靈芝多糖抗腫瘤作用機制研究進展*

陳起周，歐陽茜茜,2,3，羅 輝,2,3，于豐彥，權(quán)維燕,2,3，戚 怡,2,3

（1.廣東醫(yī)科大學，廣東 湛江 524001；2.廣東湛江海洋醫(yī)藥研究院，廣東 湛江 524001；3.湛江市環(huán)北部灣海岸特色微藻與微生物資源產(chǎn)品研發(fā)重點實驗室，廣東 湛江 524001）

靈芝為多孔菌科真菌，又名林中靈、瓊珍，在我國已經(jīng)有三千多年的藥用歷史，是一種藥食同源的名貴中藥。《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》已記載了其作用及主治病證?，F(xiàn)代研究證實，靈芝具有十分豐富的活性成分，包括靈芝多糖、三萜、甾醇、蛋白質(zhì)、微量元素、氨基酸、生物堿等[1]，可用于高血壓、失眠、糖尿病、肝病、哮喘、癌癥等疾病的治療[2-3]。最重要的是，靈芝性平，沒有毒副作用，已被公認為可作為癌癥輔助治療的替代品[4]。靈芝多糖（GLP）是靈芝最主要的活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗衰老、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖、調(diào)節(jié)腸道菌群等藥理作用[5-9]。近年來，靈芝多糖的抗腫瘤活性成為國內(nèi)外學者研究的熱點，靈芝多糖對骨肉瘤[10]、黑色素瘤[11]、胃癌[12]、肝癌[13]、宮頸癌[14]和白血病[15]等都具有抑制作用。靈芝總多糖結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜[16]，無明確特異分子構(gòu)象，且藥理機制也尚未明確，因此其較難進入國際市場。本文擬對國內(nèi)外靈芝多糖的抗腫瘤機制研究進展進行綜述，以期為靈芝多糖開發(fā)為新型高效低毒的抗癌藥物提供新思路。

1 靈芝多糖的結(jié)構(gòu)與抗腫瘤的關(guān)系

靈芝多糖是由三股單糖鏈構(gòu)成的含醛基或酮基的葡聚糖。它是一種從靈芝子實體或孢子粉中提取的有效成分，存在于靈芝細胞壁里面。靈芝多糖的結(jié)構(gòu)連接方式較為復(fù)雜，種類和分子量十分豐富，其分子量大小、單糖組成、糖苷鍵構(gòu)型、分支度、三級結(jié)構(gòu)等都顯著影響靈芝多糖的結(jié)構(gòu)特征[6]。目前報道的靈芝多糖結(jié)構(gòu)有200多種[17]，主要包括雜多糖和葡聚糖。其中雜多糖大部分是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等一個或多個單糖通過α-糖苷鍵或β-糖苷鍵相互連接而成。研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖的結(jié)構(gòu)特點與其抗腫瘤作用是息息相關(guān)的。在一定程度上，靈芝多糖的主鏈越長、支鏈越多，單糖組成數(shù)量越多，其生物活性會越高[6]。如MA C W等[18]采用超聲提取工藝提取靈芝多糖，然后利用超濾膜將其分為分子量不同的4個組分：GLP1（＞10 kDa）、GLP2（8～10 kDa）、GLP3（2.5～8 kDa）和GLP4（＜2.5 kDa）。結(jié)果表明4個多糖組分中均含有豐富的葡萄糖和半乳糖，其中GLP1和GLP2具有較強的抗氧化和抗增殖活性，這很可能與它們的分子量大小有關(guān)。LI J等[19]通過梯度乙醇沉淀和強陰離子交換柱法從靈芝子實體提取物中純化出2種多糖（GP1和GP2），研究發(fā)現(xiàn)GP1多糖為d-半乳糖葡聚糖，具有柔性隨機線性構(gòu)象。其體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性表明，GP1對脾臟和胸腺具有更好的保護作用。靈芝多糖結(jié)構(gòu)按糖苷鍵主要分為α型和β型2種，目前認為以β-（1-3）糖苷鍵和β-（1-4）糖苷鍵連接的多糖具有明顯的抗腫瘤活性[20-21]。另有研究表明，以α-糖苷鍵為主鏈的多糖也具有抗腫瘤的作用，如云芝多糖以α-（1-4）糖苷鍵為主鏈，對多種腫瘤細胞生長有抑制作用[22]。

