特應性皮炎免疫浸潤相關miR-155靶基因的篩選及驗證

王曉晨，陳露，劉暢，陳曉青，李芃，邱文洪

1 江漢大學醫(yī)學部免疫學教研室，武漢 430101；2 江漢大學醫(yī)學部實驗中心；3 武漢市中心醫(yī)院皮膚科

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，臨床主要特征是濕疹樣病變，并伴有強烈瘙癢，而且是慢性或復發(fā)性的病程。該疾病影響到所有年齡和種族的人，對患者和親屬有重大的社會心理影響，是造成全球皮膚疾病負擔的主要原因［1］。免疫浸潤是指免疫細胞在受損或感染的組織中聚集和活化的過程。研究［2］顯示，AD免疫浸潤可能與表皮屏障功能障礙、表皮免疫微環(huán)境中細胞因子調節(jié)紊亂等因素有關，其發(fā)病機制涉及屏障功能障礙、微生物失調和免疫失調之間復雜的相互作用。角質形成細胞作為皮膚角質層的重要組成細胞，在皮膚屏障、皮膚炎癥以及免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用［3］。轉錄組是基因組遺傳信息和生物功能蛋白質之間的必然聯(lián)系，轉錄水平的調控是最重要的生物調控方法，也是研究最多的。轉錄組測序技術是獲得轉錄組數(shù)據(jù)的一項高通量測序技術。基于第二代測序技術的全轉錄組測序研究，可以挖掘、了解更多的基因結構信息，進而為臨床治療提供依據(jù)。近年來，越來越多的研究通過全轉錄組測序分析非編碼RNA的表達對疾病的影響機制，研究AD發(fā)生和發(fā)展的分子機制，增加對AD的了解，并識別新的治療靶點，以改進診斷和治療策略，為臨床治療提供更多更有效的解決方案。miR-155是一種多功能微小RNA，在調節(jié)免疫反應中起著重要作用［4-7］。有研究［8］表明，miR-155在AD患者皮損處中高表達。2022年6月—2022年12月，我們篩選了與AD免疫浸潤相關的miR-155靶基因，并進行細胞實驗驗證，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取和處理 在GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）按照以下條件檢索基因表達譜：①疾病為AD；②生物類型為人類；③樣本類型為皮膚組織。最終選取GSE121212和GSE157194兩個數(shù)據(jù)集作為研究分析對象，其中GSE121212數(shù)據(jù)集包括21例AD患者的皮損區(qū)和非皮損區(qū)皮膚活檢樣本組織；GSE157194數(shù)據(jù)集包括57例AD患者的皮損區(qū)和其中54例AD患者的非皮損區(qū)皮膚活檢樣本組織。

1.2 AD皮損區(qū)差異表達基因生物學功能分析、顯著差異表達基因的篩選及蛋白互作網絡（PPI）繪制1.2.1 AD皮損區(qū)差異表達基因的篩選 利用R軟件包limma-voom （version 3.40.6）對GSE121212、GSE157194數(shù)據(jù)集按照|log2Fc|≥1、P＜0.05的標準篩選差異表達的基因，利用VENNY 2.1.0網站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將GSE121212、GSE157194數(shù)據(jù)集篩選出的基因取交集，獲得AD差異表達基因。

1.2.2 AD皮損區(qū)差異表達基因的生物學功能分析 使用R軟件包org.Hs.eg.db（version 3.1.0）中的基因的GO注釋，以此作為背景，將篩選出的AD差異表達基因映射到背景集合中，使用R軟件包clusterProfiler（version 3.14.3）進行GO功能富集分析，獲得基因集富集的結果。對于基因集KEGG通路富集分析，我們使用KEGG rest API （https：//www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html）獲取了最新的KEGG Pathway的基因注釋，以此作為背景，將篩選出的AD差異表達基因映射到背景集合中，使用R軟件包clusterProfiler（version 3.14.3）進行KEGG通路富集分析，獲得基因集富集的結果。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.2.3 AD皮損區(qū)顯著差異表達基因的篩選、PPI繪制 為了找到作用更明顯的顯著差異基因，我們對上述獲得的差異表達基因進一步按照|log2Fc|≥2、P＜0.05的標準篩選出顯著差異表達基因，將篩選出的顯著差異表達基因導入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）繪制PPI，通過Cytoscape插件MCODE模塊分析得分最高的3個模塊。

