胡 靖,郭 琰,馬雅鴿,趙聲蘭
(云南中醫(yī)藥大學(xué),云南 昆明 650500)
阿爾茲海默?。ˋlzheimer's disease,AD),是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,臨床特征為學(xué)習(xí)記憶障礙和認(rèn)知功能減退[1]。阿爾茨海默病是老年人最為常見的一種癡呆類型,也是老年人最常見的慢性疾病之一,因而,又被稱為老年癡呆。AD發(fā)病機制包括β淀粉樣蛋白的沉積[2]、tau蛋白異常過度磷酸化[3-4]、膽堿能損傷、興奮性氨基酸毒性和免疫炎癥反應(yīng)等[5-7]。目前,有膽堿酯酶抑制劑以及非競爭性N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑(美金剛),但仍無理想的臨床新型抗阿爾茨海默病藥物[8]。近年來的相關(guān)研究表明,傳統(tǒng)中藥三七(Notoginseng Flos)對治療阿爾茲海默病具有良好的療效。孫天賜等[9]基于系統(tǒng)生物學(xué)的角度對三七防治AD的作用機理進(jìn)行研究;鐘振國等[10]以D-半乳糖腹腔注射致亞急性損傷合并鵝膏蕈氨酸損毀雙側(cè)大腦Meynert基底核建立AD大鼠動物模型,使用三七總皂苷進(jìn)行治療,發(fā)現(xiàn)三七總皂苷對AD大鼠模型大腦膽堿能神經(jīng)的病理損害具有保護作用;范亞軍等[11]利用蛋白磷酸酶抑制劑岡田酸(OA)模擬AD病細(xì)胞損傷模型,研究表明三七總皂苷對OA引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有一定的保護作用。三七花是否具有治療阿爾茲海默病的效果,尚未見有報道,本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)對三七花治療阿爾茲海默病的物質(zhì)基礎(chǔ)以及潛在的作用機制進(jìn)行探索和預(yù)測分析研究,以期為三七花防治老年癡呆提供理論依據(jù)。
1.1 三七花活性成分及作用靶點的收集 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine database and analysis platform,TCMSP),(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)輸入關(guān)鍵詞“三七花”檢索。口服生物利用度是藥物篩選的關(guān)鍵參數(shù)[12],因為三七花在日常生活中大多以飲品來使用,故選擇口服生物利用度作為篩選關(guān)鍵參數(shù),根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥15%進(jìn)行篩選[13],得到三七花的主要化學(xué)成分,并匹配相應(yīng)的作用靶點。
1.2 疾病靶點收集 利用DisGeNET數(shù)據(jù)庫(疾病基因數(shù)據(jù)庫,http://www.disgenet.org/) 和 GeneCards 數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),以“Alzheimer's disease”為關(guān)鍵詞檢索阿爾茲海默病相關(guān)靶點,將2個數(shù)據(jù)庫的靶點進(jìn)行歸并得到與阿爾茲海默病相關(guān)的基因和靶蛋白信息。
1.3 三七花化合物-靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將三七花活性成分對應(yīng)的靶點和阿爾茲海默病相關(guān)的靶點進(jìn)行比較,獲得二者共有的靶點,然后使用Cytoscape 8.0圖形化網(wǎng)絡(luò)分析和編輯軟件,進(jìn)行“三七花活性化合物-疾病靶點”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點表示三七花活性成分、疾病相關(guān)靶點,網(wǎng)絡(luò)中的邊用來連接藥物與活性成分、活性成分與關(guān)鍵靶點,疾病與關(guān)鍵靶點;網(wǎng)絡(luò)中一個節(jié)點的度表示和節(jié)點相連的條數(shù),度值越大說明這個節(jié)點越可能是關(guān)鍵節(jié)點[14]。
1.4 GO功能富集和KEGG信號通路分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫對三七花改善阿爾茲海默病的靶點進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析,將所交集后的基因靶點名輸入Multiple Gene List,上傳后選擇“H.sapiens”進(jìn)行個性化分析,點擊Enrichment選擇通路進(jìn)行分析。
1.5 蛋白互做網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 STRING是搜索已知蛋白和未知蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫,為了闡述三七花改善阿爾茲海默病的相互作用關(guān)系,將1.3得到三七花改善阿爾茲海默病靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫,物種選擇“human”,該數(shù)據(jù)庫可以對蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系進(jìn)行打分,分值越高表明相互作用的置信度越高[15],本文將相互作用評分設(shè)置為中置信度(0.400),得到三七花改善阿爾茲海默病的相互作用關(guān)系圖(PPI)。
