區(qū)帶毛細管電泳法同時分離分析金銀花及其制劑中的8 種有機酸

張春莉，黎升倩，曹秋娥，李 菲

(云南大學(xué) 化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650091)

金銀花（Honeysuckle）屬忍冬科忍冬屬（Lonicera japonica Thunb）植物，也被稱為雙花或忍冬[1]，主要生長在溫暖濕潤的斜坡地帶[2]，具有清熱涼血、散風(fēng)止痢的功效[3]，主要用于治療細菌感染性疾病[4].金銀花主要含有有機酸、黃酮類、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分[5]，其中有機酸中的綠原酸具有良好的抗病毒作用[6].有相關(guān)文獻報道，金銀花能治療新型冠狀病毒感染的肺炎 (COVID-19)，這可能是因為金銀花中綠原酸成分具有抗病毒的藥理作用[7].金銀花處于大白期時綠原酸含量影響DPPH 的自由基清除能力，新綠原酸和隱綠原酸會影響ABTS的自由基清除能力[8].金銀花中有機酸類活性成分在體外具有較好的抗凝血作用[9].因此，對金銀花中有機酸類活性成分進行分析檢測具有一定的現(xiàn)實意義.

目前，已有不少文獻報道了對金銀花中有機酸類成分的分析檢測，主要包括超高效液相色譜法[10-11]、紫外吸收光譜法[12]、液相色譜?質(zhì)譜法[13-14]、碳點熒光探針[15]以及毛細管電泳法[16].段慧芳[10]等采用超高效液相色譜法測定了不同產(chǎn)地金銀花中 7種有機酸、1 種黃酮和 2 種環(huán)烯醚萜類成分的含量，為金銀花藥材產(chǎn)地鑒定提供了依據(jù).賈學(xué)忠[12]使用紫外光譜分析方法定量檢測了金銀花中藥制劑中有機酸的含量，該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，可快速分析金銀花中的有機酸成分.李麗麗等[13]采用液相色譜?質(zhì)譜建立了金銀花代謝組學(xué)分析方法，定性分析了金銀花中157 個初生和次生代謝物，發(fā)現(xiàn)花期不同，金銀花次生代謝物含量就不同.金銀花中各種有機酸成分都具有不同的藥理作用，但這些方法并不能同時分析金銀花中異綠原酸A、1,3-二咖啡?？鼘幩帷?,5-二咖啡?？鼘幩?、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸C、新綠原酸和隱綠原酸等有機酸活性成分.毛細管電泳法與其他方法相比，具有高效、高靈敏度、進樣量少、選擇性好等特點，因此本文在系統(tǒng)優(yōu)化了電泳條件后，建立了一個能同時分離測定8 種有機酸成分的毛細管區(qū)帶電泳新方法，為金銀花及其制劑更加全面地分析和檢測提供了新依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑高效毛細管電泳儀（P/ACETMMDQ型）配有DAD 檢測器（Sciex，美國）；有效長度為50 cm 的未涂層石英毛細管（57 cm×?75 μm，河北省永年銳灃色譜器件有限公司）；pH 計（ST2100 型，奧豪斯儀器有限公司）.

異綠原酸A、1,3-二咖啡酰奎寧酸、1,5-二咖啡?？鼘幩?、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸C、新綠原酸和隱綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（結(jié)構(gòu)式見圖1，購于中國藥品生物制品鑒定所）.干燥的金銀花藥材經(jīng)云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陸樹剛教授鑒定為忍冬科忍冬屬（Lonicera japonica Thunb）的干燥花瓣.金銀花樣品1～4 分別為已開金銀花、未開金銀花、復(fù)方金銀花顆粒和銀黃膠囊（購自云南昆明健之佳藥店）.

圖1 8 種待測有機酸的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structures of eight investigated organic acids

實驗中使用的其他試劑均為分析純；水為UP級純水.

1.2 溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的8 種有機酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇為溶劑配制，再用甲醇稀釋儲備液得到標(biāo)準(zhǔn)工作溶液.