1.3 AD皮損區(qū)與非皮損區(qū)皮膚免疫細胞浸潤情況分析 基于CIBERSORT算法，按照P＜0.05的標準計算22種免疫細胞在GSE157194數(shù)據(jù)集樣本中的占比情況，對AD皮損區(qū)與非皮損區(qū)皮膚免疫細胞浸潤情況進行差異分析。

1.4 miR-155靶基因的預測及其與AD免疫浸潤相關基因的篩選 利用miRNet網站（https：//www.mirnet.ca/miRNet/home.xhtml）對miR-155靶基因進行預測，并利用VENNY 2.1.0網站對miR-155靶基因和AD顯著差異表達基因取交集，利用The Human Protein Atlas網站，查找交集基因在人永生化角質形成細胞株HaCaT細胞上的轉錄水平，并根據(jù)免疫細胞浸潤情況、AD皮損區(qū)差異表達基因GO功能和KEGG通路富集分析結果，選擇與AD免疫浸潤相關性較高的基因進行細胞驗證。

1.5 HaCaT細胞培養(yǎng)、分組及炎癥模型構建 將對數(shù)生長期HaCaT細胞按8×105/孔細胞密度接種于6孔板中，將細胞置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，等到細胞貼壁牢固后分為control組和TI組。TI組細胞棄去舊培養(yǎng)基，加入2 mL無菌PBS清洗2次，然后進行HaCaT細胞炎癥模型的構建：每孔加入含5 ng/mL的TNF-α和5 ng/mL的IFN-γ新鮮培養(yǎng)基刺激6 h后，棄去含藥物的培養(yǎng)基，加上10%完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。control組常規(guī)培養(yǎng)。

1.6 TI組、control組細胞中miR-155檢測 采用qRT-PCR法。取TI組、control組細胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，以U6為參照，以cDNA為模板進行qPCR反應。qPCR反應體系為：cDNA 5 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，SYBR Green 10 μL， Nucleasefree water 3 μL。qPCR反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，44個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示細胞中目的基因mRNA的相對表達量。

1.7 TI組HaCaT細胞亞組設置、質粒轉染及CXCL1、CXCL8 mRNA檢測 取TI組HaCaT細胞分成2個亞組：TI + miR-155 mimics組、TI + mimics NC組。TI + miR-155 mimics組轉染miR-155過表達質粒miR-155 mimics，TI + mimics NC組轉染過表達對照質粒mimics NC，轉染過程均按照lipofectamine 2000轉染試劑說明書要求進行，轉染完成后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以GAPDH為內參，參照“1.6”方法檢測TI+ miR-155 mimics組、TI + mimics NC組細胞中CXCL1、CXCL8 mRNA。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件。計量資料呈正態(tài)分布時以±s表示，比較用t檢驗或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AD皮損區(qū)差異表達基因生物學功能分析及顯著差異表達基因的篩選結果 從GSE121212數(shù)據(jù)集中篩選出1547個差異表達基因，其中920個上調基因、627個下調基因。從GSE157194數(shù)據(jù)集中篩選出1031個差異表達基因，其中731個上調基因、300個下調基因。取交集后，共篩選得到519個AD差異表達基因。

GO功能富集分析結果顯示，這些差異表達基因在參與生物過程（BP）方面主要富集在免疫系統(tǒng)過程、免疫反應、防御反應、白細胞的激活等；在細胞組分（CC）方面主要富集于細胞外區(qū)域、質膜的固有成分、質膜部分、質膜的組成部分、細胞表面等；在分子功能（MF）方面主要富集在趨化因子受體結合、細胞因子活性、細胞因子受體結合、信號受體結合、細胞因子受體活性等方面。GO功能富集分析結果提示，這些差異表達基因在表皮免疫微環(huán)境中主要通過免疫分子相互作用，參與免疫應答過程，引起炎癥反應。KEGG通路富集分析結果顯示，通路主要富集在細胞因子—細胞因子受體相互作用、病毒蛋白與細胞因子及細胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路、IL-17信號通路、類風濕性關節(jié)炎、Th1和Th2細胞分化、T細胞受體信號通路等炎癥相關信號通路。KEGG通路富集分析結果提示，這些差異表達基因在表皮免疫微環(huán)境中主要通過趨化因子等相關炎癥分子信號通路參與免疫應答過程，引起炎癥反應。

