云南三個地區(qū)馬鈴薯內(nèi)生真菌多樣性研究

田甲佳 劉賀 楊季婷 王毅 劉良燕

摘 要：? 為研究云南馬鈴薯（Solanum tuberosum）內(nèi)生真菌的多樣性，該文以采自云南省德宏芒市、大理喜洲和臨滄雙江3個地區(qū)的馬鈴薯植株為研究對象，采用組織塊分離法、尖端菌絲挑取法對馬鈴薯根、莖及塊莖中的內(nèi)生真菌進行分離純化，并采用形態(tài)學(xué)鑒定方法和ITS序列分析法對分離得到的內(nèi)生真菌進行鑒定，對內(nèi)生真菌的定殖率、分離率及多樣性指數(shù)進行計算和分析。結(jié)果表明：（1）共分離得到內(nèi)生真菌98株，其中從德宏芒市的樣品中獲得40株，從大理喜洲的樣品中獲得27株，從臨滄雙江的樣品中獲得31株。（2）經(jīng)鑒定，分離得到的馬鈴薯內(nèi)生真菌共涵蓋10目10科13屬，大多為子囊菌門和擔(dān)子菌門，優(yōu)勢菌為鐮刀菌屬（Fusarium）和青霉屬（Penicillium），褶皺裸孢殼（Emericella rugulosa）、接骨木鐮刀菌（Fusarium sambucinum）、毛韌革菌（Stereum hirsutum）、Psathyrella sulcatotuberculosa和Epicoccum catenisporum 5種真菌均為首次從馬鈴薯植株中分離得到。（3）馬鈴薯塊莖內(nèi)生真菌的定殖率最高，根部內(nèi)生真菌定殖率最低；內(nèi)生真菌的分離率以馬鈴薯根部為最高，而莖部最低；不同組織中內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)趨勢均為根>塊莖>莖。從綜合來看，云南馬鈴薯植株中的內(nèi)生真菌具有較高的多樣性，不同地區(qū)的馬鈴薯樣品中內(nèi)生真菌優(yōu)勢菌不同，馬鈴薯根部具有最豐富的內(nèi)生真菌種群和最高的分離率，是最適合進行內(nèi)生真菌分離的材料。該研究結(jié)果為后期探究馬鈴薯內(nèi)生真菌對病原菌的拮抗作用奠定了基礎(chǔ)，也為馬鈴薯內(nèi)生真菌多樣性研究提供了參考數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞： 內(nèi)生真菌， ITS序列分析， 定殖率， 分離率， 分離頻率， 香農(nóng)多樣性指數(shù)

中圖分類號：? Q939

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2023）07-1201-12

收稿日期：? 2023-04-17

基金項目：? 國家自然科學(xué)基金（31870340）； 云南省高層次人才培養(yǎng)計劃“青年拔尖人才”專項（YNWR-QNBJ-2019-062）。

第一作者： 田甲佳（1997-），碩士研究生，研究方向為馬鈴薯內(nèi)生真菌化學(xué)成分分析，（E-mail）jiajiat55@163.com。

通信作者：? 劉良燕，博士，副教授，研究方向為馬鈴薯真菌病害生物防治，（E-mail）liliy213@126.com。

Diversity of endophytic fungi isolated from Solanum

tuberosum in three regions of Yunnan

TIAN Jiajia1， LIU He1，2， YANG Jiting1， WANG Yi2， LIU Liangyan1*

（ 1. College of Agronomy and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China; 2. Yunnan Key Laboratory

of Forest Plant Cultivation and Utilization， Yunnan Academy of Forestry and Grassland， Kunming 650201， China ）

