改良型富血小板纖維蛋白的研究進(jìn)展

范加奇，張雪松

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 整形外科，黑龍江 佳木斯，154000）

在臨床一線的醫(yī)生會遇見各種部位和各種程度的創(chuàng)傷，這些創(chuàng)傷的發(fā)生與發(fā)展，直接關(guān)系到患者的身心健康。[1]但在長期對創(chuàng)面治療的臨床工作中發(fā)現(xiàn)，舊有的治療手段對一些復(fù)雜的創(chuàng)傷的恢復(fù)效果有限，不能既滿足患者對創(chuàng)傷修復(fù)的要求程度，也不能提供副作用較少的醫(yī)療方案。為了提高患者的治療質(zhì)量，近年來發(fā)現(xiàn)血小板或血小板相關(guān)血液制品可以更好地填補以上對創(chuàng)面治療的空白。

現(xiàn)在較為流行的血小板或血小板相關(guān)血液制品第一代的富血小板血漿（platelet—rich plasma，PRP）、第二代的富血小板纖維蛋白（Platelet-Rich Fibrin，PRF）以及第三代的改良型富血小板纖維蛋白（advanced platelet-rich fibrin，A-PRF）[2]。近幾年，這三代的血小板相關(guān)產(chǎn)品在各種創(chuàng)傷恢復(fù)上使用廣泛。比如使用這些血小板制品治療慢性竇道[3]、修復(fù)骨缺損[4]、修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎[5]、修復(fù)難治性潰瘍[6]以及在脂肪移植[7]中起到關(guān)鍵作用。但是經(jīng)過臨床多年的使用發(fā)現(xiàn)PRP制備麻煩，要求需要外加抗凝制劑防止血液凝固而且還有感染和超敏反應(yīng)的風(fēng)險[8]以及發(fā)現(xiàn)PRF雖然較富血小板血漿有了一定的改進(jìn)，但是其作用時間較短，因子釋放速度過快，患者的使用性價比過低這些缺點，Ghanaati S[9]改進(jìn)創(chuàng)造出A-PRF這一新一代的血小板制品，以此來彌補前幾代的不良效果。因為A-PRF是近幾年新出現(xiàn)的制品，臨床應(yīng)用有限，對此我將通過匯總歸納全網(wǎng)各種有關(guān)A-PRF的文章，借用本綜述來歸納介紹A-PRF的研究進(jìn)展，為臨床醫(yī)生使用A-PRF治療患者提供經(jīng)驗。

1 研究背景

PRP是首次從自身靜脈內(nèi)抽取的高血小板產(chǎn)品，它含有豐富的血小板，活化后能釋放出大量的生長因子，從而加速軟組織和硬質(zhì)組織的再生。[10]多個動物及臨床試驗[11]表明PRP因富含大量血小板，可以逐步分泌出多種生長因子和細(xì)胞因子，從而加快創(chuàng)面肉芽組織的生成和組織的修復(fù)。相較于PRP，PRF不含添加劑，可以降低發(fā)生感染和免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險。PRF的纖維蛋白是一種獨特的立體網(wǎng)絡(luò)，是特殊的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其可在10天內(nèi)貯存大量的血液，并能維持10天。特別是能分泌大量的生長因子，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長，遷移，從而導(dǎo)致真皮基質(zhì)的上皮化[8,12]。

Dohan et al[13]研究結(jié)果表明，纖維蛋白的空間結(jié)構(gòu)和功能受分離速度和分離時間的影響。[14]。在該研究的基礎(chǔ)上為了獲取富含更多的血小板和白細(xì)胞的富血小板制品，Ghanaati et al通過降低離心速度，增加離心時間，離心不含任何化學(xué)制劑的自體靜脈全血制備出了A-PRF。

A-PRF與 PRF的生產(chǎn)工藝相同，但其離心速度及時間存在一定的差別，同時還要求使用特殊的離心管。由于離心參數(shù)的不同，其凝膠形態(tài)、成分如血小板、白細(xì)胞等成分有很大差別，其治療效果也有很大差別。[15]促進(jìn)組織修復(fù)再生能力優(yōu)于PRF。在血液中的所有種類的生長因子在A-PRF中幾乎均可找到并且都有可作用的含量，A-PRF釋放這些生長因子的高峰期一般在一周左右即可到達(dá)，每次可有長達(dá)28天左右的釋放時間[16]，創(chuàng)面可以持續(xù)的接收到A-PRF所釋放的生長因子的作用，不僅如此，A-PRF的顯微結(jié)構(gòu)為疏松的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，為再生血管的長入提供支架和空間，進(jìn)一步促進(jìn)創(chuàng)面再血管化和組織愈合，APRF已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于促進(jìn)傷口的再生與修復(fù)。[17]

