海洋微塑料對海水青鳉毒性效應研究進展分析

馬健 李友訓 于道德 趙中華 田敬云 譚訓剛 呂淑果 王先磊

摘要：海水青鳉是研究微塑料對海洋生物毒理作用的理想模式生物。文章圍繞微塑料在海水青鳉中毒性研究，通過查閱相關文獻，對已發(fā)表文獻年度變化和地區(qū)分布進行了統(tǒng)計分析;通過分析實驗所用微塑料種類、顆粒大小和實驗濃度、暴露時間和方式以及不同生長階段海水青鳉實驗對象選擇，總結歸納微塑料在海水青鳉體內代謝、腸道損傷、生長和發(fā)育毒性、生殖毒性、遺傳毒性以及對其他海洋污染物的放大或緩解效應6個方面的研究結果，并以分析結果為基礎，建議在后期研究海洋微塑料對海水青鳉毒性效應，應重點考慮實驗時間長短、實驗材料選擇和實驗設計、毒理作用機制分析等因素。

關鍵詞：海水青鳉;微塑料;毒性;聚苯乙烯;聚氯乙烯

中圖分類號：X503.225;X55;P76 文獻標志碼：A 文章編號：1005-9857（2023）07-0048-08

0 引言

海洋環(huán)境中的微塑料污染已成為全球性環(huán)境問題，引起全世界的廣泛關注，2016年召開的第二屆聯(lián)合國環(huán)境大會上，微塑料污染被列入環(huán)境與生態(tài)科學研究領域的第二大科學問題，成為與全球氣候變化、臭氧耗竭和海洋酸化等并列的重大全球環(huán)境問題。海洋微塑料由于粒徑小、化學性質穩(wěn)定、疏水性強等特性，易被海洋生物所攝食，在生物體不同組織中發(fā)生累積和遷移，并且會在海洋食物鏈上發(fā)生傳遞，具有生物放大作用，對海洋生物的生存造成負面影響，甚至會威脅整個海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和健康[1]。

雖然微塑料只是在最近幾年才成為一種全球污染物，但關于其在環(huán)境中的發(fā)生、檢測、采樣技術以及對生物體的影響的研究文章已經超過2500篇[2]。關于微塑料對浮游動物[3]和微藻[4-5]、斑馬魚[2，6]、水生生物[7-9]和陸生生物[10]已陸續(xù)有相關綜述文章發(fā)表。海水青鳉（Oryziasmelastigma）具有個體小、世代周期短、產卵率高、繁殖快、雌雄易分辨、胚胎及仔魚透明易觀察、易于實驗室大規(guī)模培養(yǎng)、溫度和鹽度適應范圍廣、魚卵和幼體對環(huán)境中各類污染物反應敏感等特點，是理想的海洋模式魚種，近年來被廣泛應用于海洋生態(tài)毒理學和環(huán)境研究[11]。目前，以海水青鳉為模式生物研究微塑料的毒性效應進展較快，為更好地推動該領域研究進展，本文對國內外相關研究進行了分析，通過梳理公開發(fā)表的實驗結果，以期為相關科研工作者深入研究微塑料對海水青鳉的毒性作用有所借鑒，同時也為微塑料對其他海洋生物的毒性作用研究提供參考。

1 實驗方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

本文以“microplastic、microplastics、nanoplastic、nanoplastics、微塑料”和“marine medaka、Oryziasmelastigma、海水青鳉”為關鍵詞，在Pubmed（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）、百度學術（https：//xueshu.baidu.com/）、中國知網（https：//www.cnki.net/）檢索相關研究文獻。

1.2 文獻數(shù)據(jù)分析

1.2.1 年度變化

通過文獻檢索，共檢索到24篇研究論文，其中中文5篇（含3篇碩士學位論文），英文19篇。關于微塑料對海水青鳉的研究，近兩年才開始，并且呈現(xiàn)持續(xù)增加的態(tài)勢，其中2019年2篇、2020年10篇（含3篇碩士論文）、2021年8篇、2022年4篇。