1.6 分子對接 為了確定網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測三七花改善記憶靶點的準(zhǔn)確性,采用分子對接技術(shù)進(jìn)行驗證。將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中評分較高的蛋白與KEGG結(jié)果中靠前的通路進(jìn)行比較分析,得到準(zhǔn)備驗證的關(guān)鍵靶點,將靶點輸入PDB數(shù)據(jù)庫,選擇最佳的蛋白晶體結(jié)構(gòu),并從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載三七花化學(xué)成分2D結(jié)構(gòu)式,通過chem3D軟件將其優(yōu)化,將關(guān)鍵靶點的蛋白結(jié)構(gòu)、三七花主要成分結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入到AutoDock-Tools在線平臺進(jìn)行分子對接前處理,之后使用命令提示符進(jìn)行對接,預(yù)測潛在蛋白質(zhì)的結(jié)合位點,使用Vinascore軟件對其打分,查看其分子對接的親和力,用PyMOL軟件進(jìn)行分子對接并作圖。
2.1 三七花活性成分及其潛在作用靶點篩選結(jié)果從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)通過OB≥15%篩選得到三七花化學(xué)成分共38種,其中血腦屏障透過率(BBB)較好的有beta-bourbonene(β-波旁烯)、alpha-cubebene(Alpha-蓽澄茄油烯)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)等成分。血腦屏障透過率較低的可通過修飾和劑型選擇加以提高。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)得到上述已知三七花38種成分中有作用靶點的成分25個,使用uniprot數(shù)據(jù)庫匹配相應(yīng)的作用靶點,得到64個作用靶點(見表1)。
2.2 疾病相關(guān)的靶點 利用DisGeNET數(shù)據(jù)庫,以“Alzheimer's disease”為關(guān)鍵詞檢索阿爾茲海默病相關(guān)靶點,獲取到已知與阿爾茲海默病相關(guān)的基因和靶蛋白信息123個。同時利用GeneCards數(shù)據(jù)庫,以“Alzheimer's disease”為關(guān)鍵詞檢索阿爾茲海默病相關(guān)靶點,以score大于1為條件篩選,獲取到已知與阿爾茲海默病相關(guān)的基因和靶蛋白信息有3 508個。
2.3 三七花活性成分作用靶點-疾病靶點的交集 將三七花活性成分對應(yīng)的作用靶點和疾病相關(guān)的靶點進(jìn)行交集,交集后的得到交集靶點34個(如表2所示)。
表2 三七花活性成分與老年癡呆疾病的交集靶點
2.4 三七花活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 構(gòu)建“中藥化合物-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)[16],如圖1。網(wǎng)絡(luò)中共有3部分內(nèi)容,紅色為通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出來的活性成分25個,其中與疾病靶點相交的成分有23個;藍(lán)色為阿爾茲海默病;綠色為活性成分作用靶點與疾病相關(guān)靶點相交互的靶點34個,分別是CHRM1、CHRM2、PTGS2、ADRB2、SLC6A4、PTGS1、RELA、IL10、CALM1、MAOB、HTR3A、SLC6A2、ADRA1A、BAX、EIF6、TP53、CCNB1、RHOA、BCL2、SLC6A3、ADH1C、ADH1A、PIK3CG、HTR2A、OPRM1、TNF、CASP9、JUN、IL6、CASP8、PON1、CASP3、MAP2、BCHE。通過Cytoscape計算網(wǎng)絡(luò)參數(shù),得到三七花活性成分和靶點作用關(guān)系[17]。三七花中化學(xué)成分按節(jié)點度值排序由高到低依次是 β-谷甾醇(19)、β-欖香烯(12)、β-石竹烯(9)、(-)-異香木蘭烯(8)、β-桂烯(8)、西多糖苷(7)、棕櫚酸甲酯(7)、β-波旁烯(6)、冰片(6)、β-立方體蛋白(5)、(1R,4aR,8aS)-1-異丙基-7-甲基-4-亞甲基-2,3,4a,5,6,8a-六氫-1H-萘(5)、EEE(4)、蓽澄茄油烯(4)、糠醇(3)、T-依蘭油烯(3)、糠醛(3)、苯乙醛(3)、(1R)-(+)-樟腦(3)、α-古蕓烯(3)、正庚烷(2)、甲酸混酯(2)、辛酸乙酯(2)、甲酸丙酯(2)。這些化學(xué)成分被諸多學(xué)者認(rèn)為可能是改善阿爾茲海默病的物質(zhì)基礎(chǔ)。
圖1 三七花活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)
同時節(jié)點度值較高的靶點是CHRM1(毒蕈堿乙酰膽堿受體M1)、CHRM2(毒蕈堿乙酰膽堿受體M2)、PTGS2(前列腺素 G/H 合成酶 2)、PTGS1(前列腺素G/H合成酶1)、ADH1C(醇類脫氫酶1C)等。詳細(xì)參數(shù)見圖2。
圖2 靶點節(jié)點度值
2.5 GO和KEGG富集分析 用Metascape數(shù)據(jù)庫對三七花改善阿爾茲海默病的靶點進(jìn)行GO功能富集和 KEGG通路分析,得到圖3,GO分析得到的主要通路為對異物刺激的反應(yīng)(response to xenobiotic stimulus)、細(xì)胞對有機環(huán)狀化合物的反應(yīng)(cellular respose to organic cyclic compound)、對糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)(response to glucocorticoid)、對無機物的反應(yīng)(response to inorganic substance)、離子運輸?shù)恼{(diào)節(jié)(regulation of ion transport)、調(diào)節(jié)神經(jīng)元的凋亡過程(regulation of neuron apoptotic process)、膜筏(membrane raft)以及蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of protein phosphorylation) 等;KEGG 富集主要通路為脂質(zhì)和動脈硬化(lipid and atherosclerosis)、C型凝集素受體信號傳導(dǎo)途徑(C-type lectin receptor signaling pathway)、5-羥色胺突觸(serotonergic synapse)以及神經(jīng)營養(yǎng)劑(neurotrophin signaling pathway)等。詳細(xì)參數(shù)見表3。
