一種新型黏度和硫化氫熒光探針的制備及應(yīng)用

杜宇婷，潘彩霞

(忻州師范學(xué)院 化學(xué)系，山西 忻州 034000)

硫化氫（H2S）是一種重要的生理氣體分子[1].許多證據(jù)表明，H2S 與一些疾病相關(guān)如炎癥和癌癥等相關(guān)[2-3]，并且它被公認(rèn)為可以調(diào)節(jié)廣泛的生理過程比如血管擴(kuò)張、血管生成、細(xì)胞凋亡和和神經(jīng)調(diào)節(jié)等[4-8].在生物學(xué)上，H2S 與某些細(xì)胞器有關(guān)如線粒體[9-10]，線粒體內(nèi)的H2S 已被證實在氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡中具有保護(hù)作用[11-13].另外，細(xì)胞內(nèi)的黏度是一個重要的微環(huán)境參數(shù)，在維持細(xì)胞內(nèi)最基本的信號中發(fā)揮重要的作用[14].更加重要的是，H2S 水平的異常和黏度改變兩者都與阿爾茨海默病(AD)和帕金森疾病有關(guān)[15-18].因此，開發(fā)一種有效的檢測工具同時監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)H2S 和黏度對阿爾茨海默病(AD)和帕金森疾病的探究和診斷具有重要意義.

在眾多分析方法中，熒光探針技術(shù)被認(rèn)為是最有發(fā)展前途的生物傳感技術(shù)，因為它能夠?qū)崿F(xiàn)原位實時監(jiān)測，具有極好的的生物相容性和實現(xiàn)高空間和時間分辨率等[19-24].熒光探針能夠廣泛用于檢測細(xì)胞內(nèi)和動物體內(nèi)離子、代謝物和生物分子等[25-27].目前，大多數(shù)熒光探針已被廣泛應(yīng)用于檢測特定的分析物，但是它們很難做到同時檢測多種生物分子[28-32].近年來，雖然已經(jīng)報道了一系列的熒光探針響應(yīng)H2S[33-38]或者黏度[39-40]，但是能夠同時檢測黏度和硫化氫的探針很少.因此，迫切需要設(shè)計一種用于多種生物分子檢測的熒光探針.Zhao 等[41]2018 年報道了一種基于熒光團(tuán)氟硼吡咯的雙功能熒光探針，能夠同時響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)黏度的增加和H2S的濃度變化.另外，Li 等[42]報道了一個能夠靶向黏度和H2S 的雙功能熒光探針.這些雙功能熒光探針檢測H2S 的機理主要是探針分子中疊氮化物被還原，從而造成了熒光出現(xiàn)的現(xiàn)象.然而，這些探針是被紫外光激發(fā)，并且疊氮化物會被紫外光分解，使得探針可能會產(chǎn)生錯誤的信號.因此，發(fā)展一種穩(wěn)定性高的新型雙功能熒光探針同時檢測黏度和H2S 很有必要.

在本工作中，我們設(shè)計合成了一個可以同時響應(yīng)黏度和H2S 的探針Mito-ANP，該探針以9-蒽甲醛作為熒光團(tuán).如圖1 所示，由于在低黏度下，單鍵可以自由旋轉(zhuǎn)，因此，探針分子的熒光可以忽略不計.隨著體系黏度的增加，探針分子的轉(zhuǎn)動受到限制，Mito-ANP的熒光強度在620 nm 處顯著增加.同時，探針分子Mito-ANP中吡啶鹽有很強的吸電子能力，可以與親核試劑H2S 發(fā)生親核加成反應(yīng)[40]，探針的共軛體系從而被破壞，使得Mito-ANP的熒光發(fā)射波長從620 nm 藍(lán)移到568 nm，實現(xiàn)了探針對黏度和H2S 的同時響應(yīng).另外，Mito-ANP對H2S 有很好的選擇性和靈敏度，它對H2S 的最低檢測限僅為12.89 nmol/L.Mito-ANP還能用于神經(jīng)細(xì)胞中硫化氫和黏度變化的熒光成像.