1.2.2 地區(qū)分布

目前，只有4個國家有相關研究發(fā)表，絕大多數(shù)研究在我國，我國發(fā)表論文20篇，占比83.3%，在該領域占據(jù)主導地位;另外，法國[12-14]和韓國[15]發(fā)表相關研究論文，數(shù)量分別為3篇和1篇，分別占總數(shù)的12.5%和4.2%。從國內論文發(fā)表區(qū)域分布來看，福建閩江學院研究文獻6篇[11，16-20]，中國海洋大學研究文獻5篇[21-25]，中國科學院城市環(huán)境研究所和廈門大學聯(lián)合發(fā)表2篇[26-27]，中國科學院重慶綠色智能技術研究院2篇[28-29]，其他研究文獻涉及的研究機構有清華大學[30]、自然資源部第三海洋研究所[31]、中國水產科學研究院黃海水產研究所[32]、上海海洋大學[1]等單位。

2 實驗設計分析

實驗設計分析主要涉及微塑料種類、大小和濃度、暴露時間和方式以及海水青鳉發(fā)育時期的選擇。

2.1 微塑料類型

對論文統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，目前對微塑料在海水青鳉中生物毒性研究主要涉及聚苯乙烯（PS）、聚氯乙烯（PVC）和聚乙烯（PE）微塑料。目前關于PS微塑料的研究相對較多，共有19篇，其中，單獨研究PS微塑料的10篇[15，17，20，22-23，26-27，30-31，33]，研究PS微塑料與其他物質混合毒性的9篇[11，16，18-19，21，24-25，28-29]， 涉及PS微塑料與重金屬（Cd、Pb、Zn）、磺胺類抗生素（Sulfamethazine）、菲（Phenanthrene）、17α-乙炔基雌二醇（17α-ethynylestradiol）、磷酸三苯酯（TPP）混合毒性研究;PVC 微塑料相關研究論文3篇[1，14，32];PE 微塑料相關研究論文3 篇[12-13]。PS研究論文多的主要原因是容易買到不同規(guī)格和不同熒光標記的PS微塑料顆粒。

實驗所用的微塑料多數(shù)從試劑公司直接購買，為初生微塑料，其形狀較為規(guī)則，主要為球形，表面較為光滑;只有兩篇文獻對比研究了初生PVC微塑料和次生PVC微塑料的生物毒性[1，32]，與初生微塑料相比，次生PVC微塑料形狀不規(guī)則，表面更加粗糙、不光滑、凹凸明顯、棱角突出[1]。也有直接采自自然環(huán)境中的微塑料作為實驗材料，如Pannetier等[34]使用夏威夷、復活節(jié)島、關島沙灘上收集的微塑料研究其對海水青鳉的毒性。

2.2 微塑料大小

實驗選用的微塑料顆粒盡量與海洋中微塑料的直徑接近，北極沉積物中80%的微塑料直徑小于25μm[35]。目前用于海水青鳉生理毒性實驗所選微塑料直徑在50～25 萬nm，最小選用直徑為50nm[15，31]。PS相關的文獻涉及納米級和微米級微塑料，其中使用納米級微塑料的文獻4篇[11，18-19，33]，納米+微米級微塑料的文獻2篇[15，31]，微米級微塑料的文獻13篇[16-17，20，22-23，25-30，36，37];關于PVC 微塑料和PE 微塑料的文獻均使用微米級微塑料[1，12-14，32]。

2.3 微塑料暴露方式和濃度選擇

尚未形成相對標準的毒性暴露方法，目前使用的方法主要有2種。一種是將微塑料顆粒懸浮在水中，這是目前主要使用的暴露手段，有19篇文獻使用了該方法;另一種是將微塑料混在餌料中進行飼喂，有5篇文獻使用了該方法[11，14，18-19，30]。