Abstract：? Plant endophytic fungus is an important biological resource and has shown significant applications in medicine and in the biological control of agricultural pests and diseases. In order to study the diversity of endophytic fungi of potato （Solanum tuberosum）， samples from three regions of Yunnan Province， namely， Dehong Mangshi， Dali Xizhou， and Lincang Shuangjiang. The endophytic fungi in? potato roots， stems and tubers were isolated and cultured using the method of tissue block isolation. Well-grown colonies were purified using the method of tip mycelium selection. The endophytic fungi were identified by morphological methods and ITS sequence analysis. Then， the colonization rate， isolation rate and diversity index of the endophytic fungi were calculated and analyzed. The results were as follows： （1） A total of 98 endophytic fungi were isolated， including 40 strains samples from Dehong Mangshi， 27 strains from Dali Xizhou and 31 strains from Lincang Shuangjiang. （2） The endophytic fungi isolated from potato were identified to include 10 orders， 10 families and 13 genera， mostly of the Ascomycota and Basidiomycota， with Fusarium and Penicillium as the dominant fungi. Five species of fungi， Emericella rugulosa， Fusarium sambucinum， Stereum hirsutum， Psathyrella sulcatotuberculosa and Epicoccum catenisporum were first reported to be isolated from potato plants. （3） Potato tuber had the highest colonization rate of endophytic fungi and root had the lowest; while the isolation rate of endophytic fungi was highest in potato root and lowest in stem; trend of diversity index of endophytic fungi in different tissues were H′root > H′tuber > H′stem. In conclusion， the endophytic fungi in Yunnan potato plants are highly diverse， with different endophytic fungal dominants in potato samples among the three localities， potato root has the richest endophytic fungal populations and the highest isolation rate， and are therefore the most suitable material for endophytic fungal isolation. The above results provide a reference for later investigation of the antagonistic effect of endophytic fungi on pathogens in potato.

Key words： endophytic fungi， analysis of ITS sequence， colonization rate， isolation rate， isolation frequency， Shannon-Wiener index

植物內(nèi)生真菌是指在植物的整個或某一生長階段內(nèi)，在健康植物組織或器官內(nèi)寄居且進行繁殖，同時不會引起寄主植物發(fā)生明顯感染癥狀的真菌（Porras & Bayman， 2011）。此類真菌廣泛存在于植物中，與寄主植物進化過程時建立協(xié)同進化、互利共生的關(guān)系（孫建慧，2018；任靜，2020）。隋麗等（2021）的研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌能增強植物光合特性，提高植物對營養(yǎng)元素的吸收率，并能提高植物在逆境條件下的抗脅迫能力以及產(chǎn)生植物激素來調(diào)節(jié)植物生長。同種內(nèi)生真菌在不同宿主植物中所表現(xiàn)的作用和產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物截然不同。

近年來，從植物內(nèi)生真菌中分離出含有多種生物活性的天然代謝產(chǎn)物，包括生物堿、黃酮、醌類、環(huán)肽、萜類、甾體等化合物。這些化學(xué)成分可以表現(xiàn)出抗菌、抗蟲、抗病毒等多種生物活性（Li et al.， 2007；易曉華，2009；張亮等，2017；趙鑫等，2020；李慧媛等，2022）。植物內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥領(lǐng)域和農(nóng)業(yè)病蟲害生物防治方面均顯示出重要的應(yīng)用價值。吳啟婷等（2022）從白術(shù)（Atractylodes macrocephala）中分離出1株擬莖點霉屬（Phomopsis sp.）內(nèi)生真菌，對白術(shù)根腐病病原菌（Fusarium oxysporum、 F. solani、 F. incarnatum）有較強拮抗作用；陸潔淼等（2022）從西紅花（Crocus sativus）中篩選出8株內(nèi)生真菌，對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）有顯著的拮抗作用，其中抑制效果最好的菌株經(jīng)鑒定為栓菌屬真菌變色栓菌（Trametes versicolor）；黃婷等（2019）從白屈菜（Chelidonium majus）中分離出刺盤孢屬（Colletotrichum）和鐮刀菌屬（Fusarium）內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物對蘋果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、玉米彎孢（Curvularia lunata）、水稻稻瘟菌（Pyricularia oryza）、煙草赤星菌（Alternaria alternate）和白菜黑斑菌（A．brassicae）均表現(xiàn)出抗菌活性；Cao等（2021）的研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌提取物ZNC對馬鈴薯晚疫病具有超高的促生長、促產(chǎn)量和誘導(dǎo)的抗病活性。由此可見，植物內(nèi)生真菌是抗植物真菌病害的生物源農(nóng)藥資源庫。然而，目前對植物內(nèi)生真菌的研究大多集中在藥用植物的內(nèi)生真菌上，而對于農(nóng)作物內(nèi)生真菌的研究卻較少。

