無明顯的影響。在肝腫瘤組織和肝轉(zhuǎn)移癌中，CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞大量聚集腫瘤微環(huán)境，這些Treg細(xì)胞被特異激活，高表達(dá)GITR和 ICOS，抑制腫瘤特異性CD4+T細(xì)胞的反應(yīng)，這些結(jié)果表明腫瘤相關(guān)性Treg細(xì)胞與腫瘤逃逸和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11-12]。雪上一枝蒿多糖組分XP-10可能通過抑制Treg細(xì)胞的表達(dá)這一途徑來誘導(dǎo)機體的免疫效應(yīng)，從而起到抑制肝癌肺轉(zhuǎn)移的作用。該研究為我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)中藥組分-雪上一枝蒿多糖XP-10治療肝癌轉(zhuǎn)移提供了一定科學(xué)基礎(chǔ)。