間充質(zhì)干細(xì)胞治療自身免疫性肝病的臨床研究進(jìn)展

史婉婉, 錢建丹, 王貴強(qiáng)

北京大學(xué)第一醫(yī)院感染疾病科, 北京 100034

自身免疫性肝病(autoimmunel liver disease,AILD)是一類由自身免疫反應(yīng)異常導(dǎo)致肝細(xì)胞和/或膽管上皮細(xì)胞損傷的慢性肝膽系統(tǒng)炎性疾病,其臨床表現(xiàn)按照其病理學(xué)和發(fā)病機(jī)制可以分為三類:自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)、原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis,PBC)和原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis,PSC)[1-4]。這三種AILD臨床表現(xiàn)多樣,其中疲勞、食欲不振、肝臟不適和鞏膜黃染比較常見,并導(dǎo)致血液檢查中肝功能指標(biāo)異常。此外,與自身免疫性疾病最突出的特征一致,AILD患者會產(chǎn)生自身抗體。

最近幾年的研究強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞治療在臨床應(yīng)用中的巨大潛力,特別是間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)治療,由于其諸多優(yōu)點(diǎn)而成為一種有前途的治療方法,并得到了大量的研究關(guān)注。MSC存在廣泛,有自我更新及多項(xiàng)分化潛能,可以產(chǎn)生脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的祖細(xì)胞等,以適應(yīng)機(jī)體炎癥信號和分化的需要[5]。由于MSC具有多譜系分化潛能、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的能力、易于接觸源組織和優(yōu)異的體外繁殖能力,已被認(rèn)為是治療組織再生、自身免疫性疾病和高炎癥性疾病的理想來源。許多研究[6-11]已經(jīng)證明了MSC治療不同疾病的安全性和可行性,包括移植物抗宿主病、急性呼吸窘迫綜合征、心血管疾病、癌癥、骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病和肝硬化。特別是抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)和肝細(xì)胞分化特性使MSC有望成為治療AILD的候選藥物。近年來,MSC在治療自身免疫性疾病方面也開始發(fā)揮巨大作用。本文介紹了最近MSC治療AILD的臨床研究進(jìn)展,詳述MSC治療AILD的機(jī)制原因,簡述開發(fā)該新型療法的臨床應(yīng)用所面臨的挑戰(zhàn)。

1 MSC在AIH中的治療進(jìn)展

AIH在女性發(fā)病率較高,組織學(xué)表現(xiàn)為高IgG、高自身抗體、界面性肝炎等[12],主要有兩種類型:抗核抗體和/或抗平滑肌抗體陽性為1型,而抗肝腎微粒體抗體1型和/或抗肝細(xì)胞質(zhì)1型自身抗體陽性為2型[13]。其治療通常選擇激素和免疫抑制劑療法,但是停藥易復(fù)發(fā),最終遷延為肝纖維化和肝癌[14]。其中AIH在AILD中發(fā)病率較高,對于AIH的治療,通常用類固醇來緩解誘導(dǎo),硫唑嘌呤常用于緩解維持[15]。其他AIH的二線和三線治療藥物,如霉酚酸酯和他克莫司,是對標(biāo)準(zhǔn)療法反應(yīng)不足或不耐受的AIH患者的選擇。然而,這些免疫抑制藥物會引發(fā)許多不良反應(yīng),包括庫欣樣特征、感染、骨質(zhì)疏松癥和胃腸道問題[16]。

目前,AIH的臨床試驗(yàn)開展較少,其中一項(xiàng)適應(yīng)性、多中心、Ⅱa期、多疾病臨床試驗(yàn)(NCT02997878)正在進(jìn)行,該試驗(yàn)由英國伯明翰大學(xué)發(fā)起,以探究單次輸注人臍帶血來源的MSC治療PSC和AIH患者的安全性和藥物活性。入組AIH患者要求≥18歲,有明確AIH臨床診斷,符合AIH的肝活檢結(jié)果,并且血清學(xué)結(jié)果符合入組和排除標(biāo)準(zhǔn)。該臨床試驗(yàn)選擇單次靜脈注射MSC共3個(gè)劑量水平,分別評估此療法對于AIH患者的療效。通過后期監(jiān)測嚴(yán)重不良事件、不良事件發(fā)生率、劑量限制毒性來確定此療法的安全性和耐受性。第一階段監(jiān)測ALT水平,第二階段監(jiān)測肝臟生化學(xué)和功能的相關(guān)指標(biāo),包括AST、ALP、GGT、膽紅素、白蛋白、INR和MELD評分的基線變化,免疫球蛋白G,無創(chuàng)纖維化標(biāo)志物(增強(qiáng)肝纖維化評分)和瞬時(shí)彈性成像,以及瘙癢目測模擬量表、9點(diǎn)疲勞嚴(yán)重程度量表和SF-36v2以測評其生活質(zhì)量,其他相關(guān)的評測指標(biāo):免疫激活的標(biāo)志物包括免疫球蛋白和C反應(yīng)蛋白、膽道損傷標(biāo)志物包括總膽汁酸水平、血清細(xì)胞因子和趨化因子譜、通過qPCR或等效技術(shù)測量循環(huán)細(xì)胞中的RNA和微RNA譜,最終臨床試驗(yàn)結(jié)果尚未發(fā)布。