1.2.2 樣品溶液配制 分別準(zhǔn)確稱取干燥后的金銀花樣品1（0.202 4 g）、樣品2（0.208 4 g）、復(fù)方金銀花顆粒（0.210 1 g）和銀黃膠囊（0.502 8 g，去膠囊），置于錐形瓶中，分別加入25 mL 70%（體積分數(shù)）乙醇，超聲1 h，取出搖勻并過濾蒸干，用甲醇溶解殘渣并定容至50 mL.

1.2.3 運行電解質(zhì)溶液 由含1.2%（體積分數(shù)）三乙醇胺、0.3%（體積分數(shù)）四氫呋喃、2.0%（體積分數(shù)）異丙醇的硼砂（30 mmol/L）-NaH2PO4（10 mmol/L）緩沖溶液（pH 8.64）組成運行電解質(zhì)溶液.

上述溶液于 4 ℃冰箱中保存（運行電解質(zhì)溶液除外），溶液使用前均用0.45 μm 濾膜過濾.

1.3 實驗方法20 kV 分離電壓，3 s（壓力3 447.38 Pa）進樣，檢測波長326 nm 和柱溫25℃的儀器條件.

儀器開機前，分別用0.1 mol/L NaOH 溶液、純水和分離緩沖溶液沖洗毛細管5、5 min 和10 min；重復(fù)運行之間分別用純水和分離緩沖溶液沖洗毛細管2、4 min.

2 結(jié)果與討論

2.1 分離背景溶液的pH 值及濃度對分離的影響由圖1 結(jié)構(gòu)式可知，8 種有機酸在堿性電解質(zhì)溶液中容易電離而帶負電，有利于待測組分的分離和檢測.因此實驗所需電解質(zhì)溶液暫時選用硼砂和磷酸鹽共同組成，并在pH 值7.73～9.26 的范圍內(nèi)研究了pH 對分離的影響.結(jié)果如圖2 所示，隨著pH增大，各組分的遷移時間增加，分離度有所增大，但是pH 越高，基線噪音也越大，容易斷流.因此為了保證分離的重現(xiàn)性，實驗選擇8.64 作為分離pH.

圖2 pH 值對8 種活性物質(zhì)遷移時間的影響Fig.2 Effect of pH on migration time of eight active substances

當(dāng)緩沖溶液pH 為 8.64 時，實驗研究了Na2HPO4（36.0 mmol/L）-NaH2PO4（4.0 mmol/L）緩沖溶液和Na2B4O7（30.0 mmol/L）-HCl（2.0 mmol/L）緩沖溶液對待測組分分離度的影響.結(jié)果如圖3 所示，新綠原酸在兩種緩沖溶液中都未出峰，并且電泳圖基線噪音大.因考慮到硼砂中的硼原子與待測物中的鄰羥基絡(luò)合可以促進待測物分離，磷酸鹽能穩(wěn)定基線并改善檢測的靈敏度，所以選擇混合硼砂和磷酸鹽作為實驗的分離背景溶液.

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液在兩種緩沖溶液中的電泳圖Fig.3 Electrophoresis diagram of the standard mixed solution in two separating background solution

在pH 為8.64（10 mmol/L NaH2PO4）的條件下，實驗進一步研究了在20～40 mmol/L 濃度范圍內(nèi)硼砂濃度對各待測組分分離度的影響（圖4）.

圖4 不同濃度的硼砂對8 種活性物質(zhì)分離的影響Fig.4 Effect of different concentration of Na2B4O7 on separation of eight active substances

如圖4 所示，隨著硼砂濃度的增加，各待測組分的分離時間增加.當(dāng)硼砂濃度<30 mmol/L 時，各待測組分的峰形尖銳，但部分峰之間有重疊，不能完全分離；隨著硼砂濃度的繼續(xù)增加，雖然各待測組分的分離度有所改善，但部分組分間的分離度依然很低，如異綠原酸B 和異綠原酸C.由圖5 可見，加入30 mmol/L 硼砂后，各組分之間分離效果較好，遷移時間也沒有大幅度延長.因此實驗選擇30 mmol/L的硼砂和10 mmol/L 的NaH2PO4溶液（pH=8.64）作為分離背景溶液.

