蓖麻根腐病抗性鑒定及其SSR標(biāo)記的初步建立

劉海燕 陸建農(nóng) 殷學(xué)貴 顧帥磊 謝鈺 張柳琴 黃冠榮 劉朝裕 張肖肖 左金鷹

摘 要：? 蓖麻根腐病是茄腐鐮孢菌（Fusarium solani）引起的根部病害，嚴(yán)重影響蓖麻產(chǎn)量?？乖慈狈χ萍s了抗病品種的選育。為尋找抗病種質(zhì)、建立抗性分子標(biāo)記，該研究對(duì)252份蓖麻材料的抗性進(jìn)行了表型和分子標(biāo)記鑒定。結(jié)果表明：（1）濃度為1×106個(gè)·mL-1的孢子懸浮液灌根是一種有效的接種方法；以接種后枯萎天數(shù)為基礎(chǔ)的5級(jí)評(píng)價(jià)法，可作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)。（2）鑒定出130份抗病材料，其中高抗為105份。（3）野生材料中抗病材料比率（66%）遠(yuǎn)高于栽培材料（35%），建議將野生材料，尤其是中國(guó)華南野生材料的研究利用作為今后抗病育種的重要方向。（4）初步建立了8個(gè)與抗性關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記。該研究結(jié)果提供了有效的根腐病抗性鑒定方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，篩選出了一批育種迫切需要的抗病基因資源，初步建立了可用于輔助選擇的SSR標(biāo)記，為蓖麻抗根腐病育種奠定了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 蓖麻， 根腐病， 抗病性鑒定， 茄腐鐮孢菌， 孢子懸浮液， SSR

中圖分類號(hào)：? Q943; S43

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2023）07-1326-09

收稿日期：? 2022-05-17

基金項(xiàng)目：? 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A020208116，2016A020208015）。

第一作者： 劉海燕（1996-），碩士研究生，研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種，（E-mail）lhylau@163.com。

通信作者：? 殷學(xué)貴，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楸吐榉N質(zhì)資源與遺傳育種，（E-mail）yinxuegui@126.com。

Identification of resistance to root rot and preliminary

establishment of its SSR markers in castor bean

LIU Haiyan， LU Jiannong， YIN Xuegui*， GU Shuailei， XIE Yu， ZHANG Liuqin，

HUANG Guanrong， LIU Chaoyu， ZHANG Xiaoxiao， ZUO Jinying

（ College of Coastal Agricultural Sciences， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524088， Guangdong， China ）

Abstract：? Castor bean root rot is a root disease caused by Fusarium solani， which seriously threatens the production of castor bean. Due to the lack of resistance genes， the breeding for root rot resistance in castor bean is seriously restricted. In order to mine resistant resources and establish resistant molecular markers， the phenotypic and molecular marker identification was performed on the disease resistance of 252 castor bean accessions in this study. The results were as follows： （1） Irrigating roots with the conidia suspension of 1×106 spores·mL-1 was an effective inoculation method. The 5-grade evaluation method based on the days of wilt after inoculation could be used as the criteria to evaluate the resistant level of accessions objectively. （2） According to the criteria， the resistance of 252 accessions were divided into five grades from high to low， among which Grade 1 was high resistance and Grade 2 was moderate resistance. The number of accessions with different grades from 1 to 5 were 105， 25， 33， 31 and 58， respectively， accounting for 42%， 10%， 13%， 12% and 23%， respectively. A total of 130 resistant accessions were identified， of which 105 were high resistance and 25 were moderate resistance. （3） The proportion of resistant accessions in wild accessions （66%） was much higher than that in cultivated accessions （35%）. Among wild accessions from South China， 69% were resistant accessions， and 60% were high resistance accessions. It is strongly suggested that the research and utilization of wild accessions， especially the wild accessions in South China， should be an important direction of resistance breeding in the future. （4） Eight SSR markers associated with the resistance were preliminarily established. Although different resistant accessions carried different markers or marker combinations， most of them carried three to four of the above markers， therefore， they can be used as resistant molecular markers for assisted selection. The results of this study provide an effective method and evaluation criteria for root rot resistance identification， screen out a number of resistance genetic resources urgently needed in breeding， and preliminarily establish the SSR markers available for assisted selection， which lay an important foundation for resistance breeding of castor bean root rot.

