野生越南槐組織特異性內(nèi)生真菌組及體外抗病原菌功能

姚裕群 蘭可 黃榮韶 吳炫柯

摘 要：? 有益微生物組能幫助宿主植物防御病害。越南槐的根、莖和種子在野外環(huán)境下健康發(fā)芽生長，而栽培越南槐各組織極易感病。為了探明利用野生越南槐有益內(nèi)生真菌組防治宿主病害的可能，該文在分離健康野生越南槐根、莖和種子內(nèi)生真菌的基礎(chǔ)上，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和ITS序列特征鑒定內(nèi)生真菌，通過系統(tǒng)發(fā)育樹、α-多樣性指數(shù)和β-多樣性指數(shù)分別分析各內(nèi)生真菌組的系統(tǒng)進(jìn)化、多樣性和相似性，通過瓊脂塊法和平板對峙法測試內(nèi)生真菌組的體外抗病原菌功能。結(jié)果表明：（1）從越南槐根、莖和種子內(nèi)生真菌組分別分離鑒定131株23個分類單元、108株23個分類單元、64株11個分類單元；（2）特有屬多且所有種均為特有種顯示根、莖和種子內(nèi)生真菌組在屬種進(jìn)化上具有組織特異性；（3）根-莖/根-種子/莖-種子間極低的β-多樣性顯示根、莖和種子各內(nèi)生真菌組間的物種相似性極低；（4）高的α-多樣性顯示越南槐根、莖和種子均有豐富多樣的內(nèi)生真菌組；（5）各內(nèi)生真菌組三分之一以上的分類單元在體外均能拮抗供試病原菌，根莖內(nèi)生真菌組顯示了強(qiáng)廣譜的體外抗病原細(xì)/真菌功能，種子內(nèi)生真菌組顯示了強(qiáng)廣譜的體外抗病原真菌功能。該研究結(jié)果表明健康野生越南槐根、莖和種子內(nèi)部均存在有益內(nèi)生真菌組，其具有生物多樣性、組織特異性以及強(qiáng)廣譜的體外抗病原菌功能，在宿主各組織的抗病性方面可能發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果將為進(jìn)一步利用有益真菌組防治栽培越南槐各組織病害提供了材料和實驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 野生越南槐， 有益內(nèi)生真菌組， 生物多樣性， 組織特異性， 抗病功能

中圖分類號：? Q939

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2023）07-1182-11

收稿日期：? 2022-06-16

基金項目：? 國家自然科學(xué)基金（81860671）； 廣西自然科學(xué)基金（2018GXNSFAA281120）； 2020年廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項目（2020KY08012）； 廣西科技大學(xué)博士基金（18Z16）。

第一作者： 姚裕群（1979-），博士，副研究員，主要研究藥用植物內(nèi)生真菌-宿主互作機(jī)制，（E-mail）yaoyuqun2005@126.com。

通信作者：? 吳炫柯，碩士，高級工程師，研究方向為應(yīng)用氣象，（E-mail）wuxuanke@163.com。

Tissue-specificity and pathogen-resistant function

in vitro of endophytic fungal microbiome harbored

in Sophora tonkinensis from wild type

YAO Yuqun1， LAN Ke1， HUANG Rongshao3， WU Xuanke2*

（ 1. College of Medicine， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， Guangxi， China; 2. Liuzhou Agricultural Meteorological

Experimental Station， Liuzhou 545003， Guangxi， China; 3. Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530200， China ）

Abstract：? The beneficial microbiome assist the plant in disease defense. The root， stem and seed of Sophora tonkinensis from wild type were germinated and grew healthily， but they in cultivated type were susceptible to insect and pathogen attack. In order to explore the possibility of disease control using beneficial endophytic fungal microbiome harbored in S. tonkinensis from healthy wild type， endophytic fungi were isolated from the root， stem and seed of S. tonkinensis from healthy wild type， and then were further identified based on morphological characters and ITS sequence characters. Phylogenetic tree， α-diversity index and β-diversity index were used to analyze the phylogenetic evolution， diversity and similarity among different endophytic fungal microbiomes. The pathogen-resistant function in vitro of endophytic fungal microbiome was determined by the agar plug method and flat-stand method. The results were as follows： （1） A total of 131 strains with 23 taxa， 108 strains with 23 taxa， and 64 strains with 11 taxa， were respectively isolated and identified from the root， stem and seed of S. tonkinensis; （2） More endemic genera and all endemic species， indicated that endophytic fungal microbiomes harbored in the root， stem and seed had tissue specificity in genus and species evolutionary tree; （3） The extremely low β-diversity between root-stem， root-seed， and stem-seed indicated that species similarity was very low among different endophytic fungal microbiomes; （4） The high α-diversity showed that endophytic fungal microbiomes harbored in the root， stem and seed were abundant biodiversity; （5） More than one third of the taxa antagonized pathogens in vitro. Endophytic fungal microbiome harbored in the root/stem showed strong broad-spectrum pathogenic bacteria/fungi-resistant function in vitro， and endophytic fungal microbiome harbored in the seed showed strong broad-spectrum pathogenic fungi-resistant function in vitro. These results indicated beneficial endophytic fungal microbiome with tissue-specificity， biodiversity structure， and strong broad-spectrum pathogen-resistant function in vitro， harbored in healthy root， stem and seed of S. tonkinensis from wild type， and might play an important role in pathogen resistance in host tissues. Such results will provide material and experimental basis for disease control in different tissues of S. tonkinensis using beneficial endophytic fungal microbiome.