不同實驗暴露濃度不同。懸浮浸泡的實驗濃度選擇的單位主要有particles/L 或μg/L。選用μg/L的實驗最高的暴露濃度可達50000μg/L[33]，Wang等[22]和Bergmann等[35]選用的濃度2μg/L和20μg/L接近于海水實際濃度;選用particles/L的實驗所用的濃度選擇也不同，如1×104particles/L和1×105 particles/L[17，20]、1×103 particles/L和1×106particles/L[1]。以餌料方式進行微塑料暴露實驗，不同的實驗攝入的微塑料也有所差異，如將PE或PVC微塑料占餌料1%濕重飼喂海水青鳉和斑馬魚[14];也有以100mg/kg體重為參考值進行飼喂[11];還有的以占餌料的濃度為單位進行飼喂，但濃度有所差異，F(xiàn)eng等[30]用的濃度為0.3μg/mg、3μg/mg，Zhang 等[18] 和He 等[19] 用的濃度為3.45mg/g。目前實驗所用的暴露濃度基本在海水污染的濃度范圍之內，已有監(jiān)測結果顯示，淡水中微塑料的濃度范圍在30～1790μg/L[38]，海水中的微塑料濃度范圍在0.4～250μg/L[39]，污染濃度高的區(qū)域可以高達4500μg/L[40-41]。

2.4 實驗動物發(fā)育時期選擇和處理時間

實驗對象海水青鳉選擇涵蓋從受精卵、仔魚到8個月大的成魚。實驗動物接觸微塑料的實驗時間長短在所選用的不同類型微塑料之間沒有明顯區(qū)別，但是根據(jù)不同的實驗目的或者生長時期的不同選擇而有所差異。研究微塑料在海水青鳉體內的代謝情況，一般為3天左右的直接接觸[12，20，30]。以受精卵、仔魚和成魚為實驗對象，微塑料接觸實驗時間沒有顯著差異，一般在3個月以下，有14篇文獻處理時間在1個月以下、7篇文獻處理時間在1～2個月、4篇文獻處理時間在2～3個月;只有2篇文獻的處理時間超過3 個月，分別為4 個月[14]和150天[23]。

3 實驗結果分析

3.1 體內代謝

海水青鳉攝入微塑料組織分布和代謝情況主要通過熒光或同位素標記的微塑料進行示蹤研究。海水青鳉可直接攝入微塑料[20，33]，也可能通過攝入攜帶微塑料的草履蟲或鹵蟲間接攝入[12]。目前的研究結果顯示攝入的微塑料主要存在于腸道中[12，20，33]，極少量在魚鰓（0.07%）和體表（0.03%）中[33]，該研究結果與日本青鳉（Oryziaslatipes）和爪哇青鳉（Oryziasjavanicus）的研究結果一致，微塑料可以在腸道中積累，但是海水青鳉（爪哇青鳉）對微塑料的富集能力更強[42]。不同的研究對微塑料攝入時間有所差異，田莉莉等[33]發(fā)現(xiàn)海水青鳉成魚和仔魚攝入微塑料的量隨著培養(yǎng)時間而變化，均在24小時攝入較多微塑料，成魚攝入的微塑料含量（246.8±38.1）mg/g顯著高于仔魚（4.32±0.77）mg/g;Cong等[20]發(fā)現(xiàn)10μmPS微塑料在48小時內均可被仔魚和成魚攝入，微塑料的加入對成魚的攝食有顯著影響，但對仔魚的攝食沒有影響。在停止微塑料毒性實驗第一天，PS 微塑料的排泄迅速[20]，田莉莉等[33]發(fā)現(xiàn)72小時后，微塑料在腸道內仍有一定量殘留;Cong等[20]發(fā)現(xiàn)第7天后，仍有一定比例的顆粒殘留在仔魚或成魚的消化道中，這可能與排泄物被重新攝入有關;Kang 等[15] 發(fā)現(xiàn)50nmPS微塑料比45μm PS微塑料在海水青鳉腸道中保留的時間更長，有可能納米級微塑料可以穿透腸膜，該推測與斑馬魚中的研究結果一致，納米級微塑料可以進入斑馬魚的腦、眼、血液、肝臟、心臟、肌肉等組織[2]，而大于200nm 的微塑料可以在腸道、鰓和皮膚積累[6]。