Key words： castor bean， root rot， resistance? identification， Fusarium solani， conidia suspension， SSR

蓖麻（Ricinus communis）屬于大戟科蓖麻屬植物，一年生草本或多年生草質(zhì)木本，是重要的工業(yè)用油作物。蓖麻的主要經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于蓖麻油。由于獨(dú)特的理化性質(zhì)，蓖麻油廣泛應(yīng)用于航空航天、機(jī)械制造、醫(yī)藥化工、紡織印染等領(lǐng)域（Fan et al.， 2019; Xu et al.， 2021）。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外對(duì)蓖麻油的需求持續(xù)增加，市場(chǎng)供不應(yīng)求。然而，由于缺乏高產(chǎn)抗病品種，近十幾年來(lái)，我國(guó)蓖麻種植面積持續(xù)減少，蓖麻籽進(jìn)口依賴率持續(xù)高達(dá)90%以上。

蓖麻病害種類繁多，中國(guó)報(bào)道的有30多種（湯健蓉等，2021），國(guó)外報(bào)道的有50多種（Parmar et al.， 2018），其中枯萎病是最主要的病害，其病原菌為尖孢鐮刀菌蓖麻?；停⊿haw et al.， 2018， 2022）。目前枯萎病還沒(méi)有統(tǒng)一的鑒定方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)外常用的接種方法有浸根法（Dange & Desai， 2003; Raoof et al.， 2008）、病盆法（Shaw et al.， 2016， 2022）、灌根法（Raoof et al.， 2008; Shaw et al.， 2016）和浸種法（Shaw et al.， 2016）。浸根法和病盆法工作量大且繁瑣，不適合大批量鑒定；浸種法雖然操作簡(jiǎn)單，但接種感染率低，其可靠性還有待驗(yàn)證（Shaw et al.， 2016）；灌根法操作簡(jiǎn)單，只要選擇適宜的菌液濃度，即可模擬大田發(fā)病條件，對(duì)材料作出客觀評(píng)價(jià)。國(guó)內(nèi)根據(jù)莖葉病斑大小及數(shù)量將枯萎病抗性劃分為0～4共5個(gè)等級(jí)（沙洪林等，2002；劉偉等，2012）；國(guó)外主要根據(jù)發(fā)病率（Kumar et al.， 2015）、死亡天數(shù)（Shaw et al.， 2016）和枯萎天數(shù)（Shaw et al.， 2018， 2022）進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。

隨著蓖麻在華南地區(qū)種植面積的增加，發(fā)病程度也日趨嚴(yán)重，平均發(fā)病率為26%，嚴(yán)重的地塊超過(guò)50%，甚至全田死亡。經(jīng)采樣分離和基因組測(cè)序鑒定證明，最主要的病害是根腐病，病原菌為茄腐鐮孢菌（Fusarium solani）（Zhou et al.， 2019）。除病原菌不同之外，根腐病發(fā)病癥狀與枯萎病完全相同，均表現(xiàn)為根部維管組織變黑、葉片萎蔫、最后整株枯萎、根系腐爛而死亡。目前尚無(wú)根腐病抗性鑒定方法、評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和抗性種質(zhì)資源篩選方面的研究報(bào)道。

蓖麻是一個(gè)遺傳多樣性很低的物種（Allan et al.， 2008；Bajay et al.， 2009）。近年來(lái)，Xu等（2019， 2021）將目光投向了野生材料，證明野生材料的遺傳多樣性高于栽培材料，而中國(guó)華南野生材料的遺傳多樣性又高于已報(bào)道的其他蓖麻群體（汪亞菲等，2019；Agyenim-Boateng et al.， 2019; 楊婷等，2020）。其中，中國(guó)廣東的材料遺傳多樣性最高，其次是中國(guó)廣西，中國(guó)海南的最低（汪亞菲等，2019；Agyenim-Boateng et al.， 2019）。這意味著野生蓖麻材料，尤其是中國(guó)華南野生蓖麻材料中可能蘊(yùn)藏著更多的抗性材料。

本研究以252份蓖麻材料為對(duì)象，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行表型和分子標(biāo)記鑒定，擬探討以下問(wèn)題：（1）蓖麻根腐病抗性鑒定的有效方法和標(biāo)準(zhǔn)；（2）對(duì)野生材料，尤其是中國(guó)華南野生材料的育種價(jià)值作出科學(xué)評(píng)價(jià)，篩選出一批育種急需的抗病資源；（3）建立可用于輔助選擇的分子標(biāo)記，為蓖麻抗根腐病育種奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 蓖麻材料 供試材料由3部分組成：一是廣東海洋大學(xué)蓖麻課題組提供的66份自交系和雜交種；二是來(lái)自11個(gè)國(guó)家15個(gè)地區(qū)的65份自交系、雜交種和少量野生材料；三是121份中國(guó)華南野生材料。