Key words： Sophora tonkinensis from wild type， beneficial endophytic fungal microbiome， biodiversity， tissue specificity， pathogen-resistant function

越南槐（Sophora tonkinensis）是廣西著名道地藥材山豆根的基源植物。山豆根藥材清熱解毒、消腫利咽，常用于治療濕熱黃疸、心率失常、膀胱癌等癥（國家藥典委員會，2020）；含有生物堿、黃酮、皂苷等多種化學(xué)成分，其中苦參堿和氧化苦參堿為其主要活性成分（Zhang et al.， 2020）；具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、抑菌、保肝、調(diào)節(jié)免疫、降血壓等藥理學(xué)作用（彭成， 2011）。隨著健康大產(chǎn)業(yè)及鄉(xiāng)村振興的深入發(fā)展，越南槐在廣西百色、靖西、河池等地區(qū)推廣種植。課題組在越南槐的野生馴化及其推廣栽培中發(fā)現(xiàn)，栽培越南槐容易感染各種病害，其種子容易霉變影響發(fā)芽，根莖時常腐爛，發(fā)生炭疽潰瘍，引起條斑黑斑，從而影響藥材生長。而大量化學(xué)農(nóng)藥的使用，容易導(dǎo)致藥材農(nóng)藥、重金屬等超標(biāo)，嚴(yán)重影響藥材安全（Gu et al.， 2013）。因此，發(fā)展綠色環(huán)保的越南槐病害防治策略對山豆根藥材的可持續(xù)利用和發(fā)展極其重要。植物有先天的免疫系統(tǒng)以響應(yīng)病原微生物的分子機(jī)制及效應(yīng)物（Jones & Dangl， 2006; Dangl et al.， 2013）。植物有益微生物組通過與植物先天免疫系統(tǒng)的互作（Hacquard et al.， 2017），使植物系統(tǒng)獲得相關(guān)抗病性（Pieterse et al.， 2014），對植物的健康有重要的作用（Berg et al.， 2016）。番茄根系微生物組研究發(fā)現(xiàn)，抗病與感病植株根系微生物組的結(jié)構(gòu)、抗菌性功能有很大差異，抗病植株根系微生物組作為有益微生物組轉(zhuǎn)接到感病植株，能激活感病株的抗病性 （Kwak et al.， 2018）。植物微生物組包括真菌組和細(xì)菌組，根系微生物組主要來源于高度多樣性的土壤生物，受土壤類型、植物基因型、植物年齡等影響，莖和種子微生物主要來源于氣溶膠、昆蟲及根系的遷移（Hacquard et al.， 2017）。在植物-有益內(nèi)生真菌組中，各內(nèi)生真菌通過與宿主進(jìn)行復(fù)雜而精細(xì)的互作以激活植物先天免疫系統(tǒng)使宿主獲得抗病性以拮抗病原和害蟲的入侵，甚至部分內(nèi)生真菌自身就可以分泌毒性代謝物以拮抗病原菌的入侵（Kusari et al.， 2012; Compant et al.， 2019），因此有益內(nèi)生真菌組有利于宿主防御病害。野生越南槐生長于海拔500～800 m石灰?guī)r山區(qū)的石頭縫里，周圍植被類型多樣，局部小氣候復(fù)雜多變，在這樣的生境下，野生越南槐依然能健康發(fā)芽生長并形成獨特的藥性，此外，項目組前期研究工作發(fā)現(xiàn)越南槐各組織內(nèi)有內(nèi)生真菌（姚裕群，2017）。因此，我們推測獨特復(fù)雜的野外生境容易使越南槐根、莖和種子形成獨特而多樣性的有益內(nèi)生真菌組，這些內(nèi)生真菌組在拮抗病蟲害方面可能發(fā)揮重要作用。本研究以相同生長年限不同時期采集的野生越南槐根、莖和種子為研究對象，依托廣西科技大學(xué)重點實驗室、柳州市農(nóng)業(yè)氣象試驗站，采用組織塊法分離內(nèi)生真菌， 結(jié)合形態(tài)和ITS序列測序比對鑒定真菌，最大似然法構(gòu)建內(nèi)生真菌組系統(tǒng)發(fā)育樹，R軟件計算內(nèi)生真菌組的α-多樣性指數(shù)、β-多樣性指數(shù)，分別采用瓊脂塊法和平板對峙法體外測定內(nèi)生真菌組各分類單元對病原細(xì)菌、真菌的拮抗活性。通過分析野生越南槐根、莖和種子內(nèi)生真菌組的屬種系統(tǒng)發(fā)育、α-多樣性、β-多樣性及體外抗病原菌功能，擬探討以下問題：（1）野生越南槐根、莖和種子各有益內(nèi)生真菌組在屬種系統(tǒng)發(fā)育上是否有差異；（2）野生越南槐根、莖和種子各有益內(nèi)生真菌組的多樣性和相似性如何；（3）野生越南槐根、莖和種子各有益內(nèi)生真菌組體外是否具有抗病功能。本研究結(jié)果擬為探索利用野生越南槐各有益真菌組防治栽培越南槐各組織病害提供材料及實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥用植物 供試8株野生越南槐（Sophora tonkinensis），4年生，株高約2 m，根直徑約1 cm， 莖直徑約1.5 cm，種子大小均勻飽滿約（0.5 cm × 0.3 cm～1 cm × 0.8 cm，根莖采集期分別為2020年3月、8月、11月，不同成熟度種子采集期分別為2020年7月、8月、9月，均采自靖西市誠良村山上（106°25′26″ E、23°08′49″ N）。采集的越南槐根、莖和種子，分別裝袋、貼上標(biāo)簽并立即運(yùn)往廣西科技大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室，并在24 h內(nèi)處理樣品。