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是繼玉米、水稻、小麥之后的第四大糧食作物（馬雪等，2014；鄔時民，2015），其營養(yǎng)價值高、糧菜兼用，并且馬鈴薯面粉儲備時間長，是國家糧食安全的重要保障。云南是我國西南地區(qū)主要的馬鈴薯產(chǎn)地，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)已成為云南貧困地區(qū)農(nóng)民脫貧致富的重要支柱產(chǎn)業(yè)（盧麗麗等，2018）。馬鈴薯產(chǎn)量及品質(zhì)受真菌病害影響很大，目前主要使用化學(xué)農(nóng)藥對真菌病害進行防治，由于化學(xué)藥劑會對環(huán)境及人畜健康造成極大威脅，因此生物防治已成為馬鈴薯真菌病害防控的研究熱點。有研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯內(nèi)生菌對真菌病原體（尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、禾谷鐮刀菌、灰葡萄孢菌等）、細菌病原體（瘡痂鏈霉菌、黃單孢菌）和內(nèi)生毒素龍葵堿等有抑制作用（Sessitsch et al.， 2004；王劍峰，2012；艾洪蓮等，2017；鄭旭，2019；張家欣，2022）。

本研究對云南省3個地區(qū)馬鈴薯的根、莖、塊莖中內(nèi)生真菌進行分離純化，通過觀察其微觀形態(tài)和分析其ITS序列鑒定真菌，并在此基礎(chǔ)上對內(nèi)生真菌的組成及相關(guān)多樣性指數(shù)進行分析和比較，擬探討：（1）馬鈴薯內(nèi)生真菌種群的多樣性；（2）馬鈴薯不同組織部位內(nèi)生真菌的分離率和定殖率；（3）不同地區(qū)內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌屬及不同部位內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)。本研究旨在豐富馬鈴薯內(nèi)生真菌種群，為進一步深入研究這些內(nèi)生真菌及代謝產(chǎn)物對馬鈴薯真菌病害的抑制作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 馬鈴薯健康植株于2020年5月采自云南省德宏芒市、大理喜洲和臨滄雙江。在盛花期采集完整植株，包括地上部分及地下部分。選取地上部分的主莖（冠層以下10 cm及露出土層外的上10 cm）及地下部分根（須狀根）和塊莖，主根長約40 cm，莖長80～100 cm，塊莖大小為8 cm × 5 cm。采集完畢后，立即帶回實驗室進行后續(xù)馬鈴薯內(nèi)生真菌的分離。

1.1.2 試驗培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：成品培養(yǎng)基。MY培養(yǎng)基：21 g酵母麥芽浸粉肉湯，15 g瓊脂，加蒸餾水至1 000 mL，121 ℃下滅菌20 min。

1.2 內(nèi)生真菌的分離純化

消毒：將馬鈴薯根、莖、塊莖表面雜物用自來水反復(fù)沖洗3～4次后，用無菌水沖洗干凈，瀝干水分。將材料用無菌刀切成小段，置于50 mL無菌離心管中，依次用75%乙醇、無菌水和10 mL配置好的5% H2O2浸泡3 min，期間不斷震蕩，用無菌水沖洗3次。將經(jīng)消毒后的組織置于無菌濾紙上，吸干表面多余水分后將根、莖、塊莖切成5 mm × 5 mm的小塊。為檢驗消毒是否徹底，依次設(shè)置2組對照：（1）吸取100 μL最后一次清洗組織塊的無菌水至新鮮無菌PDA培養(yǎng)皿上，用無菌涂布器涂布均勻；（2）使用按壓法，將消毒的組織塊放至新鮮無菌PDA平板上，稍加按壓，放置20 min后移去組織塊，每組處理設(shè)置3個平行。將以上2種不同方法處理的對照置于26 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，觀察有無菌落長出，以明確組織塊消毒是否徹底。