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液在Na2B4O7（30 mmol/L）-NaH2PO4（10 mmol/L）緩沖溶液（pH 8.64）中的電泳圖Fig.5 Electrophoresis diagram of the standard mixed solution in 30 mmol/L Na2B4O7+10 mmol/L NaH2PO4 separating background solution (pH=8.64)

2.2 三乙醇胺對分離效果的影響為了改善8 種有機酸的分離度同時穩(wěn)定基線，實驗嘗試在分離背景溶液中添加不同體積分數(shù)的三乙醇胺，結(jié)果見圖6.隨著三乙醇胺濃度的增加，部分有機酸之間的分離度增加，其余有機酸之間的分離度先增加后下降，且延長了分析時間.所以實驗選擇在分離背景溶液中加入1.2%（體積分數(shù)）的三乙醇胺改善分離度，結(jié)果如圖7 所示.

圖6 三乙醇胺體積分數(shù)對8 種有機酸遷移時間的影響Fig.6 Effect of triethanolamine volume fraction on migration time of eight organic acids

圖7 在含有1.2%（體積分數(shù)）三乙醇胺的Na2B4O7（30 mmol/L）-NaH2PO4（10 mmol/L）緩沖溶液（pH=8.64）中的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液電泳圖Fig.7 Electrophoresis diagram of the standard mixed solution in separating background solution adding a volume ratio of 1.2% triethanolamine (pH=8.64)

由圖7 電泳圖可知，加入三乙醇胺后，基線更平穩(wěn)，峰形更好.因此，實驗選擇在分離背景溶液中加入1.2%（體積分數(shù)）的三乙醇胺提高各待測組分的分離度.

2.3 四氫呋喃對分離的影響為了進一步提高分離度和改善基線，實驗嘗試在緩沖溶液中加入不同濃度的Cu2+.結(jié)果表明，加入Cu2+對提高分離度有一定幫助，但基線會變差.因此，實驗沒有選擇在上述確定的分離背景溶液中加入Cu2+，故又嘗試加入四氫呋喃，并研究了其濃度對實驗分離度的影響.由圖8 可見，加入四氫呋喃提高了異綠原酸B和異綠原酸C 之間的分離度，但隨著四氫呋喃濃度的增大，部分峰拖尾也就越明顯，基線噪音也會隨之增大.當(dāng)四氫呋喃體積分數(shù)為0.3%時，改善了電泳圖中的峰形，提高了異綠原酸B 和異綠原酸C 之間的分離度.因此實驗最終選擇在分離背景溶液中加入體積分數(shù)為0.3%的四氫呋喃（圖9）.

圖8 不同體積分數(shù)的四氫呋喃對8 種活性物質(zhì)分離的影響Fig.8 Effect of different volume fraction of tetrahydrofuran on separation of eight active substances

圖9 標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液在分離背景溶液中加入0.3%（體積分數(shù)）四氫呋喃后的電泳圖Fig.9 Electrophoresis diagram of the standard mixed solution in the separation background solution adding a volume ratio of 0.3% tetrahydrofuran

2.4 異丙醇含量的影響為進一步改善異綠原酸B 和異綠原酸C 之間的分離度，在上述分離背景溶液中添加異丙醇.結(jié)果顯示，異丙醇雖然改善了各峰之間的分離效果，但各峰有展寬、拖尾的趨勢.因此實驗還研究了異丙醇濃度在0.5%～8.0%（體積分數(shù)）范圍內(nèi)對8 種有機酸分離效果的影響.結(jié)果顯示，當(dāng)異丙醇體積分數(shù)<2.0%時，分離效果不明顯；當(dāng)異丙醇體積分數(shù)>2.0%時，峰會拖尾且遷移時間也會延長.綜上分析，實驗選擇在分離背景溶液中加入2.0%（體積分數(shù)）的異丙醇來改善各待測組分的分離度，結(jié)果如圖10 所示.此時8 個待測組分均已實現(xiàn)基線分離，且峰形尖銳、基線平穩(wěn)，因此實驗最終選擇含1.2%三乙醇胺、0.3%四氫呋喃和2.0%異丙醇（均為體積分數(shù)）的Na2B4O7（30 mmol/L）?NaH2PO4（10 mmol/L）緩沖溶液（pH=8.64）作為運行電解質(zhì)溶液.

