基于抗病毒活性檢測的中藥板藍根質(zhì)量控制研究

張麗,何燕,馬祖文（新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830000）

板藍根來源于十字花科植物菘藍的根，在流感等感染性疾病的治療中較為常用，具有確切的臨床療效[1]?，F(xiàn)版《中國藥典》定性板藍根質(zhì)量控制的依據(jù)主要為精氨酸薄層鑒別，但板藍根具有復(fù)雜的化學(xué)成分，缺乏明確的藥效物質(zhì)，在其質(zhì)量控制中，精氨酸鑒別意義不大[2]。在中藥質(zhì)量研究中，將中藥質(zhì)量生物控制模式建立起來已經(jīng)成為發(fā)展趨勢，特別是一些中藥品種，測定含量時缺乏指標(biāo)性成分，將生物活性檢測方法建立起來能夠?qū)ΜF(xiàn)有質(zhì)控水平進行完善并使其提升[3]。要想使中藥質(zhì)量生物控制得以實現(xiàn)，關(guān)鍵是要將生物活性測定方法優(yōu)化并建立起來，并保證其與藥品檢定要求相符，和藥效相關(guān)[4]。本文研究了中藥板藍根基于抗病毒活性檢測的質(zhì)量控制?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

1.1 藥材與試劑 板藍根藥材來源于十字花科植物菘藍的干燥根。NA底物。

1.2 主要儀器 熒光酶標(biāo)檢測儀（FLUOstar OPTIMA，BMG公司），熒光酶標(biāo)板（96孔，COSTAR公司），V型微量板（96孔，姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 細胞系、病毒株與NA 1%紅細胞：用PBS與兔紅細胞制作1%紅細胞混懸液，保存在4℃的溫度下備用；流感病毒：A/PR8/34；NA制備：培養(yǎng)細胞，接種病毒，將濾除細胞的病毒液取出，滅活，除菌過濾后分裝，作為NA原液保存在-70℃的溫度下。

2 實驗方法

2.1 板藍根紅細胞凝集活性測定方法

2.1.1 供試品溶液制備 將本品粉末取出，過三號篩，精密稱定，放置于圓底燒瓶中，精密量取10倍量乙醇溶液加入其中，將重量稱定，加熱回流40min，放冷，然后將重量稱定，用乙醇將減失的重量補足，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液，水浴蒸干，用PBS溶解殘渣，取出上清液，除菌過濾。直接用PBS溶解陽性對照藥，制成1mg/ml初濃度。

2.1.2 測定法 在V形微量板（96孔）上用PBS兩倍系列稀釋供試品溶液，每個供試品溶液做兩排，每孔加入50μl，將50μl PBS加入到每排最后1孔中，將其設(shè)定為陰性對照。然后將50μl 1%紅細胞混懸液加入到每個孔中，以輕柔的動作對微量板進行拍打30s，混勻，在4℃的溫度下靜置2h，對結(jié)果進行觀察。

2.1.3 結(jié)果判定 在白色背景上放置微量板，比較供試品孔和陰性對照孔，陽性（+）判定標(biāo)準為紅細胞沒有全部在底部沉積，一些在孔壁上附著，或有一層紅細胞均勻附著在孔壁上；陰性（-）判定標(biāo)準為紅細胞在底部沉積成一規(guī)則的圓點，沒有紅細胞附著在孔壁。本品效價為供試品出現(xiàn)陽性的最高稀釋倍數(shù)。

2.2 板藍根紅細胞凝集活性和抗病毒活性相關(guān)性實驗

2.2.1 板藍根抑制NA活性的測定 依據(jù)已建立的板藍根抑制NA活性測定步驟與方法測定。

2.2.2 數(shù)據(jù)處理 板藍根對NA抑制活性的反應(yīng)抑制率計算公式為：（I）=（酶活性對照熒光-樣品作用后熒光）/（酶活性對照熒光-背景熒光）×100%。

2.2.3 相關(guān)性統(tǒng)計方法 將自變量、應(yīng)變量分別設(shè)定為NA抑制活性、紅細胞聚集效價，將統(tǒng)計分析樣品設(shè)定為上述20份藥材，運用直線相關(guān)分析方法對兩種方法檢測結(jié)果的相關(guān)性進行考察。采用SAS 8.12統(tǒng)計軟件計算直線相關(guān)分析。