2 靈芝多糖抗腫瘤作用機制

當前，靈芝多糖的抗腫瘤作用機制尚未完全闡明，大多數(shù)學者認為靈芝多糖是通過改善機體的免疫水平以達到抗腫瘤的效果。綜合近年的靈芝多糖抗腫瘤研究結(jié)果，筆者發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖可通過多種方式發(fā)揮其抗腫瘤作用，如提高機體免疫功能、抑制腫瘤細胞的增殖和遷移、誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡、降低腫瘤細胞的耐藥性和降低化療藥物的毒性。

2.1 提高機體免疫功能 研究表明，惡性腫瘤的發(fā)生與機體免疫力密切相關(guān)[23-24]。人體免疫力低下的時候，機體的各種致病因子會迅速發(fā)展，為腫瘤的發(fā)生和發(fā)展提供重要的有利條件。研究[25-26]表明，靈芝多糖可通過促進免疫細胞增殖及調(diào)節(jié)細胞因子表達以提高機體免疫力。目前，多數(shù)研究報道靈芝多糖對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞沒有直接的抑制或殺傷作用，然而體內(nèi)給藥卻具有良好的抗腫瘤作用[6,27]。這說明靈芝多糖的抗腫瘤作用很可能是通過提高機體免疫力而實現(xiàn)的。靈芝多糖可通過促進免疫細胞增殖和調(diào)節(jié)細胞因子表達來發(fā)揮其抗腫瘤作用。

2.1.1 促進免疫細胞增殖 免疫細胞在機體免疫功能的發(fā)揮中處于主體地位，它主要包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞、漿細胞和肥大細胞。靈芝多糖無法直接殺死腫瘤細胞，但它能促進T細胞、B細胞、巨噬細胞等免疫細胞的增殖。如XU Z T等[28]通過體外和體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖可對機體產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)、抗血管生成及對腫瘤細胞產(chǎn)生毒性作用以達到抗腫瘤的作用。靈芝多糖可通過影響免疫細胞和免疫相關(guān)細胞以達到提高機體免疫力的效果。ZHANG S等[29]將靈芝多糖（GLP）與半胱胺、硼氫化鈉、氯金酸等試劑反應(yīng)合成納米復(fù)合材料（GLP-Au）。研究發(fā)現(xiàn)，與GLP相比，GLP-Au可以有效誘導(dǎo)樹突狀細胞活化，促進CD40/80/86和MHCⅡ等共刺激因子的表達，從而有效刺激T細胞反應(yīng)，并能有效促進脾細胞中CD4+和CD8+T細胞的增殖。黃建琴等[30]以BALB/c清潔級小鼠為研究對象，成功建立荷瘤小鼠模型后取荷瘤小鼠腹腔的巨噬細胞進行體外培養(yǎng)，最后用不同濃度的靈芝多糖作用于巨噬細胞，結(jié)果表明20～160 μg/mL的靈芝多糖可以促進荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生cAMP、IP3和DAG等第二信使分子，并且靈芝多糖可以激活cAMP/PKA、IP3/Ca2+及DAG/PKC信號通路。這些結(jié)果提示靈芝多糖可能通過作用于荷瘤小鼠巨噬細胞，激發(fā)細胞內(nèi)不同的信號通路，從而提高機體免疫能力，達到抗腫瘤的效果。YU H等[31]研究發(fā)現(xiàn)將合成的硫化鉍納米顆粒（BiNP）與GLP結(jié)合能提高放射治療的敏感性。其作用機制是GLP-BiNP通過增加腫瘤內(nèi)CD8+T細胞增殖數(shù)量，以及提高血清INF-γ/IL-4比值，改變腫瘤免疫抑制性微環(huán)境。由此可見，GLP-BiNP可用于放射增敏和增強機體免疫活性，在腫瘤治療中發(fā)揮雙重作用。ZHANG S等[32]研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖不直接殺死小鼠結(jié)腸癌CT26細胞，但可通過激活腹腔巨噬細胞抑制CT26細胞的增殖，并且能顯著抑制CT26荷瘤小鼠的腫瘤生長。經(jīng)靈芝多糖治療后小鼠免疫器官指數(shù)和巨噬細胞吞噬量均顯著增加，TNF-α、IL-1β和一氧化氮同樣增加。其作用機制是靈芝多糖可以通過Tlr4依賴信號通路激活巨噬細胞，提高機體免疫力，從而抑制腫瘤生長。