3.2 腸道損傷

微塑料可以引起海水青鳉腸道損傷和腸道微生物發(fā)生改變，微塑料的直徑越大，對腸道的影響越大。Kang等[15]研究了納米級微塑料與微米級微塑料對海水青鳉的毒性作用，發(fā)現(xiàn)45μm PS微塑料表現(xiàn)出腸道損傷（如黏液比例增加），腸道微生物在門和屬水平上引起了更顯著的微生物群落組成變化，50nmPS微塑料暴露組表現(xiàn)出更強的氧化應激和更高的抗氧化劑激活水平。Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)直徑200μmPS微塑料對腸道微生物的影響大于直徑2μm 和20μm 的PS微塑料，8個月成魚在200μmPS暴露60天后，腸道微生物多樣性和組成發(fā)生了改變，主要改變的細菌門類有疣微菌門（Verrucomicrobia）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。Feng 等[30]也發(fā)現(xiàn)200μmPS微塑料可以導致海水青鳉腸道微生物結構發(fā)生變化，群落功能發(fā)生變化，包括顯著的環(huán)境脅迫、碳降解/固定活性增加，以及部分改變氮、磷、硫的代謝能力。Wang等[28]和王燕等[29]發(fā)現(xiàn)2.5μm PS可顯著影響海水青鳉腸道的優(yōu)勢菌群，對照組雌魚和雄魚以變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門為優(yōu)勢菌群，而在PS處理組中，變形菌門在雌魚（98.10%）和雄魚（98.68%）中均占據(jù)絕對的豐度優(yōu)勢，并在雄魚中顯著增加;雌魚變形菌門的魯杰氏菌屬（Ruegeria）豐度顯著增多，本屬為益生菌，有助于海水青鳉抵抗環(huán)境中的PS脅迫[29]。

3.3 生長/發(fā)育毒性

微塑料可以在卵膜上積累，降低胚胎的孵化率、延遲孵化時間[21，31]。胚胎經2μg/L、20μg/L和200μg/L 的2μm PS 微塑料暴露，2μg/L 和200μg/L的濃度會顯著降低孵化率;在3 種濃度中，胚胎在7～11天心跳都會降低;熒光觀察顯示胚胎在8～11小時熒光值達到峰值，受精后14天（孵化后3天）在仔魚的腹部可以觀察到非常強的熒光信號[23]。Chen等[31]發(fā)現(xiàn)1×106particles/LPS微塑料浸泡還會導致胚胎心率改變，參與心臟發(fā)育、胚胎孵化酶編碼以及炎癥反應的基因也顯著上調。

PVC次生微塑料可導致胚胎物理損傷，引起胚胎的平均心率明顯加快，高濃度次生PVC微塑料暴露增加了海水青鳉胚胎的畸形率，畸形類型包括脊柱畸形、心包水腫、卵黃囊水腫、鰭腐爛、心臟拉伸和顱面畸形[1]。青鳉胚胎的心跳在不同的暴露實驗中產生的結果不同，該結果與斑馬魚胚胎在暴露實驗中產生的結果類似，可能引起心跳加速或心跳過緩[6]。仔魚經微塑料暴露后，仔魚生長受到影響，體重和體長降低。仔魚在PS微塑料暴露45天后，體重和體長顯著降低，其中PS 濃度為20μg/L 和200μg/L暴露組胰島素樣生長因子（IGF-I）、胰島素樣生長因子I受體（IGF-IR）、生長激素受體（GHR）的信使核糖核酸（mRNA）表達水平顯著降低[23]。仔魚在10μmPS微塑料暴露14天后，然后無微塑料培養(yǎng)至120天，統(tǒng)計結果顯示，處理組體長和體重低于對照組，且死亡率高于對照組[20]，說明微塑料對發(fā)育早期造成的毒性影響可以持續(xù)到成魚。Li等[37]也發(fā)現(xiàn)10μmPS微塑料對海水青鳉從受精卵開始經28天暴露后，20μg/L和200μg/L的PS微塑料抑制了仔魚的生長。

微塑料對成魚的影響主要體現(xiàn)在體重、體長、肝臟等方面。Cormier等[14]發(fā)現(xiàn)在餌料中添加PE或PVC微塑料（濕重1%，53～106μm），4個月后體重顯著下降，在雌性中下降得更為明顯，體重下降達20%～35%。Feng等[30]發(fā)現(xiàn)PS微塑料的暴露顯著降低了魚的體重并破壞了肝臟的抗氧化狀態(tài)。Wang等[23]也發(fā)現(xiàn)PS微塑料暴露可以降低成魚的體重，高濃度組（20μg/L和200μg/L）可以降低體長和生殖腺成熟指數(shù)（GSI），但促進了雌魚的性成熟，表現(xiàn)出生長和繁殖之間的平衡。Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)PS微塑料暴露會導致魚的體重、脂肪細胞大小和肝臟脂肪含量顯著增加，研究發(fā)現(xiàn)，疣微菌門增加、厚壁菌門/擬桿菌門比值增加、梭桿菌門減少與體重增加有關。