1.1.2 供試菌株 供試菌株為茄腐鐮孢菌（Fusarium solani），由廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院植物病理研究室分離、保存和提供。

1.2 材料的種植

用2.5%的次氯酸鈉溶液浸泡種子10 min，經(jīng)自來(lái)水清洗后，用50 ℃溫水浸種30 min，洗凈后播種于盛有滅菌營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的育苗盤，每穴播1粒種子。當(dāng)幼苗四葉一心時(shí)，進(jìn)行人工接種。在接種后第4天，選擇規(guī)格一致的幼苗移栽到花盆中，每盆5棵，每個(gè)材料3盆。

1.3 孢子懸浮液的制備及接種方法

將試管保存的茄腐鐮孢菌轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，打取直徑0.5 cm的菌餅，接種到PDA培養(yǎng)基中擴(kuò)繁；7 d后加入無(wú)菌水，刮取表面菌絲，4層紗布過(guò)濾后，用血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下計(jì)算分生孢子的數(shù)量，用無(wú)菌水將孢子濃度調(diào)至1×106個(gè)·mL-1。四葉一心時(shí)，采用灌根法接種，即在每株幼苗根際周圍的基質(zhì)中注射15 mL孢子懸浮液。接種后的材料置于溫室內(nèi)培養(yǎng)，溫度20～28 ℃、相對(duì)濕度70%～80%，自然光照明。

1.4 抗病性鑒定

采用接種后的枯萎天數(shù)和發(fā)病率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，只要有枯萎就算發(fā)病。接種后，每天調(diào)查不同材料的發(fā)病時(shí)間、發(fā)病株數(shù)并計(jì)算發(fā)病率和抗病材料比率，直至無(wú)新的發(fā)病株出現(xiàn)（本試驗(yàn)為60 d），才停止調(diào)查。

抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：1級(jí)（高抗），60 d以上；2級(jí)（中抗），46～60 d；3級(jí)31～45 d；4級(jí)16～30 d；5級(jí)1～15 d。

發(fā)病率（%）＝（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查株數(shù)）×100；

抗病材料比率（%）＝ ［（1級(jí)材料數(shù)＋2級(jí)材料數(shù)）/材料總數(shù) ］ ×100。

1.5 抗病性分子標(biāo)記的建立

1.5.1 基因組DNA的提取與檢測(cè) 采用改良的CTAB法（Cullings， 2010）提取基因組DNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，用NaNoDRop-2000儀器檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，統(tǒng)一稀釋至30 ng·μL-1后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 多態(tài)性引物的篩選 先構(gòu)建極端抗、感材料的DNA混池，用于篩選多態(tài)性引物。再用小群體抗、感個(gè)體驗(yàn)證篩選出的多態(tài)性引物，并對(duì)非多態(tài)性引物進(jìn)行再次篩選，以防多態(tài)性引物的遺漏。

1.5.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定 使用10 μL的反應(yīng)體系，包括模板1 μL（30 ng·μL-1）、引物1 μL（10 μmol·L-1）、2×Taq PCR Master Mix 4 μL（10×Buffer 2 μL、25 mmol·L-1 MgCl2 1.6 μL、5 U·μL-1 Taq DNA聚合酶 0.2 μL、10 mmol·L-1 dNTPs 0.2 μL）、ddH2O 4 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增在Biorad（My Cycler）型PCR儀進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，220 V恒壓電泳分離2.5 h。銀染、水洗、顯影后讀帶。

1.5.4 基因型數(shù)據(jù)的讀取 采用0、1數(shù)據(jù)記錄電泳分離結(jié)果，在相同位置上，有帶記為1，無(wú)帶記為0。

1.5.5 相關(guān)回歸分析 參照單標(biāo)記定位原理（翟虎渠和王健康，2007），對(duì)252份材料作抗性和分子標(biāo)記間的回歸分析，若回歸關(guān)系顯著，則為抗病分子標(biāo)記。用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的培養(yǎng)和孢子懸浮液的制備