圖1 雙功能熒光探針Mito-ANP 對黏度和H2S 的設(shè)計機理Fig.1 Rational design of a dual-function fluorescent probe Mito-ANP for viscosity and hydrogen sulfide

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器4-甲基吡啶、2-溴乙醇、9-蒽甲醛購自安耐吉化學(xué)劑有限公司；六氫吡啶購自上海泰坦科技有限公司；二氯甲烷、無水乙醇、乙酸乙酯和石油醚均購自天津歐博凱化工有限公司；三氯甲烷從成都市科隆化學(xué)品有限公司購進(jìn).0.054～0.077 mm（200～300 目）柱層析硅膠（青島海洋化工公司）.所用試劑均為分析純，使用時無需進(jìn)一步的純化.所用去離子水（≥ 18 MΩ·cm）由 Milli-Q純化系統(tǒng)制備.

DF-101S 型集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；循環(huán)水真空泵；FS5 熒光光譜儀（英國愛丁堡公司）；UV-2550 型紫外可見分光光度計（賽默飛公司）；Bruker AVANCE-400 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀（德國）；布魯克高分辨質(zhì)譜儀.

1.2 探針Mito-ANP 的合成稱取4-甲基吡啶（0.8 g) 置于圓底燒瓶中，在攪拌狀態(tài)下緩慢加入2-溴乙醇（0.61 mL）（分子比為1∶1），在70 ℃下反應(yīng)24 h 左右，TLC 跟蹤反應(yīng) (V乙酸乙酯：V石油醚=1∶5).待反應(yīng)完成后，用無水乙醇洗滌固體，并且用超聲震碎固體，固體溶解.懸干溶劑后，將得到的果凍狀液體置于冷凍液中，直至析出固體，得到1.7 g 化合物1，產(chǎn)率為87%.

稱取0.5 g 化合物1置于圓底燒瓶中，加入適量三氯甲烷，超聲震碎溶解，溶液呈白色渾濁液.然后加入6～7 滴六氫吡啶攪拌均勻后，再往溶液體系中緩慢加入9-蒽甲醛（0.51 g）（分子比為1∶1），在70 ℃下回流.溶液顏色變黃，回流10 min 左右，體系顏色逐漸加深至暗紅色.反應(yīng)24 h 左右，TLC跟蹤反應(yīng) (V乙酸乙酯：V石油醚=1∶5).待反應(yīng)完成后，懸干溶劑，用無水乙醇洗滌、抽濾、干燥得到0.85 g探針分子Mito-ANP，產(chǎn)率為84%.1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 9.04 (d,J=4 Hz,1H),8.99 (d,J=12 Hz,2H),8.72 (s,1H),8.56 (d,J=4 Hz,2H),8.39(d,J=8 Hz,2H),8.18 (d,J=8 Hz,2H),7.61 (m,4H),7.36 (d,J=12 Hz,1H),5.31 (t,J=4,8 Hz,1H),4.67(t,J=4,8 Hz,2H),3.92 (d,J=4Hz,2H)；13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ: 152.7，145.4，138.1，132.6，131.4，130.5，129.5，129.4，128.9，127.2，126.1，125.8，124.6，62.7，60.7.MS (C23H20NO)m/z實測值（計算值）: 326.152 7 [M].探針Mito-ANP的合成路線見圖2.

圖2 探針Mito-ANP 的合成路線Fig.2 Synthetic route of the probe Mito-ANP

1.3 熒光探針Mito-ANP 對黏度的光譜特性探針Mito-ANP用二甲基亞砜（DMSO）溶解，并且配置成10 mmol/L 的母液.不同黏度的液體使用磷酸緩沖液（PBS，pH=7.4）與甘油不同的比例制得.在測定熒光光譜時，將探針Mito-ANP的濃度稀釋至5 μmol/L，在不同體積比例PBS 和甘油混合溶液中測試熒光發(fā)射強度.激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度都設(shè)置為5 nm.探究探針的熒光發(fā)射強度和溶液黏度的關(guān)系遵循福斯特方程[43]：LogIf=c+xLogη，其中If為熒光強度，η為黏度，x和c是常數(shù).