3.4 生殖毒性

微塑料暴露會延遲性腺發(fā)育、降低產卵數(shù)量和受精率。Wang等[22]發(fā)現(xiàn)10μm PS 微塑料暴露60天，延緩了雌魚性腺的成熟，降低了雌魚的繁殖力，基因轉錄分析結果顯示，PS微塑料暴露對雌魚下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸有顯著的負調控作用，而與雌魚類固醇生成通路相關基因的轉錄也被下調，導致雌魚血漿中17β-雌二醇和睪酮的濃度下降。Cormier等[14]在餌料中添加占濕重1%的PE微塑料或PVC微塑料（53～106μm），4個月后，產卵數(shù)量顯著下降，PE 微塑料處理組第一次產卵時間比對照組延后16～18天。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)PS微塑料暴露對親本性腺造成明顯的組織病理損傷，降低卵子產量和受精率，抗氧化應激反應、性激素破壞和生殖軸類固醇基因轉錄紊亂可以部分解釋為生殖障礙。此外，轉錄組分析顯示，20μg/L微塑料暴露對雄魚睪丸內甾體激素合成和細胞色素P450通路有顯著影響。微塑料對海水青鳉生殖系統(tǒng)的影響在日本青鳉中也觀察到類似結果，日本青鳉在8μg/LPE微塑料暴露2個月，雄魚ChgH 基因、雌魚VtgI、ChgH 和ERα基因（魚類生殖相關基因）表達均顯著下調[43]。

3.5 遺傳毒性

微塑料對親本的暴露對子一代的影響主要有胚胎孵化時間、孵化率、畸形、心率改變、生長緩慢等。Wang等[22]發(fā)現(xiàn)20μg/LPS微塑料對3個月大的海水青鳉浸泡60天，會延遲子一代的孵化時間，降低胚胎的孵化率、心率和體長;但是對仔魚連續(xù)浸泡150天后，發(fā)現(xiàn)子一代心跳加快、孵化提前和生長緩慢[23]。He等[19]發(fā)現(xiàn)用PS微塑料含量為3.45mg/g的餌料飼喂成魚30天，子一代雄魚體重下降34.3%，腸道菌群發(fā)生變化，肝臟IGFI的表達水平下降39.0%。王燕[29]發(fā)現(xiàn)5個月大成魚在2.5μmPS微塑料浸泡1個月，導致受精后22天的子一代免疫相關基因發(fā)生改變，引起免疫抑制作用。靳非等[17]也發(fā)現(xiàn)在粒徑為10μmPS微塑料浸泡50天后，能顯著降低子一代孵化率，造成胚胎發(fā)育畸形。

3.6 微塑料對其他污染物的放大和緩解效應

針對目前已發(fā)表研究結果，微塑料對其他污染物既有放大效應，又有緩解效應。塑料已被認為是對環(huán)境的嚴重威脅，除了其本身的毒性外，微塑料還可以與其他環(huán)境污染物相互作用，作為載體并可能調節(jié)其毒性[44]。研究顯示，微塑料可以介導重金屬離子、菲、17α-乙基雌二醇（EE2）和有機污染物對海水青鳉的毒性作用。王燕[29]發(fā)現(xiàn)PS微塑料可以增加腸道中Zn的積累。Li等[25]發(fā)現(xiàn)高濃度的PS微塑料（200μg/L）可顯著增加菲在雌性海水青鳉腸道和卵巢中的生物積累，抑制卵巢成熟，降低雌魚的卵黃蛋白原水平和生殖能力，同時胚胎菲的積累隨著PS濃度的增加而增加，PS濃度的增加加重了菲誘導的胚胎心動過緩，提示PS微塑料會加重菲的跨代毒性。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)PS微塑料可增加EE2對海洋魚類的雌激素效應，EE2和PS微塑料可顯著增加血漿中17β-雌二醇（E2）水平，提高雌激素生物標志物基因卵黃原蛋白和絨毛膜原蛋白以及雌激素受體（ERα 和ERβ）的轉錄水平，并呈劑量依賴關系，形態(tài)學分析也表明，同時暴露于EE2和PS對睪丸和肝臟的損傷更嚴重，表明PS微塑料增加了EE2的毒性。Bihanic等[13]發(fā)現(xiàn)PE 微塑料可以介導有機污染物對海水青鳉胚胎早期的毒性作用。以上結果表明，海洋中微塑料數(shù)量的增加可能會放大海洋污染物對海洋魚類健康和種群穩(wěn)定的不利影響。