分離純化：將準備好的小組織塊采用組織塊接種法（韋艷梅等，2016），等距離放在含有氨芐青霉素（50 mg·mL-1）和卡拉霉素（10 mg·mL-1）的MY培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放置8～10個組織塊，待培養(yǎng)皿做好標記后倒置，放于26 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d左右，期間不定期觀察組織下方或邊緣處是否有菌落出現(xiàn)；根據(jù)菌落生長形態(tài)、顏色和時間等，采用尖端菌絲挑取法（吳小平等，2009），及時將單個菌落的新鮮菌絲挑出，轉(zhuǎn)接到30 mm PDA培養(yǎng)皿中，倒置于26 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。反復(fù)多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)以獲得形態(tài)一致的單一菌落，即為純化好的內(nèi)生真菌菌株。將其轉(zhuǎn)接到60 mm培養(yǎng)皿中，標記名稱及轉(zhuǎn)接日期，放置在26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～10 d，平板沒有污染，待長滿培養(yǎng)皿后于4 ℃冰箱保存。

1.3? 內(nèi)生真菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 挑取少量各菌種菌絲體置于載玻片上，添加乳酸酚棉蘭染色液，使菌絲染色，同時使用接種針將菌絲挑撥松散后從一側(cè)緩慢蓋上蓋玻片，并在蔡司顯微鏡下觀察，記錄顯微鏡下各菌株菌絲的形態(tài)特征。根據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，結(jié)合《真菌鑒定手冊》（魏景超，1979）和《真菌的形態(tài)和分類》（戴芳瀾，1987）等參考資料對內(nèi)生真菌菌株進行初步鑒定。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定 用改良的CTAB法對馬鈴薯內(nèi)生真菌菌株進行DNA提取（張妙彬等，2009）。參考易天鳳等（2019）的方法，利用內(nèi)生真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對真菌的ITS序列進行擴增。PCR反應(yīng)體系為30 μL，包括模板DNA 2 μL、引物1×2 μL、2×Taq PCR MasterMix 15 μL、ddH2O 11 μL。PCR反應(yīng)擴增程序：99 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。

將瓊脂糖電泳檢測合格后的目的產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行測序，登錄NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），將ITS測序結(jié)果上傳至NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫與已知序列進行比對，選擇相似性高的序列進行分析。利用MEGA 7.0軟件，采用鄰接法（neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4 內(nèi)生真菌數(shù)據(jù)分析

1.4.1 定殖率（colonization rate， CR） 定殖率 = 在培養(yǎng)基中分離出的內(nèi)生真菌組織塊數(shù)/所有組織塊數(shù)×100%（Kátia et al.， 2016）。內(nèi)生真菌的定殖率反映了宿主植物不同組織部位中受內(nèi)生真菌侵染的程度。

1.4.2 分離率（isolation rate， IR） 分離率 = 培養(yǎng)基中分離的內(nèi)生真菌總株數(shù)/總分離組織塊數(shù)×100%（康茜，2017）。內(nèi)生真菌的分離率反映了宿主植物不同組織部位中內(nèi)生真菌存在的豐度。

1.4.3 分離頻率（isolation frequency， IF） 指某一指定類型真菌的菌株數(shù)量占分離培養(yǎng)的內(nèi)生真菌菌株數(shù)量的百分率，用于比較和判斷優(yōu)勢菌群（柴新義等，2016）。