3 結(jié)果

3.1 板藍根對紅細胞的凝集活性觀察 將供試品溶液制備出來，組成成分為三批板藍根樣品與陽性對照藥PHA-p，檢測紅細胞凝集活性，反應(yīng)前后分別在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)板藍根和陽性對照藥對紅細胞的凝集活性均顯著。

3.2 方法學(xué)驗證

3.2.1 供試品溶液穩(wěn)定性 將同批板藍根粉末取出，制備供試品溶液，避光密封保存，在0h、4h、8h、12h、24h時分別測定凝集活性，RSD=5.8%，發(fā)現(xiàn)供試品溶液24h內(nèi)凝集活性在避光密封保存條件下具有良好的穩(wěn)定性。

3.2.2 重復(fù)性 將6份供試品溶液分別制備出來，RSD=7.0%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

3.2.3 中間精密度 為了對改變實驗室內(nèi)部條件影響測定結(jié)果的情況進行考察，相同實驗室不同實驗人員與不同工作日的RSD=9.9%，表明不同實驗人員之間具有良好的中間精密度，該方法具有良好的日間精密度。

3.2.4 重現(xiàn)性 多個實驗室對同一樣品具有較小的測定結(jié)果變異，RSD=7.9%，表明方法具有良好的重現(xiàn)性。

3.3 板藍根紅細胞凝集活性和其抗病毒藥理作用的相關(guān)性驗證 檢測20批板藍根藥材的紅細胞凝集活性，并檢測其對流感病毒NA活性的抑制作用，進行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)板藍根紅細胞凝集效價和其抑制流感病毒NA活性之間相關(guān)性顯著（r=0.83，P＜0.01），兩種測定方法的結(jié)果具有較為一致的變化趨勢。檢測板藍根紅細胞凝集活性能夠和板藍根抗流感病毒的藥理作用較好關(guān)聯(lián)。

4 討論

板藍根的主要藥效作用為抗病毒，雞胚培養(yǎng)法及臨床試驗等均證實，紅細胞凝集活性和其抗病毒作用呈顯著的正相關(guān)關(guān)系[5]。本研究結(jié)果表明，板藍根和陽性對照藥對紅細胞的凝集活性均顯著。供試品溶液24h內(nèi)凝集活性在避光密封保存條件下具有良好的穩(wěn)定性。方法具有良好的重復(fù)性、日間精密度以及良好的重現(xiàn)性。板藍根紅細胞凝集效價和其抑制流感病毒NA活性之間相關(guān)性顯著（r=0.83，P＜0.01），兩種測定方法的結(jié)果具有較為一致的變化趨勢。板藍根紅細胞凝集活性檢測與板藍根抗流感病毒的藥理作用有較強的相關(guān)性，說明板藍根基于紅細胞凝集活性測定的質(zhì)量生物鑒定方法能夠?qū)ΜF(xiàn)行板藍根質(zhì)量控制水平進行補充與完善，同時也為缺乏合適化學(xué)檢測指標(biāo)的中藥質(zhì)量控制提供思路與技術(shù)支持。

從理論上來說，如果藥理學(xué)方法可量化，那么其就能夠在檢測中藥生物活性中應(yīng)用，但是雞胚培養(yǎng)法、細胞保護實驗等抗病毒藥理實驗在定量化、安全性、可操作性等方面很難使藥品檢定的要求得到有效滿足[6]。本研究所建立的板藍根凝集活性測定方法具備定量、簡便易行等優(yōu)勢，在控制板藍根質(zhì)量、評價其品質(zhì)過程中具有一定優(yōu)勢與可行性。中藥品質(zhì)鑒定的生物測定方法的補充、完善提高了現(xiàn)有的中藥質(zhì)量，且并沒有取代現(xiàn)有方法。如果中藥品種缺乏清晰的藥效成分與適宜的化學(xué)測定指標(biāo)，那么就應(yīng)該將生物測定的方法重點發(fā)展起來。如果中藥品種能夠?qū)⒒瘜W(xué)成分闡明，化學(xué)指標(biāo)能夠關(guān)聯(lián)藥效，那么可以采用以化學(xué)測定為主的質(zhì)控方式。針對不同中藥采取具有不同側(cè)重點的常規(guī)檢測+生物測定+化學(xué)測定三位一體的方法與模式，從而共同為中藥質(zhì)量把關(guān)。

綜上所述，研究中所建立的方法和板藍根抗流感病毒的藥效相關(guān)，進而可區(qū)分與評價不同樣品的品質(zhì)，適用性較好，值得推廣。