1.4 熒光探針Mito-ANP 對硫化氫（H2S）的光譜特性硫化鈉（Na2S·9H2O）用二蒸水稀釋，配制成100 mmol/L 的母液作為硫化氫（Na2S）的來源.在測定熒光光譜時，把一定量的Na2S 和其他分析物加入到探針溶液中.測試時，將探針Mito-ANP的濃度稀釋至5 μmol/L，所有的光譜測試都在CH3CN/PBS 的緩沖溶液中進(jìn)行 (VCH3CN∶VPBS=1∶1，10 mmol/L，pH=7.4).探究探針Mito-ANP對不同氨基酸如半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH）、賴氨酸（Lysine）、色氨酸（Tryptophan）、蘇氨酸（Threonine）以及核苷酸（Nucleotide），維生素如維生素C（Vitamin C）、維生素D（Vitamin D），和各種陰離子如Br?、CI?、SO42?、SO32?、NO3?、NO2?的選擇性實驗時，將這些分析物用二蒸水配置成終濃度為1 mmol/L 的母液.激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度都設(shè)置為5 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 探針Mito-ANP 對黏度的光譜響應(yīng)如圖3(a)，當(dāng)體系的黏度從1.03×10?3Pa·s（100%PBS）增加到902.52 ×10?3Pa·s（90%甘油）時，探針Mito-ANP分子內(nèi)扭曲轉(zhuǎn)移電荷被限制，使得探針在620 nm 處隨著黏度的增加，熒光強度逐漸增強，最大增強了8.5 倍左右.值得注意的是，如圖3(b)，在黏度為1.03×10?3～954.52×10?3Pa·s 的范圍內(nèi)，根據(jù)福斯特方程（LogIf=c+xLogη），探針熒光強度的對數(shù)與黏度對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，線性公式為y=0.105x+3.73，線性關(guān)系數(shù)R2=0.993.另外，在不同溶劑中，探針的熒光發(fā)射強度也不同.如圖3(c)所示，在二甲基亞砜（DMSO）、甲醇，乙醇、乙腈、PBS 和甘油中，Mito-ANP的熒光強度增強僅在甘油中有顯著的增強，而在其他溶劑中只有微弱的變化，這主要是歸因于甘油的高黏度.以上數(shù)據(jù)說明，Mito-ANP對黏度有很好的響應(yīng).

圖3 探針Mito-ANP 在不同體積比PBS -甘油溶液中黏度響應(yīng)的熒光光譜、線性曲線及在不同溶劑中的熒光光譜Fig.3 Fluorescent spectra of Mito-ANP for viscosity in different volume ratios PBS-glycerol solution，linear graph and fluorescent spectra of Mito-ANP in different solvents

2.2 探針分子Mito-ANP 在不同溶劑中的絕對熒光量子產(chǎn)率如表1 所示，探針Mito-ANP在乙腈極性溶劑中的絕對熒光量子產(chǎn)率最高，因此選擇乙腈作為測試探針響應(yīng)硫化氫（H2S）的溶劑.

表1 不同溶劑中絕對熒光量子產(chǎn)率的對比Tab.1 A comparison of the absolute fluorescent quantum yield in different solvents

2.3 探針分子Mito-ANP 對H2S 的光譜響應(yīng)如圖4(a)所示，在CH3CN/ PBS 的緩沖溶液中(VCH3CN∶VPBS=1∶1，10 mmol/L，pH=7.4)，隨著不同濃度Na2S 的加入，探針Mito-ANP的熒光強度在568 nm 處的熒光強度逐漸增強，說明探針Mito-ANP對H2S 有很好的響應(yīng).同時，如圖4(b)所示，在0～25 μmol/L范圍內(nèi)，探針的熒光強度與Na2S的濃度呈良好的線性關(guān)系，其線性公式為y=618.13x+6 150.31，R2=0.994).根據(jù)LOD=3Sb/k公式計算得到探針Mito-ANP對H2S 的最低檢測限僅為12.89 nmol/L.

圖4 探針Mito-ANP 在測試體系中的熒光光譜和線性曲線Fig.4 Fluorescent spectra of Mito-ANP in test system and linear graph

2.4 探針Mito-ANP 對H2S 的反應(yīng)選擇性和pH依賴性探針的選擇性和pH 依賴性是評價探針在生理條件下準(zhǔn)確檢測H2S 的前提.因此，我們測試了探針Mito-ANP對H2S 的選擇性和pH 依賴性.如圖5(a)所示，只有加入Na2S 才能引起探針的熒光強度增加，而其他氨基酸（如Cys，Hcy，GSH，Lysine，Tryptophan，Threonine），以及核苷酸（Nucleotide），維生素（如Vitamin C，Vitamin D）和其他陰離子（如Br?、CI?、SO42?、SO32?、NO3?、NO2?）的加入只能引起探針熒光強度的微弱變化.在pH 測試中，Mito-ANP在pH 值為4～10 的范圍內(nèi)，熒光強度在568 nm 處穩(wěn)定性很好，不受酸堿體系的影響，見圖5(b).當(dāng)加入Na2S 后，隨著pH 值的增加，探針的熒光強度在568 nm 處明顯增強，這是由于Na2S 在堿性環(huán)境中具有較高的親核性.上述結(jié)果表明，探針Mito-ANP對H2S 有專一的選擇性和良好的pH 耐受性.