1.1.2 供試病原菌 供試病原細(xì)菌為細(xì)菌性軟腐病菌（Pectobacterium carotovorum）、細(xì)菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）、細(xì)菌性潰瘍病菌（X. campestris pv. citri）；供試病原真菌為根腐病菌（Fusarium solani）、炭疽病菌（Colletotriehum gloeosporioides）、黑斑病菌（Alternaria panax）。以上菌株均保藏在廣西科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部。

1.1.3 培養(yǎng)基、試劑與測序 馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基、LA培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，所有培養(yǎng)基在121 ℃，1 × 105 Pa 下濕熱滅菌20 min 備用；次氯酸鈉、甘油、酒精，均購自成都金山化學(xué)試劑有限公司；2xTagMasterMix，購自天根生化科技有限公司；引物ITS1/ITS4合成及PCR產(chǎn)物測序均由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.4 儀器與設(shè)備 生物安全柜（Thermo1376）、PCR擴(kuò)增儀（BIO-RAD C1000）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Best 200E）、生化培養(yǎng)箱（SPX-250）、超低溫冰箱（Thermo 902）、離心機(jī)（Sigma 3K15）、顯微鏡（Olympus IX83）、鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9030）、全自動高壓滅菌鍋（Tomy XS500）。

1.2 方法

1.2.1 根、莖和種子內(nèi)生真菌的分離純化 將越南槐的新鮮健康根段、莖段和種子用流水徹底沖洗表面，晾干后移到超凈工作臺分別進(jìn)行表面消毒，即75%酒精1 min，無菌水漂洗3次，5%次氯酸鈉1～6 min（根段/莖段，1～2 min; 種子，5～6 min）后，無菌水漂洗3次，無菌吸水紙吸干表面，根段/莖段分別去除兩端和表皮后切成1 cm × 0.5 cm大小的組織塊，種子分為種皮和胚，均轉(zhuǎn)接至1/2玉米粉培養(yǎng)基（含氯霉素和氨芐青霉素），并于25 ℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)。待各組織邊緣長出菌絲后及時挑取單一菌絲至PDA培養(yǎng)基上，長出的菌落，如果外部形態(tài)不一致，繼續(xù)挑取單一菌絲直至長出外部形態(tài)一致的菌落。

1.2.2 根、莖和種子內(nèi)生真菌的分類鑒定 根據(jù)菌落的組織來源、培養(yǎng)時間及外部形態(tài)，分別將根段、莖段和種子分離到的菌株劃分為不同的形態(tài)型，采用DNA分子標(biāo)記鑒定每個形態(tài)型的代表菌株。采用通用引物對ITS1/ITS4，從代表菌株基因組DNA擴(kuò)增ITS序列并測序（ITS1-5.8S rDNA-ITS2）。分別使用軟件 ClustalX 1.81 和 BioEdit v7.0分析測序序列，登錄GenBank數(shù)據(jù)庫比對，下載最相似（盡量選擇正式發(fā)表）序列，使用MEGA 6.0軟件的鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)Bootstrap 1 000 次循環(huán)檢驗系統(tǒng)樹的可靠性。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，比對測序序列與參考序列之間的相似性，依據(jù)真菌鑒定的常用相關(guān)閾值鑒定真菌（O′Brien et al.， 2005；González & Tello， 2011），即相似性<95%為未鑒定，95%≤相似性<97%為鑒定到屬水平，相似性≥97%為鑒定到種水平，在屬內(nèi)比較中，明顯高于其他種時則被鑒定為同種。

1.2.3 根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的系統(tǒng)進(jìn)化 基于真菌分類單元的ITS序列，通過MEGA 6.0軟件，采用最大似然法（maximun likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹來分析野生越南槐根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的屬種系統(tǒng)進(jìn)化（González & Tello， 2011）。