1.4.4 香農(nóng)多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener index，H′） 反映了分離的內(nèi)生真菌中的物種豐富度。香農(nóng)多樣性指數(shù)可用以下公式計算，即

H′=-∑ki=1Pi×lnPi。

式中： k 指某種植物或組織中內(nèi)生真菌種類的總數(shù)；Pi表示植物組織中分離出來的某一種內(nèi)生真菌的株數(shù)占分離得到的總菌株數(shù)的百分數(shù)（Zhao et al.， 2020）。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯內(nèi)生真菌的分離

2.1.1 不同地區(qū)馬鈴薯內(nèi)生真菌分離情況 不同組織部位間馬鈴薯內(nèi)生真菌的分離數(shù)量有一定差異性，利用組織塊分離法和尖端菌絲挑取法，從云南省德宏芒市、大理喜洲、臨滄雙江3個地區(qū)馬鈴薯組織樣品中共分離出98株內(nèi)生真菌（表1）。其中，從來自德宏芒市的馬鈴薯樣品中分離出40株、從來自大理喜洲的馬鈴薯樣品中分離出27株、從來自臨滄雙江的馬鈴薯樣品中分離出31株，分別占總分離株數(shù)的40.82%、27.55%、31.63%。

2.1.2 內(nèi)生真菌定殖率和分離率 分離得到的98株內(nèi)生真菌中，有44株來自根部、14株來自莖部、40株來自塊莖（表2）。由表2可知，根、莖、塊莖中內(nèi)生真菌的定殖率分別為68.33%、65.00%、76.67%，表明塊莖中內(nèi)生真菌定殖率最高。馬鈴薯根部、莖部和塊莖中內(nèi)生真菌的分離率分別為73.33%、23.33%、66.67%，表明根部分離率最高。馬鈴薯組織中內(nèi)生真菌總定殖率和總分離率分別為70.00%和54.44%。

2.2 馬鈴薯內(nèi)生真菌的鑒定

2.2.1 內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定 挑選出測序成功的14株不同種的內(nèi)生真菌的ITS序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中進行核酸序列BLAST比對，選擇和測序序列相關(guān)性比較高的序列進行分析，表3結(jié)果表明，這14種內(nèi)生真菌大部分屬于子囊菌門和擔(dān)子菌門，涵蓋10個目13個屬，并且ITS序列和GenBank相似性均在99%以上。基于內(nèi)生真菌ITS rDNA序列所得的14株菌株的系統(tǒng)進化樹如圖1所示。

2.2.2 內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定 通過形態(tài)學(xué)觀察（菌落觀察和顯微鏡下菌絲體觀察）（圖2）及分子生物學(xué)技術(shù)（ITS）鑒定，98株內(nèi)生真菌多為子囊菌門和擔(dān)子菌門，包含13屬14種（表4），分別為構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans，M1）、褶皺裸孢殼（Emericella rugulosa，M2）、局限青霉（Penicillium restrictum，M3）、長極鏈格孢（Alternaria longissima，M4）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum，M5）、接骨木鐮刀菌（Fusarium sambucinum，M6）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum，M7）、Pseudopyrenochaeta terrestris （M8）、Plectosphaerella plurivora （M9）、毛韌革菌（Stereum hirsutum，M10）、Colletotrichum boninense （M11）、Psathyrella sulcatotuberculosa（M12）、Epicoccum catenisporum （M13）和Cercospora musigena （M14），分別將其命名為M1-M14。

2.2.3 內(nèi)生真菌的組成分析 通過形態(tài)學(xué)觀察（菌落觀察和顯微鏡下菌絲體觀察）及分子生物學(xué)技術(shù)（ITS）鑒定，98株馬鈴薯內(nèi)生真菌包含13屬14種（圖3），分別為曲霉屬（Aspergillus）、裸孢殼屬（Emericella）、青霉屬（Penicillium）、鏈格孢屬（Alternaria）、鐮刀菌屬（Fusarium）、木霉屬（Trichoderma）、須殼孢屬（Pseudopyrenochaeta）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）、韌革菌屬（Stereum）、刺盤孢屬（Colletotrichum）、脆柄菇屬（Psathyrella）、附球菌屬（Epicoccum）和尾孢菌屬（Cercospora）。其中，鐮刀菌屬真菌占15.3%、青霉屬占13.3%、曲霉屬占12.2%。