2.1.2 調(diào)節(jié)細胞因子表達 細胞因子主要包括白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、趨化因子和生長因子等，可實現(xiàn)對細胞生長、分化的調(diào)節(jié)。細胞因子具有抗增殖活性，可引起腫瘤細胞的凋亡和分化。研究表明，靈芝多糖能促進TNF-α、IFN-c、TGF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-17和IL-1β等細胞因子的表達[29,33-34]。TGF-β1是一種多功能細胞因子，絕大部分腫瘤及其細胞株可分泌大量的TGF-β1。其可影響腫瘤生存環(huán)境中局部血管生成和抑制機體免疫監(jiān)視，進而為腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和浸潤提供有利條件。如王建坤等[35]發(fā)現(xiàn)，B16F10黑素瘤細胞應(yīng)用靈芝多糖處理后，其TGF-β1的表達量明顯低于無靈芝多糖對照組（P＜0.05），且抑制效果呈劑量依賴性。WANG C H等[36]在探究靈芝多糖對荷瘤大鼠的抗腫瘤作用和免疫系統(tǒng)的影響時發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖可提高血清白細胞介素IL-2、TNF-α、INF-γ濃度，增強自然殺傷細胞和T細胞的細胞毒性，促進樹突狀細胞功能成熟，從而抑制膠質(zhì)瘤生長，延長小鼠存活時間。細胞毒性T淋巴細胞是一種特異的T淋巴細胞，專門分泌各種細胞因子參與機體的免疫作用，對病毒、腫瘤細胞等抗原物質(zhì)具有殺傷作用，與自然殺傷細胞構(gòu)成機體抗病毒、抗腫瘤免疫的重要防線。郭焱等[37]在研究靈芝多糖對荷瘤小鼠細胞毒性T細胞活性的影響時，發(fā)現(xiàn)靈芝多糖可使荷瘤小鼠的CD8+T淋巴細胞數(shù)量及CTL細胞活性均明顯提高（P＜0.01），提示靈芝多糖可增強荷瘤小鼠細胞毒性T細胞免疫活性從而達到抗腫瘤效果。ZHAO L等[38]通過提取純化靈芝后得到2個主要成分GP-1和GP-2，并探究了2個成分對體外巨噬細胞的活化和對人乳腺癌細胞的抗腫瘤活性。結(jié)果表明，GP-1和GP-2可以顯著提高巨噬細胞的增殖和胞飲的活動，從而發(fā)揮對癌細胞的抑制作用。髓源性抑制細胞（MDSCs）是抑制荷瘤宿主免疫活性的主要細胞群，并能在荷瘤宿主中積累，在誘導(dǎo)腫瘤的免疫抑制中起關(guān)鍵作用，因此抑制其生長對抗腫瘤具有重要意義。WANG Y Y等[39]從靈芝子實體提取了分子量為44.4 KDa的靈芝多糖，并采用小鼠Lewis肺癌模型考察了靈芝多糖的抗腫瘤活性。研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖可以顯著升高小鼠脾臟中CD4+T/CD8+T細胞的百分比，以及促進IFN-γ和IL-12細胞因子的產(chǎn)生。最重要的是，該研究首次發(fā)現(xiàn)GLP能通過CARD9-NF-κB-ID通路誘導(dǎo)MDSCs的分化并抑制MDSCs的積累，從而阻止肺癌的發(fā)展。