1.2.4 根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的多樣性和相似性 基于野生越南槐根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的分類單元及其分離株系分別計算各真菌組的α-多樣性指數(shù)［香農(nóng)-維納指數(shù)（Shannon-Wiener index）和辛普森多樣性指數(shù)（Simpsons diversity index）］及β-多樣性指數(shù)［索倫森指數(shù)（Sorensens index）和雅卡爾指數(shù)（Jaccards index）］。通過α-多樣性指數(shù)來分析野生越南槐根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的多樣性，通過β-多樣性指數(shù)來分析野生越南槐根、莖和種子各內(nèi)生真菌組間的物種相似性（Yao et al.， 2017）。使用生物統(tǒng)計軟件SPSS 28.0，以及運(yùn)用方差和多重比較以分析野生越南槐根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的多樣性差異。

1.2.5 根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的體外抗病原菌功能 挑選內(nèi)生真菌組各分類單元的代表菌株用于體外抗病原菌功能篩選。采用瓊脂塊法（姚裕群等，2017）篩選供試內(nèi)生真菌對病原細(xì)菌的拮抗活性，即將新鮮病原細(xì)菌調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙翰⑵湓?5 min內(nèi)用無菌棉簽均勻涂布于 LA培養(yǎng)基平板上，將6 mm直徑的內(nèi)生真菌菌塊接入風(fēng)干后的LA培養(yǎng)基篩選平板，每皿接5個菌塊， （35±2） ℃培養(yǎng)16～18 h后觀察并測量抑菌圈直徑；采用平板對峙法篩選（Yao et al.， 2017）供試內(nèi)生真菌對病原真菌的拮抗活性，即將內(nèi)生真菌和病原真菌均制成6 mm直徑菌塊，1塊內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)基中央且周圍等距接種3塊病原真菌為處理，以不接種內(nèi)生真菌為對照，28 ℃下培養(yǎng)，待對照長至平板中央測量各病原菌塊中心至平板中央之間病原菌的生長量，并計算抑菌率。

抑菌率（%）=對照生長量－處理生長量對照生長量×100。

1.3 統(tǒng)計分析

基于野生越南槐根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的分類單元及其分離株系計算相對頻率（relative frequency，RF），α-多樣性指數(shù)（香農(nóng)-維納指數(shù)和辛普森多樣性指數(shù)）及β-多樣性指數(shù)（索倫森指數(shù)和雅卡爾指數(shù)）（Yao et al.， 2017）。使用生物統(tǒng)計軟件SPSS 28.0，以及運(yùn)用方差和多重比較以分析野生與培越南槐內(nèi)生真菌組多樣性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 根、莖和種子內(nèi)生真菌的分離和鑒定

從野生越南槐根段共計60個組織塊中分離獲得131株內(nèi)生真菌（圖1）；從莖段60個組織塊共分離獲得108株內(nèi)生真菌（圖2）；從40粒種子共分離獲得64株內(nèi)生真菌（圖3）。首先將分離自根、莖和種子的菌株分開，然后將相同組織來源的菌株分別培養(yǎng)，將相同培養(yǎng)時間內(nèi)菌落孢子形態(tài)一致的菌株劃分為同一形態(tài)型，最后采用ITS序列分析鑒定每個形態(tài)型的代表菌株。結(jié)合形態(tài)學(xué)和ITS序列分析，從根內(nèi)生真菌組的42個形態(tài)型代表菌株中共鑒定23個分類單元，從莖內(nèi)生真菌組的38個形態(tài)型代表菌株中共鑒定23個分類單元，從種子內(nèi)生真菌組的20個形態(tài)型代表菌株中共鑒定11個分類單元且均來自于種皮。每個分類單元為一個特定的真菌物種，依據(jù)真菌物種鑒定的常用相關(guān)閾值（見方法部分）。根內(nèi)生真菌組的23個分類單元（物種）中，11個分類單元鑒定到屬水平，10個分類單元鑒定到種水平，2個分類單元未鑒定；莖內(nèi)生真菌組的23個分類單元（物種）中，9個分類單元鑒定到屬水平，11個分類單元鑒定到種水平， 3個分類單元未鑒定；種子內(nèi)生真菌組的11個分類單元（物種）中，1個分類單元鑒定到屬水平，9個分類單元鑒定到種水平，1個分類單元未鑒定。相關(guān)數(shù)據(jù)已上傳GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KP204264-KP204442、KT935174及KR611926。