圖5 探針Mito-ANP 在測試體系中的選擇性熒光柱狀圖和pH 響應(yīng)Fig.5 The fluorescent intensity of Mito-ANP with Na2S and other analytes in test system and pH response

2.5 探針分子Mito-ANP 對H2S 檢測的識別機理研究為了進(jìn)一步驗證推測的機理（圖1），即探針Mito-ANP與Na2S 發(fā)生親核加成反應(yīng)[圖6（a）]，我們利用高分辨質(zhì)譜滴定實驗驗證.如圖6(b)所示，特征峰m/z為360.141 66，這是歸因于[(Mito-ANP) +SH]的分子離子峰，與之前文章報道的反應(yīng)機理相類似[40].以上結(jié)果說明，探針Mito-ANP與Na2S 發(fā)生親核加成反應(yīng).

圖6 探針Mito-ANP 對H2S 的響應(yīng)機制和反應(yīng)前的高分辨質(zhì)譜圖Fig.6 The proposed response mechanism of Mito-ANP towards H2S and HRMS spectra of Mito-ANP before reaction

2.6 探針分子Mito-ANP 在帕金森疾病疾病模型中的應(yīng)用帕金森病是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，與生物硫醇如還原型谷胱甘肽（GSH），半胱氨酸（Cys）和高半胱氨（Hcy）水平密切相關(guān)[44-45],這些生物硫醇在細(xì)胞內(nèi)可以被代謝產(chǎn)生硫化氫[46].為了探究探針Mito-ANP在帕金森疾病模型中的應(yīng)用，我們首先用6-羥基多巴胺（6-OHDA）處理神經(jīng)細(xì)胞PC12 建立帕金森病細(xì)胞模型.結(jié)果如圖7 所示，當(dāng)PC12 細(xì)胞與探針Mito-ANP（10 μmol/L）共孵育時，細(xì)胞在綠色通道有較強的熒光.然而，PC12 細(xì)胞被6-OHDA 預(yù)處理后，綠色通道熒光強度下降顯著并且伴隨部分細(xì)胞死亡.這個結(jié)果表明帕金森癥的病理生理和病理過程與硫化氫的消耗密切相關(guān).

圖7 Mito-ANP 在帕金森疾病模型中的應(yīng)用Fig.7 Application of Mito-ANP in Parkinsons disease model

接下來，我們研究了Mito-ANP對PC12 細(xì)胞黏度的響應(yīng).制霉菌素可通過破壞子平衡，誘發(fā)線粒體結(jié)構(gòu)改變，從而導(dǎo)致線粒體黏度明顯增加[47].結(jié)果如圖8 所示，當(dāng)PC12 細(xì)胞與探針Mito-ANP（10 μmol/L）共孵育時，細(xì)胞在紅色通道有微弱的熒光.當(dāng)PC12 細(xì)胞被制霉菌素預(yù)處理后，紅色通道熒光強度顯著增強.這個結(jié)果表明Mito-ANP可以特異性地檢測線粒體黏度.

圖8 Mito-ANP 對PC12 細(xì)胞黏度的響應(yīng)Fig.8 Response of Mito-ANP to PC12 cell viscosity

3 結(jié)論

本文設(shè)計合成了一個同時靶向黏度和H2S 的熒光探針Mito-ANP.隨著體系黏度的增加，探針Mito-ANP分子內(nèi)扭曲轉(zhuǎn)移電荷被限制，熒光強度從而逐漸增強.另外，探針Mito-ANP還能夠與H2S 發(fā)生親核加成反應(yīng)，它對H2S 的最低檢測限僅為12.89 nmol/L，說明該探針對H2S 檢測的靈敏度很高.同時，探針對H2S 也具有很好的選擇性.更重要的是，探針Mito-ANP還能成功地用于神經(jīng)細(xì)胞中硫化氫和黏度變化的熒光成像.這項工作提供了一種新型熒光探針，它能夠靶向黏度和H2S，也為早期發(fā)現(xiàn)阿爾茲海默疾病提供了一種可能方法.