圖3 圖a為GO分析,圖b為KEGG富集分析
表3 GO分析與KEGG富集分析參數(shù)
2.6 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心基因分析 將三七花改善阿爾茲海默病的靶點輸入到String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析,獲得靶點蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4),共有34個節(jié)點和132條相互作用連線,節(jié)點平均數(shù)為7.76。將圖導(dǎo)入Cytoscape,依據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度值排序,得到前五個關(guān)鍵靶點蛋白依次為IL6(白介素-6)、TNF(腫瘤壞死因子)、CASP3(鈣化酶-3)、TP53(細(xì)胞腫瘤抗原P53)、PTGS2(前列腺素G/H合成酶和環(huán)氧酶2)。由PPI圖4可知這些關(guān)系來自3大類:已知交互,預(yù)測的相互作用以及其它。已知交互多來自于數(shù)據(jù)庫和實驗證明,預(yù)測的相互作用來自基因共同產(chǎn)生,其他來自于文本挖掘。
圖4 三七花改善阿爾茲海默病靶蛋白互做(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖
2.7 分子對接 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)中評分較高的蛋白可以認(rèn)為起到重要作用,將評分較高的潛在蛋白相對應(yīng)的靶點與KEGG通路分析結(jié)果進(jìn)行比較分析,將三七花改善阿爾茲海默病的潛在靶點PTGS2(前列腺素G/H合酶2)和CHRM2(毒蕈堿乙酰膽堿受體M2)作為分子對接的對象,導(dǎo)入PDB數(shù)據(jù)庫,通過數(shù)據(jù)庫自帶排練方式,得分由高到低選擇,得到PTGS2、BCL2分辨率較高的蛋白結(jié)構(gòu)5f19、5yc8。在“活性成分–疾病靶點”中選擇度值較高的三七花活性成分,西多糖苷(sitogluside)、β-谷甾醇(betasitosterol)作為對接分子,在AutoDockTools在線平臺處理配體和受體,并得到運行參數(shù),通過命令提示符進(jìn)行對接處理,得到Vinascore得分分別為-7.3和-7.7。之后在PyMOL軟件上將處理好的配體和受體對接,得到圖5。Vina是以相應(yīng)的口袋參數(shù)對受體和配體進(jìn)行分子對接所得到復(fù)合物的得分,這個值越低代表受體和配體親和力越高,對接結(jié)果越好。結(jié)果發(fā)現(xiàn)篩選得到的活性成分與預(yù)測的靶點均有結(jié)合。其中西多糖苷(sitogluside)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)與PTGS2、CHRM2靶點有較強的親和力。
圖5 活性成分與靶點蛋白的分子對接
中醫(yī)是我國的國粹,老年人對中藥有較高的信任度,近年來關(guān)于中藥用于改善癡呆患者癥狀的研究日益增多,目前主要為活血化瘀、改善循環(huán)類藥物。中藥個體化方案靈活性高,患者依從性較好,但目前缺乏臨床隨機雙盲試驗,且樣本量較小,有不同程度的毒副作用,故中藥多為輔助用藥。喬森等[18]研究認(rèn)為,血管相關(guān)病變是AD的重要原因,血瘀既是病理產(chǎn)物又是致病因素,從“瘀”進(jìn)行治療,取得不錯的臨床效果。三七花性甘涼,具有清熱平肝、生津止渴、活血化瘀等功效,適用于頭暈、目眩、耳鳴等癥[19]。葉長青等[20]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù),發(fā)現(xiàn)西多糖苷(sitogluside)與靶點PTGS2結(jié)合較好,可能是治療AD的關(guān)鍵。同時大量網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇[21-23]是治療AD的關(guān)鍵成分。
本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,篩選出23個三七花活性成分交集到34個AD靶點,通過Cytoscape 8.0軟件構(gòu)建“活性成分-靶點”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò),對關(guān)鍵靶點進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析表明,主要通過西多糖苷(sitogluside)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、β-欖香烯等活性成分調(diào)控 CHRM1、CHRM2、PTGS2等AD靶點。分子對接表明三七花的活性成分西多糖苷(sitogluside)[20]、β-谷甾醇(beta-sitosterol)[20-21]與老年癡呆的PTGS2、CHRM2等靶點有較強的結(jié)合,為三七花防治AD的提供了理論基礎(chǔ)。