2.2 根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的系統(tǒng)進(jìn)化

基于野生越南槐根內(nèi)生真菌組23個分類單元，莖內(nèi)生真菌組23個分類單元以及種子內(nèi)生真菌組11個分類單元的ITS序列，采用最大似然法分別構(gòu)建了野生越南槐根、莖、種子內(nèi)生真菌組的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1，圖2，圖3）。在根內(nèi)生真菌組的已鑒定分類單元中， 有12個屬10個種，其中有4個優(yōu)勢屬，鐮刀菌屬（Fusarium）為最優(yōu)勢屬，其次為莖點霉屬（Phoma）、 青霉屬（Penicillium）、Rhexocercosporidium；在莖內(nèi)生真菌組的已鑒定分類單元中，有15個屬11個種，其中有4個優(yōu)勢屬，分別為節(jié)孢霉屬（Arthrinium）、青霉屬、鐮刀菌屬、枝孢菌屬（Cladosporium），其中節(jié)孢霉屬為最優(yōu)勢屬；在種子內(nèi)生真菌組的已鑒定分類單元中，有6個屬9個種，其中有3個優(yōu)勢屬，分別為炭疽菌屬（Colletotrichum）、枝孢菌屬和假尾孢菌屬（Pseudocercospora），其中炭疽菌屬為最優(yōu)勢屬。根、莖和種子3個內(nèi)生真菌組共有屬為2個，即青霉屬和枝孢菌屬，特有屬分別為10個、13個、4個，特有屬分別約為共有屬的5倍、7倍、2倍；根、莖和種子3個內(nèi)生真菌組間共有種為0個，所有種均為特有種，特有種分別為10個、11個、9個。研究結(jié)果表明，在野生越南槐根、莖和種子內(nèi)生真菌組中，共有屬少而特有屬多，且所有種均為特有種，各組織內(nèi)生真菌組在屬種進(jìn)化上具有組織特性。

2.3 根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的多樣性和相似性

基于越南槐根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的分類單元（物種）、分離株系及其共有分類單元（物種）（圖1，圖2，圖3）計算α-多樣性指數(shù)（香農(nóng)-維納指數(shù)和辛普森多樣性指數(shù)）（表1）及β-多樣性指數(shù)（索倫森指數(shù)和雅卡爾指數(shù)）（表2），進(jìn)一步比較野生越南槐根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的α-多樣性指數(shù)及β-多樣性指數(shù)。越南槐根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的α-多樣性指數(shù)結(jié)果如表1所示，比較其他藥用植物組織內(nèi)生真菌組（González & Tello， 2011; 李玲玲，2021），野生越南槐根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的物種多樣性指數(shù)均較大，表明野生越南槐根、莖和種子內(nèi)均有較豐富多樣的內(nèi)生真菌組，而根莖內(nèi)生真菌組的α-多樣性指數(shù)顯著高于種子內(nèi)生真菌組，表明越南槐根莖內(nèi)生真菌組的物種多樣性顯著高于種子內(nèi)生真菌組；越南槐根、莖和種子各內(nèi)生真菌組間的β-多樣性指數(shù)如表2所示，即索倫森指數(shù)和雅卡爾指數(shù)在0～0.148之間，基于相似性系數(shù)原理，當(dāng)β-多樣性指數(shù)介于0～0.25時為極不相似，0.25～0.50為中等不相似，0.50～0.75為中等相似，0.75～1.00為極為相似，研究結(jié)果表明野生越南槐根、莖和種子各內(nèi)生真菌組間的物種相似性極低。

2.4 根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的體外抗病原菌功能

3種病原細(xì)菌（細(xì)菌性軟腐病菌、細(xì)菌性條斑病菌、細(xì)菌性潰瘍病菌）和3種病原真菌（根腐病菌、炭疽病菌、黑斑病菌）能廣泛引起植物根、莖和種子的相應(yīng)病害，因此以這6種病原菌為靶標(biāo)菌測試越南槐根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的體外抗病原菌功能。

以上述3種病原細(xì)菌為靶標(biāo)菌，對越南槐根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的分類單元（分別為23個、23個、11個）進(jìn)行體外抗病原細(xì)菌活性測定。由表3可知， 在野生越南槐根內(nèi)生真菌組中，有3個分類單元 （13%）對靶標(biāo)菌有不同程度的抑制作用，其中2個分類單元對細(xì)菌性軟腐病菌有抑菌圈且抑菌圈直徑均等于陽性對照，3個分類單元對細(xì)菌性條斑病菌有抑菌圈且抑菌圈直徑均大于或等于陽性對照，3個分類單元對細(xì)菌性潰瘍病菌有抑菌圈，1個分類單元的抑菌圈直徑等于陽性對照，2個分類單元對3種靶標(biāo)菌均有抑菌圈，尤其是分類單元黑僵菌（Metarhizium anisopliae）對3種靶標(biāo)菌的抑菌圈直徑均等于陽性對照； 在野生越南槐莖內(nèi)生真菌組中， 有2個分類單元（9%）對靶標(biāo)菌有不同程度的抑制作用，其中分類單元Bionectria sp.對3種靶標(biāo)菌的抑菌圈直徑均大于或等于陽性對照；在野生越南槐種子內(nèi)生真菌組中，沒有發(fā)現(xiàn)抑制靶標(biāo)病原細(xì)菌的分類單元。