在 特定條件下，微塑料對某些海洋污染物具有緩解作用。與高濃度PS微塑料增加菲的毒性作用不同[25]，低濃度的PS可以降低菲的毒性，2μg/LPS微塑料和菲聯(lián)合暴露可使胚胎孵化率提高25.8%，降低畸形率和死亡率，并可恢復菲誘導的心臟發(fā)育相關基因的異常表達，其原因可能是低濃度的PS降低了菲的生物利用度和生物積累量[21]。PS微塑料對磺胺類抗生素的毒性也有一定的緩解作用，當PS微塑料存在時，磺胺二甲嘧啶（SM2）對海水青鳉腸道微生物群落結構及氧化應激的影響成緩解趨勢，對海水青鳉的生殖毒性呈下降趨勢[11，18]，另外，SM2和PS微塑料共同作用，可以降低PS 微塑料對子一代的毒性作用[19]。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)PS、PS-COOH 或PS-NH2微塑料均可以降低磷酸三苯酯（TPP）的毒性，將TPP誘導的仔魚低運動活性逆轉到正常水平，但是PS 組、PSCOOH組和PS-NH2組的基因表達譜不同，暗示了不同的運動活動逆轉機制。以上研究結果挑戰(zhàn)了微塑料會加重被吸附污染物毒性的普遍觀點，有助于更好地理解微塑料污染的環(huán)境風險。

4 討論

盡管微塑料在海水青鳉中的研究進展很快，但是由于開展的時間較短，所以以海水青鳉為模式生物研究微塑料對海洋生物的毒性研究還有很多方面需要去探究，建議重點考慮以下3個方面。

（1）實驗時間。針對急性毒性實驗，可以將暴露時間盡可能縮短。但是因為海洋生物持續(xù)生長在含有微塑料的環(huán)境中，更需要搞清楚的是微塑料的慢性毒性和“遺留效應”，已有實驗室研究結果證明單純的親本暴露，就會影響子一代的生長發(fā)育，那么多代持續(xù)暴露，可能對生物的毒性作用更嚴重，所以如果研究微塑料慢性毒性效應必然要延長暴露時間。

（2）實驗材料選擇和實驗設計。目前只是PS、PE、PVC3種微塑料對海水青鳉的毒性開展了研究，海洋中常見的聚丙烯（PP）、聚酰胺（PA）、聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）等微塑料的研究尚未開展;另外，由于環(huán)境中的塑料顆粒具有不同的物理和化學性質，微塑料的不同類型、形狀、大小、顏色、混合毒性以及與其他有毒物質的交叉作用都是未來需要深入研究的方向。

（3）毒理作用機制分析。目前只是部分研究了微塑料在海水青鳉體內的代謝情況，以及其對胚胎、仔魚和成魚的毒性效應。斑馬魚的實驗結果顯示[2，6]，海洋微塑料導致胚胎免疫基因上調、氧化應激反應基因發(fā)生改變、中樞神經系統(tǒng)和視覺相關基因下調，這些研究結果對于海水青鳉的研究具有重要的參考意義。在后期研究中，關于微塑料具體通過什么途徑發(fā)揮其對海水青鳉的生長及發(fā)育毒性、遺傳毒性以及對其他污染物的放大或緩解效應，是否還有其他負面影響，以及影響的具體機理是什么，都需要開展廣泛深入的研究，以期更加明晰微塑料污染對生物的毒性效應。

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