2.3 不同地區(qū)內(nèi)生真菌優(yōu)勢種群分析

從不同地區(qū)、不同組織部位中分離得到的內(nèi)生真菌在種類和數(shù)量上存在明顯區(qū)別（圖4）。德宏芒市的馬鈴薯樣品中，內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為青霉屬和曲霉屬，分離頻率為30.00%和25.00%。分離于根部的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為曲霉屬，IF為35.29%；分離于莖部的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為青霉屬和鏈格孢屬，IF均為37.50%；分離于塊莖的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為青霉屬，IF為33.30%（圖4：A）。

大理喜洲的馬鈴薯樣品中，內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為裸孢殼屬和刺盤孢屬，分離頻率為29.63%和18.52%。分離于根部的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為裸孢殼屬，IF為35.71%；分離于莖部的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為附球菌屬，IF為100.00%；分離于塊莖的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為刺盤孢屬，IF為45.45%（圖4：B）。

臨滄雙江的馬鈴薯樣品中，內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為韌革菌屬，分離頻率為29.03%。分離于根部的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為韌革菌屬，IF為46.15%；分離于莖部的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為附球菌屬，IF為75.00%；分離于塊莖的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為小不整球殼屬，IF為28.57%（圖4：C）。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)脆柄菇屬內(nèi)生真菌僅能從根部分離得到，在根部的分離頻率為6.81%。

2.4 不同部位內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)分析

馬鈴薯不同組織部位中的內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)（ H′）各不相同且呈現(xiàn)出一定規(guī)律（表5）。由表5可知，德宏芒市馬鈴薯樣品各組織中，內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)表現(xiàn)為H′根（1.42）> H′塊莖（1.26）> H′莖（0.78）；大理喜洲馬鈴薯樣品各組織中，內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)大小表現(xiàn)為H′根（1.51）>H′塊莖（1.28）>H′莖（0.28）；臨滄雙江馬鈴薯樣品中，各組織內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)大小表現(xiàn)為H′根（1.29）>H′塊莖（1.12）>H′莖（0.49）。由此可見，馬鈴薯根部內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)高于莖部和塊莖。

3 討論與結(jié)論

受真菌生活環(huán)境的影響，一些真菌的菌落形態(tài)特征十分相似，采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法對內(nèi)生真菌進行鑒定和分類存在很大難度，要求鑒定者有相當(dāng)豐富的經(jīng)驗。因此，觀察真菌的生長環(huán)境、對比真菌菌落菌絲形態(tài)以及將顯微結(jié)構(gòu)特點與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法，是更為準確可靠的鑒定手段。本研究從云南3個地區(qū)（德宏芒市、大理喜洲、臨滄雙江）的馬鈴薯根、莖和塊莖中共分離到內(nèi)生真菌98株，使用傳統(tǒng)分類學(xué)結(jié)合ITS序列分析的方法將其歸為13屬14種，多為子囊菌門和擔(dān)子菌門，優(yōu)勢屬為鐮刀菌屬和青霉屬，其他菌屬分別為曲霉屬、裸孢殼屬、鏈格孢屬、木霉屬、須殼孢屬、小不整球殼屬、韌革菌屬、刺盤孢屬、脆柄菇屬、附球菌屬和尾孢菌屬。艾紅蓮等（2017） 從馬鈴薯內(nèi)生真菌中分離到鏈格孢屬、 鐮刀菌屬和附球菌屬。謝佳偉等（2021）從云南的87株煙草中分離出內(nèi)生真菌103株，其中優(yōu)勢菌屬也包含鐮刀菌屬；李盼盼等（2018）從湖北的健康煙草中共分離到539株內(nèi)生真菌，鐮刀菌屬為優(yōu)勢菌屬，說明鐮刀菌屬廣泛存在于茄科植物中。此外， 本研究中分離鑒定的褶皺裸孢殼、接骨木鐮刀菌、毛韌革菌、Psathyrella sulcatotuberculosa和Epicoccum catenisporum 5種內(nèi)生真菌均為首次從馬鈴薯植株中分離得到。