培養(yǎng)基上菌株長(zhǎng)勢(shì)良好（圖1：A，B），光學(xué)顯微鏡下分生孢子形態(tài)正常（圖1：C）。經(jīng)鏡檢，孢子濃度為1×106個(gè)·mL-1。

2.2 抗病性鑒定

不同材料的發(fā)病率存在明顯差異（表1）。最低的為0，有105份材料，均為高抗；最高的為100%，有5份材料，發(fā)病最快，均為高感，表明發(fā)病條件充分、抗性鑒定結(jié)果可靠（圖2）。

252份材料中，抗性從1到5級(jí)分別有105份（42%）、25份（10%）、33份（13%）、31份（12%）和58份（23%）（圖3），抗病材料比率為52%?？共〔牧现?，中國(guó)華南野生材料占64%（表1）。野生材料的抗病材料比率（66%）明顯高于栽培材料（35%），其中中國(guó)華南野生材料為69%，非洲野生材料為43%；117份栽培材料中，來(lái)自中國(guó)廣東海洋大學(xué)、中國(guó)云南、以色列、印度和法國(guó)的材料抗病比例分別為36%、47%、44%、38%和0（表1）。

不同來(lái)源的材料中，各抗性級(jí)別的材料比例有較大差異（表1）。中國(guó)廣東海洋大學(xué)材料中，最抗（24%）和最感材料（32%）的比例均較高，可能與所用的親本有關(guān)， 其親本一類是中國(guó)華南野生材料，另外一類是農(nóng)藝性狀較好但抗病性較差的國(guó)內(nèi)栽培材料；中國(guó)云南材料中高抗材料比例（41%）較高，可能是因?yàn)樵颇媳吐橘Y源本身很豐富，另外可能與東南亞熱帶種質(zhì)資源的利用有關(guān)。

發(fā)病率和抗病等級(jí)基本呈一致趨勢(shì)（表2）。105份高抗材料的發(fā)病率均為0；抗性2～5級(jí)的材料，雖然同一等級(jí)下發(fā)病率變化范圍較大，但總的趨勢(shì)是等級(jí)越高，發(fā)病率越高，反之亦然；另外，越是感病材料，發(fā)病率變化范圍也越大，2～5級(jí)的材料發(fā)病率變化范圍分別為20%以內(nèi)、10%～40%、10%～60%、10%～100%。

2.3 抗病分子標(biāo)記的建立

2.3.1 DNA的提取 瓊脂糖凝膠電泳顯示，條帶無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象。OD260/OD280比值在1.8～2.0之間。這說(shuō)明DNA提取質(zhì)量較好，可用于PCR擴(kuò)增。

2.3.2 多態(tài)性引物的篩選 從393對(duì)帶型清晰、多態(tài)性好的引物中篩選出76對(duì)多態(tài)性SSR引物，用于252份材料的基因組掃描（圖4）。

2.3.3 抗病標(biāo)記的確定 76對(duì)多態(tài)性引物共擴(kuò)增出542個(gè)等位變異，每對(duì)引物可檢測(cè)到2～12個(gè)，平均為7.132 個(gè)。4對(duì)SSR引物與抗病性之間的相關(guān)性顯著或極顯著，它們是RCM1634、RCM1639、RCM1435和RCM1368（表3）?？共⌒苑謩e與這4對(duì)引物擴(kuò)增出的8條帶之間回歸關(guān)系顯著或極顯著（表4），是可能的抗病分子標(biāo)記。

按單個(gè)標(biāo)記統(tǒng)計(jì)，攜帶以上8個(gè)標(biāo)記的材料中抗病材料比率分別為65.5%、58.1%、70.8%、58.3%、73.0%、57.7%、69.6%和63.8%，其中1級(jí)材料比率分別為56.4%、46.6%、61.0%、46.6%、68.8%、48.9%、62.0%和55.3%（表5），只攜帶單一標(biāo)記的抗病材料占材料總數(shù)的66.6%（表6），反映了攜帶標(biāo)記材料的整體抗病趨勢(shì)。

不同抗病材料攜帶的標(biāo)記種類和數(shù)目不盡相同 （表6）， 反映了蓖麻根腐病抗性遺傳機(jī)制的復(fù)雜性。不同抗病材料攜帶的抗病標(biāo)記數(shù)為0～6個(gè)，隨著標(biāo)記數(shù)的增加， 抗病材料比率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。大部分抗病材料攜帶3～4個(gè)標(biāo)記。但是，攜帶5～6個(gè)標(biāo)記的材料，其抗病材料比率并非最高，攜帶不同標(biāo)記的材料中都有一些材料表現(xiàn)感?。ū?），甚至不含抗病標(biāo)記的材料也有表現(xiàn)抗病的（表6），這可能是某些抗病基因之間存在負(fù)向互作及標(biāo)記與抗病基因之間交換重組所致，有待進(jìn)一步研究。

