小球藻蛋白提取及酶解工藝優(yōu)化

羅冰

大連職業(yè)技術(shù)學(xué)院（大連 116035）

小球藻（chlorella）在自然界中廣泛存在，具有利用光能的自養(yǎng)能力，并且可以在化學(xué)合成或者天然有機(jī)質(zhì)存在的條件下進(jìn)行人工培養(yǎng)，因?yàn)槠渖L(zhǎng)速度快，近些年在多個(gè)領(lǐng)域得到重視和利用。小球藻含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和成分，包括多糖類碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素及其他成分，具有很高的開發(fā)價(jià)值和利用價(jià)值，近年來(lái)成為較熱的研究方向[1-4]。蛋白核小球藻因含有較高的蛋白質(zhì)而得名，達(dá)60%以上蛋白質(zhì)的特點(diǎn)使其達(dá)到或者接近魚粉及啤酒酵母的蛋白質(zhì)水平，高于大豆中含有的粗蛋白含量，因而蛋白核小球藻為一種新型的單細(xì)胞蛋白資源，高蛋白含量使其含有豐富的氨基酸，接近標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸模式，也為其開發(fā)利用提供優(yōu)勢(shì)，具有開發(fā)為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和高蛋白配料的潛力，并有望用于人類、動(dòng)物相關(guān)的食品和飼料。另有研究表明，蛋白核小球藻蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)開發(fā)后可以得到F值寡肽，具有較強(qiáng)的抗疲勞效果，有輔助治療肝臟疾病的效果，該作用促進(jìn)小球藻蛋白的開發(fā)和應(yīng)用潛力[5-7]。雖然有一些以小球藻藻粉作為原料的食品生產(chǎn)與銷售，針對(duì)小球藻中蛋白質(zhì)的研究還略微不足，需要加強(qiáng)蛋白的研究與開發(fā)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展活性肽的研究，包括抗氧化肽、抗菌肽等不同的生物活性肽。

活性肽由多種氨基酸按照一定的種類和數(shù)量組合而成，數(shù)量較多，功能由其氨基酸組成和序列結(jié)構(gòu)決定，因其結(jié)構(gòu)不同而呈現(xiàn)出不同功能，常見的活性肽包括抗氧化肽[8-9]、降血壓肽[10-11]、免疫肽[12]和抗腫瘤肽[13-14]等。試驗(yàn)以小球藻蛋白提取和制備抗氧化多肽為目標(biāo)，優(yōu)化提取工藝和制備條件，為小球藻產(chǎn)品的開發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

小球藻粉（東臺(tái)市賜百年生物工程有限公司）；堿性蛋白酶（南京都萊生物科技有限公司）；DPPH（Sigma公司）；HCl、KCl、NaH2PO4、Na2HPO4、Tris堿、NaOH等（均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)試劑公司）。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

臺(tái)式高速離心機(jī)（TG16.5，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（UV-5500PC，上海元析儀器有限公司）；電子天平[PL303，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；水浴鍋（HHS-1，江蘇金壇良友實(shí)驗(yàn)儀器廠）；粉碎機(jī)（FW100，天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.3 提取及抗氧化分析

小球藻→堿液提取→工藝優(yōu)化→小球藻提取液→蛋白含量分析→濃縮→小球藻蛋白濃縮液→酶解制備多肽→工藝優(yōu)化→酶解液→自由基清除效果分析

1.4 可溶性蛋白含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定。配制一系列不同濃度的可溶性牛血清蛋白溶液，以水為對(duì)照，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品蛋白含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算。

1.5 單因素試驗(yàn)

1.5.1 堿濃度對(duì)提取率的影響

稱取100 mg小球藻粉，加入5 mL不同濃度（0.01，0.05，0.10，0.15和0.20 mol/L）的NaOH溶液，提取后測(cè)定可溶性蛋白含量，并按式（1）計(jì)算提取率。提取采用80 ℃提取20 min，料液比設(shè)定為1∶50（g/mL）。

式中：V為提取小球藻的堿液用量，mL；m為小球藻使用量，100 mg。

1.5.2 溫度對(duì)可溶性蛋白提取的影響

稱取100 mg小球藻粉，加入5 mL 0.1 mol/L堿液，在60，70，80，90和100 ℃下提取小球藻粉，測(cè)定可溶性蛋白含量。設(shè)定堿濃度0.1 mol/mL、料液比1∶50（g/mL）、提取時(shí)間20 min。

1.5.3 料液比對(duì)可溶性蛋白提取的影響

稱取100 mg小球藻粉，設(shè)定料液比1∶30，1∶40，1∶50，1∶60和1∶70（g/mL），于80 ℃提取20 min，提取后測(cè)定可溶性蛋白含量。

1.6 正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)得出的最佳料液比、浸提溫度和堿液濃度為中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，因素水平表如表1所示。

表1 小球藻蛋白提取正交試驗(yàn)因素水平表

1.7 小球藻濃縮液制備

以正交試驗(yàn)最佳提取工藝制備500 mL小球藻提取液，測(cè)定蛋白質(zhì)含量后，裝入透析袋后，以聚乙二醇5000進(jìn)行濃縮，獲得50 mL濃縮液待用。