2.2 抑制腫瘤細胞增殖 腫瘤細胞不受身體內(nèi)部控制，可以永無止境地增殖，直到機體死亡，因此抑制腫瘤細胞增殖具有重要意義。ZHANG Q H等[40]發(fā)現(xiàn)靈芝多糖能抑制人骨肉瘤MG63細胞和U2-OS細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細胞凋亡。此外，靈芝多糖可通過抑制Wnt共受體LRP5和Wnt相關(guān)靶基因，如β-catenin、cyclin D1、C-Myc、MMP-2和MMP-9，阻斷Wnt/β-catenin信號通路，從而廣泛抑制骨肉瘤細胞的生長。YU H等[31]發(fā)現(xiàn)靈芝多糖可以使晚期癌癥患者在治療12周后的血漿IL-2、IL-6和IFN-g濃度顯著升高，而使IL-1和TNF-α水平顯著降低（P＜0.05），從而增強晚期癌癥患者的免疫應(yīng)答。YU Y等[41]在探討靈芝多糖對輻射照射的肝癌細胞（HCC）的影響時發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖處理可增強輻射誘導(dǎo)的肝癌細胞生長抑制和凋亡。其分子水平上的作用機制是靈芝多糖抑制了輻射條件下肝癌細胞DNA修復(fù)相關(guān)蛋白，包括共濟失調(diào)毛細血管擴張癥突變[39]（ATM）和DNA依賴性蛋白激酶（DNA-PK）。此外，添加Akt抑制劑可提高DNA-PK和ATM的活性，減輕GLP誘導(dǎo)的HepG2細胞損傷。這提示靈芝多糖可通過調(diào)控Akt信號通路增強肝癌細胞的放射敏感性。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）被認為是細胞增殖和分化的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，靶向MAPK信號通路已成為干預(yù)腫瘤進展的重要治療策略之一。YANG G H等[15]研究了靈芝多糖對HL-60急性髓系白血病細胞的體內(nèi)外抗腫瘤活性，重點研究了其對MAPK通路的靶向作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)靈芝多糖阻止了細胞外signal-regulated激酶/MAPK信號通路，同時激活p38和MAPK通路，誘導(dǎo)了HL-60細胞周期阻滯和凋亡。GLP是通過MAPK途徑在HL-60急性白血病細胞中發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.3 抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移 由于腫瘤細胞好動性強，所到之處都會形成新的癌灶，因此腫瘤容易復(fù)發(fā)，治療難度大大增加。李穎博等[42]研究表明，靈芝多糖能顯著減少人前列腺癌細胞（PC-3M）突變和遷移的數(shù)目，其作用機制是通過抑制人前列腺癌腫瘤細胞聚集并轉(zhuǎn)移到其他組織從而發(fā)揮抗腫瘤作用。HSU W H等[43]研究表明，靈芝多糖能有效抑制小鼠肺癌細胞的活力和流動性。其作用機制是GLP在EGF或TGF-β刺激下降低了細胞中ERK1/2的磷酸化，并且抑制細胞內(nèi)多個信號分子的磷酸化，如FAK、AKT和Smad2。GLP可以顯著抑制小鼠肺腫瘤的生長，減小肺內(nèi)轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的大小，延長肺癌小鼠的生存時間。ZHAO X H等[44]通過Transwell遷移實驗和劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖可以抑制人前列腺癌細胞遷移，并且發(fā)現(xiàn)靈芝多糖具有抑制細胞生長作用，其中靈芝多糖對細胞遷移的抑制可能是通過PRMT6信號通路發(fā)生的。JIN H等[45]用Transwell遷移實驗發(fā)現(xiàn)靈芝多糖可以減弱宮頸癌細胞入侵和遷移的能力。此外流式細胞術(shù)顯示靈芝多糖可促進宮頸癌細胞凋亡，限制宮頸癌細胞周期。其作用機制是GLP通過抑制上皮-間充質(zhì)通路和JAK/STAT5通路，減輕宮頸癌細胞的活性和侵襲性，阻斷細胞周期，促進細胞凋亡。ZENG Z G等[46]探究了靈芝多糖對人舌鱗癌細胞（HSC-3）增殖和遷移的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLP能通過調(diào)節(jié)miR-188/BCL9/β-catenin信號通路從而抑制HSC-3細胞的增殖和遷移。