從GSE121212數(shù)據(jù)集中篩選出210個顯著差異表達基因，其中158個上調基因、52個下調基因；從GSE157194數(shù)據(jù)集中篩選出122個顯著差異表達基因，其中106個上調基因、16個下調基因。取交集后，共篩選得到73個AD顯著差異表達基因。成功構建出由67個節(jié)點、146條邊組成的PPI網絡圖，其中得分最高的模塊得分10分，模塊中包括PI3、SPRR2B、LCE3C、LCE3E、SPRR3、LCE3A、SPRR2A、SPRR2F、LCE3D、LCE5A等基因，其中LCE5A基因是表達下調基因，其余均為表達上調基因；得分第二高的模塊得分5分，模塊中包括KRT16、KRT6A、KRT6C、KRT6B、DEFB4A、S100A7、SERPINB4、SERPINB3等基因，全部為表達上調基因；得分第三高的模塊得分4.5分，模塊中包括CXCL1、CXCL10、CCL17、MMP1、SELE等基因，全部為表達上調基因。

2.2 AD皮損區(qū)與非皮損區(qū)皮膚免疫細胞浸潤情況分析結果 樹突狀細胞、M2巨噬細胞和肥大細胞在表皮免疫微環(huán)境中占比最高，免疫浸潤最明顯。活化的記憶CD4+T細胞、中性粒細胞、未活化的自然殺傷細胞、單核細胞、M0巨噬細胞、活化的樹突狀細胞等在AD患者的皮損區(qū)有不同程度的升高，而未活化的肥大細胞在AD患者的皮損區(qū)明顯減少。

2.3 miR-155靶基因及其與AD免疫浸潤相關基因的篩選結果 預測得到4724個miR-155靶基因。取交集后，篩選得到13個基因，包括CXCL8、KRT6B、SELE、PI3、CHAC1、TCN1、OASL、CXCL1、C6orf223、IGFL1、MMP1、AKR1B10、FOSL1。在這13個基因中，在HaCaT細胞上的轉錄水平較高的基因為PI3、FOSL1、CXCL8和CXCL1，其中與AD免疫浸潤相關性比較高的基因為CXCL1、CXCL8。

2.4 TI組、control組細胞中miR-155相對表達量比較 TI組、control組細胞中miR-155相對表達量分別為24.606 ± 3.060、1.156 ± 0.214，兩組相比，P＜0.05，說明TNF-α和IFN-γ可提高HaCaT細胞中miR-155的相對表達量。

2.5 TI + miR-155 mimics組、TI + mimics NC組細胞中CXCL1、CXCL8 mRNA相對表達量比較 TI+ miR-155 mimics組細胞中CXCL1、CXCL8 mRNA相對表達量分別為6.032 ± 0.216、22.561 ± 0.566，TI + mimics NC組細胞中CXCL1、CXCL8 mRNA相對表達量分別為4.159 ± 0.351、12.778 ± 0.761，兩組相比，P均＜0.05，說明miR-155可顯著提高炎癥時HaCaT細胞中CXCL1、CXCL8基因的表達水平。

3 討論

AD的病理生理機制主要包括皮膚屏障功能受損、免疫系統(tǒng)功能的失調以及環(huán)境因素的影響［9］。皮膚屏障的破壞會導致皮膚屏障功能障礙，改變表皮微環(huán)境中免疫分子水平以及免疫細胞功能和數(shù)量，進而引發(fā)AD患者的皮膚炎癥，造成AD患者的免疫失調。而角質形成細胞作為皮膚的重要組成成分，起著皮膚屏障的作用，還可發(fā)揮免疫調節(jié)作用［3］?；罨慕琴|形成細胞可分泌IL-1、IL-6、TNF-α、TSLP等多種細胞因子和趨化因子等，在調節(jié)表皮免疫微環(huán)境和皮膚屏障功能等方面發(fā)揮作用［10］。

miR-155是一種多功能miRNA，參與免疫細胞的分化、發(fā)育以及免疫應答的調控［4，11］，以及介導炎癥反應方面發(fā)揮重要作用［6］。SONKOLY等［8］研究表明，在AD患者皮損處miR-155的表達量高于非皮損處，并且miR-155在AD患者皮損處的高表達最為顯著。但miR-155在表皮免疫微環(huán)境中的作用機制還不清楚。