2 MSC在PBC中的治療進(jìn)展

在PBC中,免疫系統(tǒng)會錯誤地攻擊膽管,主要是肝臟中的小膽管受到損害。隨著膽管被破壞,膽管所攜帶的物質(zhì)會積聚在肝臟和血液中,引起瘙癢、疲勞和代謝問題。在PBC晚期,可導(dǎo)致肝硬化[17]。熊去氧膽酸(UDCA)是主要的治療藥物,已被證明可以減緩疾病進(jìn)展,對改善膽道功能有一定療效,但25%～50%的PBC患者無法從UDCA治療過程中獲得完全的治療反應(yīng)。由于其他PBC藥物可能會影響UDCA的吸收,可采用奧貝膽酸(OCA)治療;對于一些僅對UDCA治療無反應(yīng)的患者,可應(yīng)用貝特類降脂藥物[18]。

MSC作為PBC新療法的前沿藥物,已有2項(xiàng)完成的臨床試驗(yàn)。2011年,由臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSC)是否以及如何改善PBC患者病情的臨床試驗(yàn)(NCT01662973)開展。2013年發(fā)布試驗(yàn)結(jié)果:研究納入7例對UDCA治療反應(yīng)不佳的PBC患者,將培養(yǎng)的UC-MSC按照0.5×106/kg通過外周靜脈輸注給PBC患者,每隔4周給予3次UC-MSC靜脈輸注,隨訪48周。試驗(yàn)結(jié)果顯示大多數(shù)患者經(jīng)UC-MSC治療后,疲勞、瘙癢等癥狀明顯緩解。與基線相比,隨訪結(jié)束時(shí)ALP和GGT水平顯著降低,梅奧風(fēng)險(xiǎn)評分在治療和隨訪期間保持穩(wěn)定,并且UC-MSC治療未見明顯副作用。UC-MSC輸注在對UDCA治療只有部分反應(yīng)的PBC患者中是可行的,且耐受性良好[19]。2014年的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)評估了異基因骨髓來源的MSC移植(BM-MSCT)治療UDCA 耐藥的PBC患者的安全性和有效性,10例入組患者均被允許同時(shí)繼續(xù)之前的UDCA治療。在MSC輸注后1、3、6、12個(gè)月進(jìn)行隨訪評估。隨訪結(jié)束后,未觀察到與移植相關(guān)的副作用,BM-MSCT后患者的生活質(zhì)量得到改善。BM-MSC輸注后血清ALT、AST、GGT和IgM水平較基線顯著降低。外周淋巴細(xì)胞亞群中CD8+T淋巴細(xì)胞比例降低,CD4+CD25+Foxp3+T淋巴細(xì)胞比例增加,血清IL-10水平升高。值得注意的是,BM-MSC治療后3～6個(gè)月獲得最佳治療效果,并可維持12個(gè)月?？傊?異基因BM-MSC治療UDCA耐藥的PBC患者是安全有效的[20]。

3 PSC的臨床治療困境

PSC是一種罕見疾病,在普通人群中患病率為6/10萬～16/10萬人,其特點(diǎn)是損傷肝內(nèi)和肝外的大膽管,導(dǎo)致膽道狹窄和擴(kuò)張,是一種涉及肝內(nèi)和肝外膽管的炎性纖維化疾病,最終導(dǎo)致膽汁性肝硬化和門靜脈高壓[21],PSC通常與炎癥性腸病相關(guān),包括但不限于潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病[22]。盡管PSC的發(fā)病機(jī)制尚不確定,但有證據(jù)表明,源自腸道的細(xì)菌或細(xì)菌產(chǎn)物具有刺激作用,并伴有某些遺傳因子的自身炎癥反應(yīng),目前尚無有效的治療方法。在嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)下,肝移植是合并終末期肝病(肝細(xì)胞癌或膽管癌)PSC患者的一種選擇,肝移植術(shù)后10年復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)約為20%[23]。因此探索新的療法對于PSC來說,臨床意義重大。MSC是否可以針對PSC患者進(jìn)行臨床試驗(yàn),目前相關(guān)研究正在進(jìn)行中。