2 A-PRF 的制備方法

Dohan et al[18]結(jié)果表明：離心速率、離心時間對纖維蛋白的空間結(jié)構(gòu)和功能有很大的影響。離心轉(zhuǎn)速和離心力越大，越多的白細(xì)胞以及血小板被破壞[19]。2014 年，Ghanaati S[9]報告A-PRF，用A-PRF試管采集病人的外周靜脈血液，然后用1500轉(zhuǎn)/分鐘，14分鐘后，將其分離出來。[20]李權(quán)[8]采用抽取患者自身靜脈血10ml于不加抗凝劑的離心試管中，以1500 r/ min的速度，離心14min后自然靜置分層，試管分層中層產(chǎn)物淡黃色凝膠狀物質(zhì)，即為A-PRF。其后將試管內(nèi)凝膠狀的A-PRF與相接觸的紅細(xì)胞碎片統(tǒng)一倒在無菌紗布上并將其分離，將分離后的物質(zhì)用新的無菌紗布壓制成膜，留之備用。

相較于A-PRF的制備，PRP的制備方案中要有兩次離心，分別是第一次離心(900r/5min)，將紅細(xì)胞與白細(xì)胞分離，得到三層:上層富含血小板和白細(xì)胞，中層為淺黃色物質(zhì)，下層有紅細(xì)胞。收集前兩層物質(zhì)后，以1500r/15min的速度進(jìn)行第二次離心排除紅細(xì)胞。并且兩次離心都要加入抗凝制劑，以防止血漿凝固[21,22]。Marrelli和Tatullo[23]發(fā)現(xiàn)，PRF的制備可以減少添加抗凝劑這一步驟，最終產(chǎn)物在2700r/12min離心后產(chǎn)生，其顯微結(jié)構(gòu)為一個纖維蛋白網(wǎng)，允許細(xì)胞遷移和緩慢釋放組織再生所必需的生長因子。纖維蛋白網(wǎng)位于非細(xì)胞和細(xì)胞血漿(包括血小板、白細(xì)胞和纖維蛋白)之間的管中間。

通過對比可以發(fā)現(xiàn)，A-PRF的制備是在PRF制備方法的基礎(chǔ)上改變離心速率和離心時間而創(chuàng)造出來的，并且改變了物質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)，從而使得A-PRF的生物學(xué)特征與PRF不盡相同，產(chǎn)生新的臨床效果。

3 生物學(xué)特征

PRF所含有成分與PRP基本相同，其中包含多種生長因子，如血小板衍生生長因子-AB（plateletderived growth factor,PDGF-AB）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor,TGF-β）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）、類胰島素生長因子（insulin-like growth factors,IGFs）和基質(zhì)蛋白（如纖連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白）[24]。

2014年，Ghanaati等[25]根據(jù)試驗結(jié)果，可以通過改變離心參數(shù)，得到與富血小板纖維蛋白不同的材料，也就是改良型富血小板纖維蛋白。結(jié)果顯示，其細(xì)胞內(nèi)含有97%以上的血小板，其生理結(jié)構(gòu)為疏松的三維立體網(wǎng)絡(luò)，含有大量由血小板產(chǎn)生的生長因子，具有加速軟硬組織愈合的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，與富血小板纖維蛋白比較，改良型富血小板纖維蛋白的黏附力、拉伸強度和生長因子含量都明顯高于后者[26]。2016年Kim等[27]同時發(fā)現(xiàn)，研究了富血小板纖維蛋白、富血小板纖維蛋白、富血小板血漿生長因子的釋放規(guī)律，發(fā)現(xiàn)改進(jìn)后富血小板纖維蛋白的釋放速率比上一代、二代產(chǎn)品中的多，且釋放速率緩慢，釋放周期長。一段時期之后，纖維蛋白基質(zhì)能夠保持蛋白質(zhì)在纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)中的作用，并含有能夠進(jìn)一步將生長因子釋放到周圍的微環(huán)境中的細(xì)胞[28]。其釋放多種生長因子，包括：轉(zhuǎn)化生長因子b（TGF-b）、胰島素樣生長因子（IGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、表皮生長因子（EGF）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）。

4 臨床應(yīng)用

支持改良型富血小板纖維蛋白技術(shù)的人相信它的好處包括：提高硬和軟組織損傷的恢復(fù)，減少術(shù)后感染，疼痛和出血[8,29-32]。大量的文獻(xiàn)報告了改良型富血小板纖維蛋白用于各種臨床應(yīng)用的案例。改良型富血小板纖維蛋白的數(shù)量和用法也有差別。大部分關(guān)于改進(jìn)富集血小板纖維蛋白的討論僅限于臨床個案或動物試驗。因此，改良型富血小板纖維蛋白對傷口愈合的促進(jìn)作用在很大程度上仍然是非系統(tǒng)的嘗試。然而，有一小部分具有前瞻性或回顧性對照的臨床研究表明，使用富含血小板的血漿可顯著增強硬組織和軟組織的愈合。