本研究使用生物信息學方法篩選AD患者皮損區(qū)與非皮損的差異表達基因，并對這些差異表達基因進行GO和KEGG富集分析。GO功能富集分析顯示差異表達基因的分子功能主要富集在趨化因子受體結合、細胞因子活性、細胞因子受體結合、信號受體結合、細胞因子受體活性等方面，主要參與和免疫細胞因子及其通路相關的生物過程。KEGG功能富集結果顯示，差異表達基因富集到了細胞因子—細胞因子受體相互作用、病毒蛋白與細胞因子及細胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路等與細胞因子相關的多條信號通路。GO和KEGG功能富集分析結果提示，這些差異表達基因在表皮免疫微環(huán)境主要通過免疫分子相互作用，影響趨化因子等相關炎癥分子信號通路，參與免疫應答過程，引起炎癥反應，在AD的發(fā)生發(fā)展中起到關鍵作用。

免疫細胞浸潤分析結果顯示，樹突狀細胞、M2巨噬細胞和肥大細胞在表皮免疫微環(huán)境中占比最高，免疫浸潤明顯。這些免疫細胞可分泌多種細胞因子，如IL-31、IL-17、IL-23、IL-33，這些細胞因子會引起宿主的免疫反應，加強炎癥反應，炎癥反應的刺激又進一步損傷皮膚屏障，造成皮膚屏障功能障礙［12-14］。

本研究進一步篩選出13個顯著差異基因，可能為miR-155的靶基因。基于基因在HaCaT細胞上的轉錄水平，以及免疫浸潤分析和功能富集分析的結果，我們篩選出趨化因子CXCL1和CXCL8來驗證miR-155對HaCaT細胞的影響，為進一步探索miR-155在AD免疫浸潤中的作用機制，明確特應性皮炎發(fā)病機制打基礎。

CXCL1是中性粒細胞的化學引誘劑，在炎癥中起作用［15-17］。CXCL8又稱IL-8，是由巨噬細胞和上皮細胞等分泌的細胞因子，是炎癥反應的重要介質，可以與其他細胞因子一起參與促炎信號級聯(lián)反應，并在全身炎癥反應綜合征（SIRS）中發(fā)揮作用［18-21］。CXCL1與CXCL8都可與G蛋白偶聯(lián)受體CXC受體2（CXCR2）結合增加血管的通透性［22］。從本研究做出的PPI網絡也可以看出，CXCL1和CXCL8可以相互作用，從而促進炎癥反應。

HaCaT細胞是人永生化角質形成細胞，目前常用于皮膚的體外研究。TNF-α和IFN-γ可促進炎癥細胞的活化與浸潤，是目前公認的誘導HaCaT細胞炎癥模型的細胞因子［23］。本研究結果表明，在炎癥細胞模型中，高水平的miR-155可以促進趨化因子CXCL1和CXCL8的分泌，參與皮膚炎癥反應發(fā)生。

綜上，通過生物信息學挖掘技術，對AD的皮損區(qū)與非皮損區(qū)皮膚進行基因差異分析、功能富集分析以及免疫浸潤分析，篩選出miR-155靶基因趨化因子CXCL1和CXCL8。miR-155可以促進HaCaT細胞趨化因子CXCL1和CXCL8的分泌，可能通過CXCL1和CXCL8改變表皮微環(huán)境中免疫分子水平，進而導致免疫細胞浸潤增加，造成AD患者的免疫調節(jié)功能失衡，引發(fā)AD患者的皮膚炎癥。但miR-155是如何調控CXCL1和CXCL8表達，并影響特應性皮炎患者皮損區(qū)表皮免疫微環(huán)境中免疫分子水平以及免疫細胞數(shù)量和功能，有待進一步研究。