本研究采用組織塊分離法共分離了180塊馬鈴薯組織塊，長菌的組織塊為126塊，總定殖率為70%，對于馬鈴薯內(nèi)生真菌總定殖率尚未見有學(xué)者報道，而李曉娜等（2009）對于橡膠樹中內(nèi)生真菌的研究顯示，總定殖率為91.94%，結(jié)果高于本研究，這可能與材料本身的科屬有關(guān)，馬鈴薯為茄科一年生草本植物。橡膠樹為大戟科多年生木本植物，由于馬鈴薯生長周期較短，外界的微生物侵染率低，導(dǎo)致其定殖率較低；而橡膠樹生長周期長，外界的微生物侵染率高，因此它的定殖率高。從不同組織的分離數(shù)量來看，塊莖定殖率最高，說明馬鈴薯塊莖中受內(nèi)生真菌侵染度最高，這可能與地下部分的微生物活動及養(yǎng)分有關(guān)聯(lián)；根部分離率最高，說明馬鈴薯根部分離得到的內(nèi)生真菌屬豐度最高，這可能與土壤中微生物含量和種類有關(guān)系。不同地區(qū)（來源）及不同組織中內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)趨勢均為H′根>H′塊莖>H′莖，這可能是莖部采自馬鈴薯地上部分，根部和塊莖采自馬鈴薯地下部分，而空氣中內(nèi)生真菌感染率要比土壤中內(nèi)生真菌感染率低。李盼盼等（2018）對湖北煙草不同組織中內(nèi)生真菌多樣性表現(xiàn)的研究結(jié)果為H′莖>H′葉>H′根，與本結(jié)果相反，說明不同地區(qū)不同物種植物中內(nèi)生真菌的組織偏好性不一樣。

本研究發(fā)現(xiàn)，各組織中分布的內(nèi)生真菌種類差別較大，德宏芒市馬鈴薯樣品中優(yōu)勢菌為青霉菌，大理喜洲馬鈴薯樣品中優(yōu)勢菌為翹孢霉菌，臨滄雙江馬鈴薯樣品中優(yōu)勢菌為韌革菌。此外，一些常見的內(nèi)生真菌（如鏈格孢屬、鐮刀菌屬）在莖和根中均能分離得到，而Psathyrella僅能從根部分離到，韌革菌屬不能在莖中分離到。劉宏玉等（2021）對煙草的研究發(fā)現(xiàn)，葉點霉屬（Phyllosticta）只分布在其葉中，而Fusarium不能從葉中分離得到，說明內(nèi)生真菌具有組織的專一性和特異性（Huang et al.， 2008）。

本研究從云南省3個地區(qū)的馬鈴薯樣品中分離得到98株內(nèi)生真菌，其中5種內(nèi)生真菌為首次從馬鈴薯植株中分離得到，豐富了馬鈴薯內(nèi)生真菌種群，為馬鈴薯內(nèi)生真菌多樣性的研究提供了準確的參考數(shù)據(jù)。后期，將進一步進行內(nèi)生真菌拮抗馬鈴薯病原真菌的活性篩選，并對其次生代謝產(chǎn)物進行化學(xué)成分和抗菌活性研究，期望獲得結(jié)構(gòu)新穎的高活性物質(zhì)，為馬鈴薯真菌病害的生物防治提供科學(xué)基礎(chǔ)和依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛 王登惠）