1.8 酶解正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在獲得最佳提取蛋白條件基礎(chǔ)上，結(jié)合堿性蛋白酶的性質(zhì)和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，采用正交試驗(yàn)對(duì)堿性蛋白酶酶解小球藻提取濃縮液的最優(yōu)工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)表如表2所示。其中，小球藻提取濃縮液用量為5 mL，調(diào)節(jié)pH后在不同溫度下反應(yīng)30 min。

表2 酶解正交試驗(yàn)因素水平表

表3 NaOH溶液濃度對(duì)提取效果的影響

正交試驗(yàn)結(jié)果分析以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，確定較佳的酶解條件。

1.9 抗氧化活性測(cè)定

抗氧化活性的測(cè)定采用DPPH清除法。將酶解樣品（100 μL）加入到DPPH-甲醇溶液中（4 mL 0.1 mmol/L），加入Tris-HCl緩沖液（450 μL 50 mmol/L，pH 7.4），置于25 ℃恒溫水浴30 min，測(cè)定517 nm波長(zhǎng)處吸光度。以去離子水替代酶解樣品為對(duì)照。DPPH自由基清除能力按式（2）計(jì)算。

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；A1為樣品測(cè)定管的吸光度；A2為樣品本底管的吸光度。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

溶性蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。在樣品測(cè)試中以獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行可溶性蛋白含量計(jì)算，y=0.006 4x+0.005（R2=0.998 8）。

圖1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 堿濃度對(duì)可溶性蛋白提取的影響

根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇0.01～0.2 mol/L氫氧化鈉溶液進(jìn)行小球藻粉的提取，其中設(shè)定料液比1∶50（g/mL）、提取溫度60 ℃。試驗(yàn)結(jié)果表明，在濃度0.10 mol/L時(shí)提取的可溶性蛋白質(zhì)提取率最高，達(dá)到38.89%。NaOH溶液濃度超過(guò)0.1 mol/L后，增加堿濃度對(duì)提取的結(jié)果影響較小，基本穩(wěn)定在同一水平，考慮到后續(xù)堿液處理等問(wèn)題，因而選擇使用0.1 mol/L堿液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 溫度對(duì)可溶性蛋白提取的影響

確定NaOH溶液濃度0.1 mol/L、料液比1∶50（g/mL），稱取100 mg小球藻藻粉，加入5 mL堿液，充分振蕩后，在不同溫度下提取20 min，提取后測(cè)定可溶性蛋白含量，結(jié)果如表4所示。

表4 溫度對(duì)蛋白提取效果的影響

表5 料液比對(duì)蛋白提取效果的影響

由試驗(yàn)結(jié)果可知，溫度在60～80 ℃時(shí)，溫度升高，可溶性蛋白提取量明顯增大，溫度在80～100 ℃時(shí)，溫度升高對(duì)可溶性蛋白提取影響不大。溫度在80℃左右時(shí)，蛋白質(zhì)提取率最高。

2.4 料液比對(duì)可溶性蛋白提取的影響

稱取100 mg小球藻粉，分別加入3，4，5，6和7 mL 0.1 mol/L堿溶液，提取后測(cè)定可溶性蛋白含量。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，液料比1∶70（g/mL）時(shí)，蛋白質(zhì)提取率最高，主要是因?yàn)樘崛∪芤河昧吭黾雍?，提取溶液中可溶性蛋白質(zhì)的濃度略低，因?yàn)樘崛∪芤毫枯^大，所以溶解出更多的可溶性蛋白質(zhì)。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，提取溶液量大影響后續(xù)濃縮成本。因此可以選擇溶液量適中的料液比進(jìn)行提取。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，料液比對(duì)小球藻蛋白質(zhì)提取的影響最大，其次為溫度，NaOH溶液濃度對(duì)提取結(jié)果的影響最小。由表6結(jié)果可知，最佳的工藝條件為B3C2A2，即料液比1∶70（g/mL），溫度80 ℃，NaOH溶液濃度0.1 mol/L。在此條件下進(jìn)行重復(fù)提取驗(yàn)證，蛋白質(zhì)提取率為40.15%，該結(jié)果與正交試驗(yàn)第9組相近。

表6 可溶性蛋白質(zhì)提取正交試驗(yàn)結(jié)果分析表

2.6 小球藻蛋白的酶解研究

小球藻蛋白提取后采用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，對(duì)DPPH自由基的清除效果如表7所示。

表7 蛋白酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

由表7結(jié)果可知，A、B、C這3個(gè)因素中，A因素對(duì)結(jié)果的影響最大，其次為B因素，C因素對(duì)結(jié)果的影響最小。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果最佳條件為A2B3C2，即pH 9.5、堿性蛋白酶添加量0.07%和反應(yīng)溫度50 ℃，經(jīng)過(guò)重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，DPPH清除率為50.1%。

3 結(jié)論

基于小球藻的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和開發(fā)潛力，針對(duì)其含量較高的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，得到的蛋白提取率與堿濃度、溫度、液料比有關(guān)。堿液濃度0.1 mol/L左右時(shí)，蛋白質(zhì)提取率越高。溫度80 ℃左右時(shí)，蛋白質(zhì)提取率越高。液料比1∶70（g/mL）時(shí)，蛋白質(zhì)提取率最高。采用堿性蛋白酶酶解的最佳工藝條件根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果最佳條件為A2B3C2，即pH 9.5、堿性蛋白酶添加量0.07%和反應(yīng)溫度50 ℃。后續(xù)對(duì)蛋白質(zhì)提取和酶解過(guò)程均需進(jìn)一步優(yōu)化。