以上述3種病原真菌為靶標(biāo)菌，對越南槐根、莖和種子各內(nèi)生真菌組的分類單元（分別為23個、23個、11個）進(jìn)行體外抗病原真菌活性測定。由表4可知，在野生越南槐根內(nèi)生真菌組中，有9個分類單元（39%）對靶標(biāo)菌均有不同程度的抑制作用， 其中8個分類單元對根腐病菌的抑制率超過50%， 9個分類單元對炭疽病菌的抑制率超過50%，5個分類單元對黑斑病菌的抑制率超過50%，茄鐮孢菌（Fusarium solani）、可可球二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）、Rhexocercosporidium sp.、Phoma sp.、草莖點霉（P. herbarum）5個分類單元對3種病原真菌的抑制率均超過50%，顯示了強(qiáng)的拮抗活性；在野生越南槐莖內(nèi)生真菌組中，有9個分類單元（39%）對靶標(biāo)菌均有不同程度的抑制作用，其中4個分類單元對根腐病菌的抑制率超過50%，7個分類單元對炭疽病菌的抑制率超過50%，1個分類單元對黑斑病菌的抑制率超過50%，分類單元尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）對3種病原真菌的抑制率均超過50%，顯示了強(qiáng)的拮抗活性；在野生越南槐種子內(nèi)生真菌組中，有4個分類單元（36%）對靶標(biāo)菌均有不同程度的抑制作用，其中2個分類單元對根腐病菌的抑制率超過50%，3個分類單元對炭疽病菌的抑制率超過50%，1個分類單元對黑斑病菌的抑制率超過50%，分類單元海水仙炭疽菌（Colletotrichum hymenocallidis）對3種病原真菌的抑制率均超過50%，顯示了強(qiáng)的拮抗活性。

體外抗病原菌功能測定結(jié)果（表3，表4）顯示，野生越南槐根內(nèi)生真菌組具有豐富的抗病原菌分類單元（10個，43%），體外對6種病原細(xì)/真菌均顯示了強(qiáng)廣譜的拮抗活性，尤其是黑僵菌、茄鐮孢菌、可可球二孢菌、Rhexocercosporidium sp.、Phoma sp.、草莖點霉6個分類單元對3種以上病原細(xì)/真菌均具強(qiáng)廣譜的拮抗活性；野生越南槐莖內(nèi)生真菌組也具有豐富的抗病原菌分類單元（10個，43%），體外對6種病原細(xì)/真菌也均顯示了強(qiáng)廣譜的拮抗活性，尤其是Bionectria sp.、尖孢鐮刀菌2個分類單元對3種以上病原細(xì)/真菌均具強(qiáng)廣譜的拮抗活性；野生越南槐種子內(nèi)生真菌組同樣具有豐富的抗病原菌分類單元（4個，36%），體外對靶標(biāo)病原細(xì)菌沒有拮抗活性，但對3種病原真菌均顯示了強(qiáng)廣譜的拮抗活性，尤其是分類單元海水仙炭疽菌對3種病原真菌均具強(qiáng)廣譜的拮抗活性。研究結(jié)果表明，野生越南槐根莖內(nèi)生真菌組體外均能有效拮抗病原細(xì)/真菌，具強(qiáng)廣譜的體外抗病原細(xì)/真菌功能，而野生越南槐種子內(nèi)生真菌組體外均能有效拮抗病原真菌，具強(qiáng)廣譜的體外抗病原真菌功能。

3 討論與結(jié)論

植物的每個組織都定殖有不同而多樣的內(nèi)生真菌組，內(nèi)生真菌組與宿主植物協(xié)同進(jìn)化、互惠共生 （Gogarten & Townsend， 2005）。在內(nèi)生真菌組與宿主植物的互作過程中，基于“獲得性免疫”理論，部分內(nèi)生真菌能激活植物的天然免疫系統(tǒng)使宿主植物獲得免疫活性以拮抗害蟲和抗病微生物（Arnold et al.， 2003）；基于“馬賽效應(yīng)”，部分內(nèi)生真菌通過內(nèi)生真菌-宿主/內(nèi)生真菌-內(nèi)生真菌間的互作在宿主植物組織里合成多樣性的化學(xué)成分以保護(hù)宿主（Carroll， 1991）；基于“平衡協(xié)作”學(xué)說，部分內(nèi)生真菌能幫助宿主直接拮抗病原菌（Kusari et al.， 2012; 李玲玲， 2021）。已有研究結(jié)果表明，內(nèi)生真菌組在植物宿主的抗病中發(fā)揮著重要的作用。課題組在越南槐的栽培推廣中發(fā)現(xiàn)，栽培越南槐的根、莖和種子非常容易發(fā)病，而野生越南槐各組織則極少發(fā)病，且越南槐各組織內(nèi)有內(nèi)生真菌（姚裕群， 2017; Yao et al.， 2017）?；趦?nèi)生真菌組及越南槐的前期研究工作，推測生長于廣西石灰?guī)r山區(qū)獨特生境的越南槐根、莖和種子內(nèi)部可能存在獨特的有益內(nèi)生真菌組，這些獨特內(nèi)生真菌組在野生藥材抗病性方面可能發(fā)揮著重要的作用。宿主生長年限、生長季節(jié)、生長環(huán)境及組織類型也顯著影響內(nèi)生真菌組的系統(tǒng)進(jìn)化、多樣性及功能（Mishra et al.， 2012; Nascimento et al.， 2015）。為了避免生長年限和生長季節(jié)對內(nèi)生真菌組的影響，研究獨特生境下越南槐根、莖和種子內(nèi)生真菌組的系統(tǒng)發(fā)育、多樣性及抗病潛力，進(jìn)而有效利用獨特生境野生越南槐各組織有益內(nèi)生真菌組防治其宿主栽培越南槐病害，本研究分三個時期分別從相同生長年限/相同發(fā)育期的野生越南槐根莖/種子分離鑒定內(nèi)生真菌，分析各組織內(nèi)生真菌組的系統(tǒng)發(fā)育、多樣性、相似性和體外抗病原菌功能，探明野生越南槐各組織內(nèi)生真菌組作為有益微生物組防治栽培宿主病害的潛力。