2.4 改善腫瘤細胞耐藥性 腫瘤細胞具有高分裂、快分裂、高突變的能力，這就導(dǎo)致一種藥物無法對所有癌細胞都能發(fā)揮作用。此外，腫瘤細胞在機體內(nèi)轉(zhuǎn)移的速度非常快，能迅速地轉(zhuǎn)移到藥物作用不到或藥效比較弱的組織器官里，從而高效、精準地躲避藥物。最重要的是，腫瘤細胞可以淘汰藥物敏感的細胞，有耐藥性的腫瘤細胞則可以繼續(xù)無限增殖，因此改善腫瘤細胞耐藥性對抗癌具有重大意義。目前，有關(guān)靈芝多糖改善腫瘤細胞耐藥性的報道較少。LI W D等[47]探討了靈芝多糖對阿霉素（ADM）耐藥白血病細胞株K562/ADM多藥耐藥（MDR）的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)靈芝多糖能在K562/ADM細胞中逆轉(zhuǎn)MDR，并且能明顯逆轉(zhuǎn)K562/ADM對阿霉素的耐藥性，其作用機制是通過下調(diào)K562/ADM細胞中MDR-1和MRP1的表達來逆轉(zhuǎn)MDR。

2.5 促進腫瘤細胞凋亡 細胞凋亡是細胞內(nèi)預(yù)編程死亡的良好過程，是細胞生長控制的重要組成部分。細胞凋亡具有缺陷時可導(dǎo)致腫瘤細胞群的擴增[11]，因此控制腫瘤細胞的凋亡對控制腫瘤的發(fā)生和治療很重要。

李廣遠等[48]發(fā)現(xiàn)靈芝多糖可在體外直接抑制急性早幼粒細胞白血病NB4細胞的增殖并促其凋亡，但對NB4細胞增殖的抑制率及促凋亡率并不高，最高分別為33.5%及18.77%。雖然抑制率及促凋亡率不高，但靈芝多糖也可以在體外直接抑制或殺傷腫瘤細胞，作用效果可能與腫瘤的類型有關(guān)。LI W D等[47]探究了靈芝多糖抗結(jié)直腸癌的作用機制，通過采用流式細胞術(shù)檢測GLP對人結(jié)直腸癌細胞系T84和DiFi細胞凋亡率的影響。結(jié)果表明，GLP組的結(jié)直腸癌細胞凋亡率顯著高于空白組（P＜0.05），并且凋亡率與卡培他濱組接近（P＞0.05）。邢會軍等[12]研究表明，靈芝多糖會增加腫瘤細胞對凋亡的敏感性，從而起到促進腫瘤細胞凋亡的作用。LIANG Z等[49]在探究靈芝多糖對人結(jié)腸癌細胞（HCT-116）的抑制和誘導(dǎo)凋亡影響時發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖以時間和劑量依賴性的方式降低HCT-116細胞的活力，進而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡。其中凋亡表現(xiàn)為形態(tài)學改變、DNA碎片化、線粒體膜電位降低、S期種群增多、Caspase-3和Caspase-9活化。HSU W H等[50]還發(fā)現(xiàn)靈芝多糖可通過誘導(dǎo)細胞周期停滯和凋亡反應(yīng)從而有效抑制舌癌細胞的活力。ZHANG W K等[10]研究了靈芝破壁孢子水提取物靈芝多糖（GLP）對骨肉瘤的作用及其分子機制，結(jié)果表明GLP可促進HOS和U2-OS細胞中凋亡小體和自噬體的形成。