4.1 改良型富血小板纖維蛋白促進(jìn)骨再生的應(yīng)用

羅斯于1974年首次描述的PDGF存在于血小板α顆?；蚓藜?xì)胞中，并刺激血管生成、成骨細(xì)胞增殖和分化以及間充質(zhì)細(xì)胞分裂。PDGF對成纖維細(xì)胞有顯著的刺激作用，對膠原蛋白的合成有一定的促進(jìn)作用[33]。1TGF-b在發(fā)育早期影響成骨細(xì)胞，并刺激成纖維細(xì)胞的膠原合成，從而促進(jìn)骨和軟骨的再生。IGF有助于分化并刺激成骨。PDGF、TGF-b能顯著地改善軟組織及骨骼的損害[34-36]。在A-PRF中，高密度纖維網(wǎng)絡(luò)可以促進(jìn)毛細(xì)血管的生長，并能促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞的增殖，從而使其向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變[37]。在A-PRF的形成和溶解過程中，其釋放速率和釋放時間基本相同，而且其釋放時間和持續(xù)時間都有一定的提高[38]。因此被廣泛應(yīng)用于骨組織再生中。

焦志立等[26]以30只日本大耳兔為材料，制作了兔顱頂骨環(huán)狀全層骨缺損模型，采用A-PRF膜填充骨缺損，觀察其對兔骨生長的影響。發(fā)現(xiàn)A-PRF對新的骨組織和細(xì)胞有積極的影響，其在體內(nèi)維持4-8周的時間，發(fā)生的免疫反應(yīng)會在其三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中發(fā)生，避免軟組織長入骨缺損區(qū)域影響成骨，并且在完全降解前，A-PRF所緩慢釋放的生長因子能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、增加膠原合成能力并且促使新生血管形成。楊智超等[39]研究者對41名包頭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的41名病人進(jìn)行了自體種植，并將A-PRF植入到拔牙后的牙槽中，觀察到A-PRF對軟組織和骨骼的修復(fù)效果在1,3,6,12個月的骨愈合情況下有明顯的改善，表明A-PRF對拔牙時軟組織和骨骼的修復(fù)有明顯的改善。在這些臨床試驗達(dá)到預(yù)期效果之外，我們還可以從這些試驗的其他方面發(fā)現(xiàn)，A-PRF可減輕或縮短術(shù)后早期出現(xiàn)的癥狀，如疼痛，腫脹，進(jìn)而讓患者對手術(shù)的耐受性和術(shù)后的生活質(zhì)量大幅提高。A-PRF的最大特色在于它能提高患者的療效和舒適度，而且經(jīng)濟且簡單[8]。

4.2 改良型富血小板纖維蛋白在軟組織缺損修復(fù)的應(yīng)用

A-PRF結(jié)構(gòu)疏松，孔洞大，纖維彈性好，可為機體提供足夠的氧和養(yǎng)分，促進(jìn)營養(yǎng)和養(yǎng)分的交換，促進(jìn)細(xì)胞中的生長因子，促進(jìn)脂肪生成[40]。此外，A-PRF還能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等細(xì)胞的增殖和遷移，從而加快軟組織的損傷修復(fù)。

李全[8]與其他研究者對安徽醫(yī)科大學(xué)二附院的80名病人進(jìn)行了皮膚移植，并使用A-PRF膜進(jìn)行皮瓣移植，發(fā)現(xiàn)使用A-PRF膜后，患者疼痛、愈合速度、創(chuàng)面?zhèn)痰染忻黠@的改善。羅楠[30]與其他研究者共選擇66名慢性創(chuàng)面病人，用A-PRF薄膜涂抹于33名病人的傷口，觀察1、2、4周后，A-PRF處理的傷口面積縮小率、愈合時間和更換敷料的效果都明顯好于對照組?？梢夾-PRF包衣對創(chuàng)傷的修復(fù)效果良好。

5 展望

相較于其前一代的PRF在臨床使用效果來看，A-PRF釋放的生長因子TGF-β、PDGF、VEGF以及趨化分子CCL-5和eotaxin數(shù)量顯著增加以及中性粒細(xì)胞增多。因此，A-PRF相較于PRF是一個很好的組織修復(fù)和血管形成的補充者。

A-PRF產(chǎn)品可產(chǎn)生更自然的方案、更低的成本和更快的時間來獲得更有效的臨床產(chǎn)品。如今，A-PRF不僅用于牙科，在植入物康復(fù)前的組織再生中也有輔助作用，還用于慢性潰瘍、肌肉骨骼損傷甚至整形外科。它具有廉價、快速的特點，在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景[41]。這一系列A-PRF的優(yōu)點將隨著人們生活水平的提高以及對外在形象的極致追求，A-PRF將在整形美容等相關(guān)領(lǐng)域產(chǎn)生廣泛影響。

與傳統(tǒng)PRP及PRF相比，A-PRF的研究較少，沒有一個完整的研究統(tǒng)計和歸納。導(dǎo)致A-PRF在臨床上的使用缺少科學(xué)系統(tǒng)的經(jīng)驗支持。與 PRF相似，A-PRF在實踐中也存在著一些問題。PRF及它的衍生物，包括A-PRF，都是從病人自己的血液中提取出來的，由于需要立即生產(chǎn)，不能長期儲存，因此一次配制數(shù)量很少，以現(xiàn)在的技術(shù)暫時不能大規(guī)模地用于臨床。A-PRF主要是通過釋放生長因子，從而達(dá)到加速傷口愈合的目的，但是其作用機理和機制目前還不明確。具體機制仍需進(jìn)一步研究。