α-多樣性表明野生越南槐根、莖和種子內(nèi)均存在分類單元較豐富多樣的內(nèi)生真菌組。根莖內(nèi)生真菌組的α-多樣性顯著高于種子可能由于根莖的生長時期遠(yuǎn)大于種子，研究結(jié)果與前人研究基本一致（González & Tello， 2011；Nascimento et al.， 2015; 李玲玲， 2021）。基于“獲得性免疫”理論，越南槐根、莖和種子內(nèi)生真菌組的分類單元越豐富越有助于激活宿主各組織的天然免疫系統(tǒng)，使宿主各組織獲得拮抗多種病原的免疫活性；基于“馬賽效應(yīng)”，分類單元多樣的越南槐根、莖和種子內(nèi)生真菌組通過多樣的分類單元-宿主/分類單元-分類單元互作而有益于在宿主各組織內(nèi)合成多樣性的化學(xué)成分以保護(hù)宿主各組織免受多種病原侵害。因此，基于“獲得性免疫”理論和“馬賽效應(yīng)”，豐富多樣的野生越南槐根、莖和種子內(nèi)生真菌組有益于幫助宿主各組織防御病害。聚類分析和低的β-多樣性進(jìn)一步表明，越南槐根、莖和種子內(nèi)生真菌組在屬種的發(fā)育上差異大，表明越南槐各組織內(nèi)存在不同的內(nèi)生真菌組，內(nèi)生真菌組具有組織特異性，組織特異性的內(nèi)生真菌組在與特異組織的互作中，可能幫助宿主組織拮抗特異的病原。內(nèi)生真菌組的體外抗病功能分析發(fā)現(xiàn)，在越南槐根、莖和種子的內(nèi)生真菌組中均有三分之一以上的分類單元具有體外抗病原菌活性，這些抗病原菌活性分類單元，尤其是強(qiáng)廣譜抗病原菌活性分類單元，如根內(nèi)生真菌組分類單元黑僵菌、茄鐮孢菌、可可球二孢菌、Rhexocercosporidium sp.、Phoma sp.、草莖點霉，莖內(nèi)生真菌組分類單元Bionectria sp.、尖孢鐮刀菌，種子內(nèi)生真菌組分類單元海水仙炭疽菌，可能直接參與拮抗宿主各組織病原菌的入侵。根、莖和種子3個內(nèi)生真菌組共有青霉屬、枝孢菌屬這2個屬，共有屬可能在幫助宿主越南槐根、莖和種子拮抗共同病害方面發(fā)揮作用。根-莖/莖-種子間均有共同的分類單元，推測各組織內(nèi)生真菌組間可能存在菌株交流。

番茄抗病植株根系微生物組中的優(yōu)勢屬，雖然在體外不能抑制病原菌，但是接種番茄后能激活宿主的天然免疫系統(tǒng)而強(qiáng)烈抑制病原菌引起的番茄枯萎?。↘wak et al.， 2018）。可見微生物組中的優(yōu)勢屬在幫助宿主獲得抗病活性方面發(fā)揮著重要作用。本研究中，野生越南槐各組織的內(nèi)生真菌組均存在特定的優(yōu)勢屬，如根內(nèi)生真菌組中的優(yōu)勢屬鐮刀菌屬、莖點霉屬、青霉屬、Rhexocercosporidium，莖內(nèi)生真菌組中的優(yōu)勢屬節(jié)孢霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬、枝孢菌屬，種子內(nèi)生真菌組中的優(yōu)勢屬炭疽菌屬、枝孢菌屬、假尾孢菌屬，特別是這些優(yōu)勢屬的部分分類單元還具有病原菌拮抗活性，這些優(yōu)勢屬定殖根、莖和種子后可能激活其天然免疫系統(tǒng)，使宿主組織能拮抗各病原菌引起的相關(guān)病害，由此推測越南槐根、莖和種子內(nèi)生真菌組內(nèi)的這些優(yōu)勢屬在保護(hù)宿主各組織拮抗病害方面可能發(fā)揮著重要作用。此外，雖然野生越南槐種子內(nèi)生真菌組檢測不到病原細(xì)菌的體外拮抗活性，但其優(yōu)勢屬定殖種子后仍可能激活宿主使其獲得拮抗病原細(xì)菌的免疫活性。

野生越南槐根、莖和種子內(nèi)均有較豐富的內(nèi)生真菌組，這些內(nèi)生真菌組具有生物多樣性、組織特異性以及強(qiáng)廣譜的體外抗病原菌功能，作為有益微生物組在宿主各組織的抗病性方面可能發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn)：

ARNOLD AE， MEJA LC， KYLLO D， et al.， 2003. Fungal endophytes limit pathogen damage in a tropical tree ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 100（26）： 15649-15654.