2.6 降低化療藥物毒性 靈芝多糖除直接作用于腫瘤細胞發(fā)揮抑瘤作用外，還可以通過輔助化療藥物抗癌和逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性而發(fā)揮抗癌作用。早期生長應(yīng)答因子1（Egr-1）表達量與腫瘤患者的生存期密切相關(guān)，Egr-1的高表達可以增強腫瘤對化療藥物及放射治療的敏感性。有研究[51]發(fā)現(xiàn)，Egr-1在機體多種惡性腫瘤細胞中表達含量低下甚至沒有。李廣遠等[48]發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖可明顯促進人類白血病細胞株NB4細胞Egr-1 mRNA和蛋白表達，提示靈芝多糖與化療藥物聯(lián)用可能具有良好的協(xié)同效應(yīng)，能降低化療藥物毒性及增強其藥效。多柔比星（DOX）是一種高效的抗癌藥物，但對心臟具有較大的毒性，限制了其臨床應(yīng)用，因此它需要與其他藥物聯(lián)合使用以降低其心臟毒性。XU F等[52]使用靈芝多糖治療DOX誘導(dǎo)H9c2大鼠的心肌細胞毒性，發(fā)現(xiàn)靈芝多糖改善了DOX處理的大鼠和H9c2細胞中的細胞死亡、線粒體凋亡、氧化應(yīng)激和促炎細胞因子的產(chǎn)生。此外，QIU W L等[53]采用靈芝多糖和順鉑聯(lián)合給藥治療肺癌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靈芝多糖能提高肺癌小鼠的存活率，降低順鉑在巨噬細胞和正常肺成纖維細胞中的細胞毒作用。

3 小結(jié)

靈芝多糖具有十分廣泛的藥理活性，目前已廣泛應(yīng)用于臨床增強腫瘤患者免疫力，延長生存期?？偟膩碚f，靈芝多糖抗腫瘤的作用機制最主要是通過增強免疫器官、免疫細胞和免疫活性物質(zhì)的效應(yīng)來提高宿主細胞的免疫力。此外，靈芝多糖可以抑制腫瘤細胞的增殖、遷移，誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，降低腫瘤細胞的耐藥性和降低化療藥物的毒性。目前靈芝多糖的研究主要集中在抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)方面。與其他免疫增效劑相比，靈芝多糖發(fā)揮藥效沒有毒副作用，且具有多靶點、多途徑的特點。這些優(yōu)點均表明靈芝多糖在臨床上應(yīng)用于抗腫瘤治療有著光明的前景。但是靈芝多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多，導(dǎo)致其抗腫瘤的作用機制復(fù)雜。其在體內(nèi)具體的作用靶點以及如何與靶點結(jié)合有待進一步的明確，而且其具體分子作用機制尚不完全清楚。此外，目前有關(guān)靈芝多糖抗腫瘤的臨床試驗比較少，而且具體的用藥劑量和給藥途徑仍需深入的研究。現(xiàn)靈芝多糖抗腫瘤的研究多采用靈芝總多糖作為藥物，較少將靈芝多糖進行分離純化，獲取單一組分多糖用于實驗。未來研究應(yīng)集中于多糖的基本結(jié)構(gòu)參數(shù)上，確定多糖的三維結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)功能之間的關(guān)系，然后再進行抗腫瘤活性研究。這可能更利于闡明靈芝多糖抗腫瘤的作用機制。