3 討論與結(jié)論

目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)蓖麻根腐病統(tǒng)一的鑒定方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。Raoof等（2008）和Shaw等（2016）的研究結(jié)果表明，在蓖麻枯萎病的抗性鑒定中，采用孢子懸浮液灌根接種法更接近于大田發(fā)病條件，其抗性評(píng)價(jià)結(jié)果更為客觀。本研究參考枯萎病鑒定的經(jīng)驗(yàn)，形成了根腐病的鑒定方法，即孢子濃度為1×106個(gè)·mL-1的孢子懸浮液灌根接種，以接種后的枯萎天數(shù)劃分抗性等級(jí)。此法創(chuàng)造了充分的發(fā)病條件，對(duì)材料抗性作出了客觀評(píng)價(jià)，這一結(jié)果與Shaw等（2018， 2022）的研究結(jié)果相似。本研究還證明了枯萎天數(shù)與發(fā)病率的一致性，因此，建議后續(xù)在對(duì)大批量材料進(jìn)行鑒定時(shí)，可以把枯萎天數(shù)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，在對(duì)重點(diǎn)材料進(jìn)行深入鑒定時(shí)，除枯萎天數(shù)外，還可將發(fā)病率作為參考標(biāo)準(zhǔn)。

目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)蓖麻根腐病抗性種質(zhì)篩選的報(bào)道。因此，本研究篩選出的130份抗病材料（包含105份高抗），為抗根腐病育種提供了一批急需的基因資源，這將扭轉(zhuǎn)抗源缺乏的被動(dòng)局面，為抗病育種邁出了堅(jiān)實(shí)的一步。野生材料的抗病材料比率（66%）遠(yuǎn)高于栽培材料（35%），這可能是因?yàn)橐吧牧媳Ａ袅烁叩倪z傳多樣性，蘊(yùn)含著更多的抗性基因（畢川等，2010；Xu et al.， 2019， 2021; 范偉等，2020； 陸建軍等，2021）。中國(guó)華南野生材料的抗病材料比率（69%）高于整個(gè)野生材料群體，這與它們具有更高的遺傳多樣性密切相關(guān)（汪亞菲等，2019；Agyenim-Boateng et al.， 2019; 楊婷等，2020）。而且，根腐病作為華南地區(qū)的主要病害，與該地區(qū)特有的自然氣候土壤條件密不可分，由于長(zhǎng)期的自然選擇使中國(guó)華南野生材料進(jìn)化出了相應(yīng)的防御機(jī)制，因此表現(xiàn)出較高的抗性?；谝吧牧暇哂休^高的遺傳多樣性和抗根腐病比率，可能在枯萎病和灰霉病等其他主要病害中，也表現(xiàn)出較高的抗性。因此，野生材料不失為一個(gè)研究切入點(diǎn)，建議在今后的抗病育種中，可以加強(qiáng)野生材料，尤其是中國(guó)華南野生材料的研究和利用。

本研究采用的引物篩選方法， 既避免了多態(tài)性引物的遺漏，又大大減輕了工作量，在后續(xù)研究中， 可以采用此法對(duì)自然群體進(jìn)行引物篩選。雖然限于單標(biāo)記定位法本身的局限性以及多態(tài)性引物數(shù)量、標(biāo)記與基因間的遺傳距離等原因，建立的這8個(gè)抗病標(biāo)記仍有待進(jìn)一步研究，但這些標(biāo)記可以用于大批量材料根腐病抗性的輔助選擇。建議后續(xù)可以把這些標(biāo)記作為候選的抗病基因進(jìn)行深入研究，為基因挖掘和分子育種奠定重要基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究為蓖麻根腐病抗性鑒定提供了有效的方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；為育種提供了一批急需的抗病基因資源；提出野生材料尤其是中國(guó)華南野生材料的研究利用是今后抗病育種的重要方向；初步建立了抗根腐病SSR分子標(biāo)記，為蓖麻抗根腐病的基因挖掘和分子育種奠定了重要基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 鄧斯麗 王登惠）