BERG G， RYBAKOVA D， GRUBE M， et al.， 2016. The plant microbiome explored： implications for experimental botany ［J］. J Exp Bot， 67（4）： 995-1002.

CARROLL GC， 1991. Beyond pest deterrence—alternative strategies and hidden costs of endophytic mutualisms in vascular plants ［M］//ANDREW JH， HIRANO SS. Microbial ecology of leaves. New York： Springer Verlag： 358-375.

Chinese Pharmacopoeia Committee， 2020. Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China ［M］. Beijing： China Medical Science Press： 28-29.? ［國家藥典委員會， 2020. 中華人民共和國藥典 ［M］. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社： 28-29.］

COMPANT S， SAMAD A， FAIST H， et al.， 2019. A review on the plant microbiome： ecology， functions， and emerging trends in microbial application ［J］. J Adv Res， 19： 29-37.

DANGL， JL， HORVATH DM， STASKAWICZ BJ， 2013. Pivoting the plant immune system from dissection to deployment ［J］. Science， 341（6147）： 746-751.

GOGARTEN JP， TOWNSEND JP， 2005. Horizontal gene transfer， genome innovation and evolution ［J］. Nat Rev Microbiol， 3（9）： 679-687.

GONZLEZ V， TELLO ML， 2011. The endophytic mycota associated with Vitis vinifera in central Spain ［J］. Fungal Divers， 47（1）： 29-42.

GU XY， LONG HR， XIE JQ， et al.， 2013. Determination of 14 heavy metal elements in Sophora tonkinensis from Guangxi by microwave digestion and ICP-MS ［J］. Lishizhen Med Mat Med Res， 24（2）： 332-333.? ［谷筱玉， 龍海榮， 謝景千， 等， 2013. 廣西山豆根中14種重金屬元素的微波消解ICP-MS法測定 ［J］. 時珍國醫(yī)國藥， 24（2）： 332-333.］

HACQUARD S， SPAEPEN S， GARRIDO-OTER R， et al.， 2017. Interplay between innate immunity and the plant microbiota ［J］. Ann Rev Phytopathol， 55： 565-589.

JONES JD， DANGL JL， 2006. The plant immune system ［J］. Nature， 444（7117）： 323-329.

KUSARI S， HERTWECK C， SPITELLER M， 2012. Chemical ecology of endophytic fungi： origins of secondary metabolites ［J］. Chem Biol， 19（7）： 792-798.

KWAK MJ， KONG HG， CHOI K， et al.， 2018. Rhizosphere microbiome structure alters to enable wilt resistance in tomato ［J］. Nat Biotechnol， 36（11）： 1100-1109.

LI LL， 2021. Antimicrobial activities of different species of endophytes from Artemisia annua ［J］. Guihaia， 41（7）： 1112-1119.? ［李玲玲， 2021. 藥用植物青蒿不同種類的內(nèi)生菌抑菌活性分析 ［J］. 廣西植物， 41（7）： 1112-1119.］

MISHRA A， GOND SK， KUMAR A， et al.， 2012. Season and tissue type affect fungal endophyte communities of the Indian medicinal plant Tinospora cordifolia more strongly than geographic location ［J］. Microbial Ecol， 64（2）： 388-398.

NASCIMENTO T， OKI Y， LIMA D， et al.， 2015. Biodiversity of endophytic fungi in different leaf ages of Calotropis procera and their antimicrobial activity ［J］. Fungal Ecol， 14： 79-86.

O′BRIEN HE， PARRENT JL， JACKSON JA， et al.， 2005. Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples ［J］. Appl Environ Microbiol， 71（9）： 5544-5550.

PENG C， 2011. Traditional Chinese medicine ［M］. Beijing： China Traditional Chinese Medicine Press： 3305-3320.? ［彭成， 2011. 中華道地藥材 ［M］. 北京： 中國中醫(yī)藥出版社： 3305-3320.］

PIETERSE CM， ZAMIOUDIS C， BERENDSEN RL， et al.， 2014. Induced systemic resistance by beneficial microbes ［J］. Ann Rev Phytopathol， 52： 347-375.

YAO YQ， 2017. The diversity， antimicrobial activity and secondary metabolites of endophytic fungi in Sophora tonkinensis Gagnep ［D］. Nanning： Guangxi University： 55-68.? ［姚裕群， 2017. 越南槐內(nèi)生真菌多樣性、抑菌活性及其次生代謝產(chǎn)物研究 ［D］. 南寧： 廣西大學(xué)： 55-68.］

YAO YQ， LAN F， QIAO YM， et al.， 2017. Endophytic fungi harbored in the root of Sophora tonkinensis Gapnep： Diversity and biocontrol potential against phytopathogens ［J］. Microbiol Open， 6（3）： e00437.

ZHANG W， WEI X， ZHANG LY， et al.， 2020. Chemical constituents of Sophora tonkinensis ［J］. Chem Nat Compd， 56（6）： 1140-1142.

（責(zé)任編輯 周翠鳴）