4 MSC治療AILD的機(jī)制

4.1 MSC和MSC的細(xì)胞外囊泡(MSC-EV)通過免疫調(diào)節(jié)減輕肝臟炎癥 MSC可能通過其免疫調(diào)節(jié)功能抑制炎癥,促進(jìn)肝細(xì)胞存活,減輕肝纖維化和延緩肝臟疾病進(jìn)展[24]。越來越多的證據(jù)強(qiáng)調(diào)了MSC及其外泌體在免疫調(diào)節(jié)中的作用。目前普遍認(rèn)為MSC通過旁分泌途徑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,其中細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)是最具可能的有效途徑。EV是具有磷脂雙分子層膜的細(xì)胞分泌的囊泡,能夠通過轉(zhuǎn)移膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA介導(dǎo)細(xì)胞間信號連接[25]。與MSC相比,MSC-EV體積更小,具有治療上的便捷性。MSC可以通過多種方式與肝臟中的免疫細(xì)胞相互作用,也可以通過細(xì)胞因子的分泌等調(diào)控炎癥和促進(jìn)肝臟再生[26]。研究[27]表明MSC可以有效抑制先天免疫系統(tǒng)細(xì)胞的激活。

MSC-EV可減少促炎細(xì)胞(M1巨噬細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、Th1和Th17細(xì)胞)的增殖,下調(diào)IL-1β和抑制IL-6的釋放,增加抗炎亞型M2巨噬細(xì)胞的比例,并能抑制適應(yīng)性免疫細(xì)胞的激活,包括T淋巴細(xì)胞亞群[28]和B淋巴細(xì)胞亞群等[29]。此外,MSC可通過分泌一系列抗炎分子抑制T淋巴細(xì)胞增殖,如一氧化氮、吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)、前列腺素E2、IL-10、細(xì)胞死亡配體1 (PD-L1)、TGF-β1、血紅素加氧酶-1、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、半凝集素等[30-36]。MSC可抑制細(xì)胞毒作用CD8+T淋巴細(xì)胞的活化,自身表達(dá)高水平的IDO,從而抑制活化T淋巴細(xì)胞的增殖[37]。同時(shí)MSC還可以通過細(xì)胞凋亡因子/配體(Fas/FasL)途徑促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo) CD4+CD25+FOXP3 Treg分化[38-39]。研究表明BM-MSC對B淋巴細(xì)胞也有調(diào)節(jié)作用。淋巴素β受體信號通路與TNF和IL-1受體信號通路聯(lián)合,可下調(diào)IL-17的表達(dá),從而在全身炎癥期間阻礙淋巴細(xì)胞生成[40]。MSC還可以調(diào)控調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cell,Breg)分化。脂肪組織來源的MSC能夠促使B淋巴細(xì)胞分化為Breg并分泌IL-10,對T淋巴細(xì)胞具有不依賴于IL-10分泌的活化調(diào)節(jié)作用[41]。早期研究表明,MSC可以通過阻斷G0/G1期的細(xì)胞周期和直接接觸PD-1/PD-L1通路抑制B淋巴細(xì)胞的增殖。MSC可以分泌CCL2,抑制漿細(xì)胞中的信號通路轉(zhuǎn)錄激活因子3 (STAT3)的激活,促進(jìn)PAX5的表達(dá),從而抑制B淋巴細(xì)胞中IgG的產(chǎn)生[42]。另一方面,MSC可誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生調(diào)控CD19+CD24highCD38 Breg活性[43]。此外,MSC-EV主要積聚在肝臟[30],能夠通過逆轉(zhuǎn)AIH中Treg的下降,促進(jìn)肝臟免疫穩(wěn)態(tài),緩解肝臟炎癥。