圖10 標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液在分離背景溶液中加入2.0%（體積分數(shù)）異丙醇后的電泳圖Fig.10 Electrophoresis diagram of the standard mixed solution in the separation background solution adding a volume ratio of 2.0% isopropanol

2.5 儀器條件對分離的影響在確定分離背景溶液組成后，實驗還研究了分離電壓和進樣時間對8種目標(biāo)分析物分離的影響.結(jié)果表明，在18～28 kV的范圍內(nèi)，當(dāng)分離電壓>20 kV 時，雖然可以縮短分離時間，但基線噪音會增大；當(dāng)分離電壓<20 kV 時，勉強改善了各待測組分的分離度，但各峰會嚴重拖尾.若進樣時間在3～8 s 內(nèi)增加，則各峰分離度就會隨之下降.綜合以上分析后，實驗最終選定的儀器條件為：20 kV 的分離電壓、3 447.38 Pa 壓力進樣3 s.

采用選定的運行電解質(zhì)溶液和儀器條件，8 種有機酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液檢測結(jié)果如圖11 所示.可以發(fā)現(xiàn)，該條件在17 min 內(nèi)能實現(xiàn)8 種待測組分的基線分離，且具有良好的重現(xiàn)性.

圖11 8 種有機酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的電泳圖Fig.11 Electrophoresis diagram of the standard mixed solution of eight organic acids under optimized conditions

2.6 工作曲線與方法精密度驗證采用最終優(yōu)化所得的實驗條件，將1.2 節(jié)中不同濃度的有機酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液依次進行分析測定.根據(jù)各有機酸的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，結(jié)果如表1 所示.另外，5 次平行測定質(zhì)量濃度均為50 μg/mL 的各待測組分標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液.由表1 可見，各有機酸的峰面積與質(zhì)量濃度的回歸方程相關(guān)系數(shù)均≥0.999，說明二者之間相關(guān)性較強.由同一實驗員在不同日期進行5 次平行測定，8 種待測組分的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的峰面積和保留時間的RSD值均小于5%.不同實驗員進行5 次平行測定后所得的峰面積和保留時間的RSD 值均小于3%.

表1 各目標(biāo)分析物的工作曲線和重復(fù)性測定結(jié)果(n=5)Tab.1 Working curve and repeatability of each investigated composition (n=5)

2.7 樣品分析采用最終優(yōu)化得到的毛細管電泳方法，對每個處理好的樣品溶液進行分離檢測.各樣品的電泳圖如圖12 所示，4 個樣品中各待測組分的測定結(jié)果見表2 和表3.由測定結(jié)果可知，4 個樣品均未檢出1,5-二咖啡?？鼘幩岷?,3-二咖啡?？鼘幩?，樣品3 中只檢出綠原酸和異綠原酸A，可能該方法檢出限沒有達到檢出該樣品成分的要求.在樣品1、樣品2 和樣品4 中，綠原酸含量相對較高.各組分含量的RSD 值均小于3%，說明本文所建立的方法可有效分離檢測金銀花及其制劑中的8 種有機酸，該分析方法具有一定實用性.

表2 金銀花樣品中8 種目標(biāo)成分含量測定的結(jié)果 (n=3)Tab.2 Determination of eight investigated compositions in samples (n=3)

表3 金銀花樣品中8 種目標(biāo)成分回收率測定結(jié)果(n=3)Tab.3 Determination results of recoveries of eight investigated compositions in samples (n=3)

圖12 4 個金銀花及制劑樣品的電泳圖Fig.12 Electrophoresis of four samples of Honeysuckle

3 結(jié)論

本實驗對分離背景溶液以及儀器條件進行優(yōu)化后，采用區(qū)帶毛細管電泳分析方法，在17 min 內(nèi)實現(xiàn)8 種有機酸有效分離與檢測.該方法操作簡單，線性良好，滿足定性和定量檢測的相關(guān)要求，為金銀花及相關(guān)中成藥的質(zhì)量控制提供了新依據(jù).