另外,MSC-EV可顯著降低促炎細(xì)胞因子IL-2的表達(dá),同時(shí)增強(qiáng)抗炎細(xì)胞因子TGF-β、HGF等mRNA的表達(dá)。肝臟的Kupffer細(xì)胞在吞噬MSC-EV后產(chǎn)生TGF-β等細(xì)胞因子,進(jìn)而促進(jìn)Treg的產(chǎn)生,從而抑制肝臟炎癥[44]。有文獻(xiàn)報(bào)道了MSC-EV的miR-223-3p可以降低脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)基因STAT3和p-STAT3的表達(dá),可抑制幼稚T淋巴細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。因此,MSC-EV處理后Tregs/Th17細(xì)胞比例增加,可以緩解AIH炎癥反應(yīng)[45]。而MSC-EV中的miR-223被證明可以降低炎癥小體NLRP3和Caspase-1水平,從而減少肝細(xì)胞的凋亡。而過表達(dá)miR-223的BM-MSC可以抑制轉(zhuǎn)錄因子STAT3和p-STAT3表達(dá),導(dǎo)致小鼠炎癥模型血清中ALT和AST水平顯著降低,以及炎癥因子水平的降低[46]。 IL-35被認(rèn)為是一種抗炎細(xì)胞因子,在人和小鼠Treg中高度表達(dá)[47],IL-35-MSC治療可抑制細(xì)胞凋亡,有相關(guān)研究[48]表明,用IL-35基因修飾的脂肪組織來源的MSC治療AIH模型小鼠發(fā)現(xiàn),肝單個(gè)核細(xì)胞的凋亡標(biāo)志物如FasL和促炎細(xì)胞因子如IFN-γ和IL-17顯著減少。在聚肌苷-聚胞苷酸鈉(Poly I∶C)誘導(dǎo)的PBC小鼠模型中同樣驗(yàn)證了BM-MSC治療的效果,可能的分子機(jī)制可能與TGF-β和Treg的相互作用有關(guān),接受MSC治療的小鼠外周血和淋巴結(jié)中Treg含量增加,血清中TGF-β水平升高,而TGF-β是一種促進(jìn)Treg分化的細(xì)胞因子。最終導(dǎo)致模型小鼠血清ALP水平降低、浸潤肝臟膽管上皮的淋巴細(xì)胞也明顯減少,抑制了免疫細(xì)胞在肝臟的增殖和浸潤[35],從而減輕了肝臟炎癥[49]。

4.2 MSC在肝細(xì)胞再生中的作用機(jī)制 MSC可分化為肝細(xì)胞,同時(shí)MSC也可作為間質(zhì)支持細(xì)胞,可通過其分泌的外泌體靶向損傷位點(diǎn),以恢復(fù)肝臟內(nèi)穩(wěn)態(tài),并使肝細(xì)胞功能恢復(fù)、修復(fù)和再生[50]。研究表明,MSC在肝損傷過程中,可以遷移到損傷部位。MSC對肝損傷釋放的趨化因子有刺激作用,如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子[51]、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子[52]。MSC表達(dá)大量趨化因子受體,可通過炎癥趨化因子和細(xì)胞因子而在炎癥部位“安家”,MSC表面的CD44可使其與內(nèi)皮細(xì)胞上的E -選擇素結(jié)合,到達(dá)靶區(qū)[53]。這一過程促進(jìn)了肝損傷時(shí)受損細(xì)胞的再生。MSC遷移到肝臟的能力有限。但MSC可以通過旁分泌作用促進(jìn)血管生成,這是MSC再生的另一個(gè)主要機(jī)制。體外實(shí)驗(yàn)[54]表明,不同來源的MSC可以促進(jìn)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管形成,增強(qiáng)受損組織的供氧、營養(yǎng)和生長因子釋放,從而促進(jìn)受損組織的再生。

5 MSC治療AILD的挑戰(zhàn)和展望

MSC通常被認(rèn)為是一種安全的治療策略,可用于AILD等慢性肝病患者,目前的臨床試驗(yàn)包括肝衰竭、酒精、HBV或HCV引起的肝硬化以及原發(fā)性膽管炎等。然而,為了使MSC成為治療上述肝臟疾病的臨床選擇,還需要進(jìn)一步可靠的隨機(jī)臨床研究來提高療效,驗(yàn)證其可靠性。此外,為了提高M(jìn)SC的療效,還需要進(jìn)一步研究最佳的給藥途徑、足夠數(shù)量的MSC以及延長移植的MSC在患者體內(nèi)的生存期等。同時(shí),MSC的低遷移和多樣分化潛能,MSC的最佳來源,以及發(fā)生腫瘤和病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)等問題也需要解決?？傊?希望MSC治療能給更多的AILD患者帶來新的希望。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：史婉婉負(fù)責(zé)撰寫文章及修訂論文;錢建丹負(fù)責(zé)審閱并修訂論文;王貴強(qiáng)負(fù)責(zé)提出研究選題和終審論文。