植物甾醇己二酸單酯對膽固醇膠束的沉淀作用

胡毓元，馬傳國，劉 君，白 歌，郭姝婧

（河南工業(yè)大學 小麥與玉米深加工國家工程研究中心 鄭州 450001）

植物甾醇是植物中的一類天然化學物質，廣泛分布于植物油、堅果和谷物中[1]。自20 世紀50年代以來，植物甾醇因優(yōu)良的降膽固醇活性和預防心血管疾病的作用而受到廣泛關注[2]。食用含有植物甾醇的食物，有利于降低血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，從而降低心血管疾病的風險。一般來說，推薦的植物甾醇攝入量約為1.5～3 g/d，可以使LDL-C 水平下降7%～12%[3]。然而，由于油溶性差、水不溶性和高熔點等特性，因此游離植物甾醇在食品工業(yè)中的應用受到限制。構建新型植物甾醇衍生物，通過結構修飾來提高游離植物甾醇的理化特性和生物利用率是解決方法之一。

目前，有許多研究嘗試對植物甾醇進行結構修飾。以植物甾醇二酸單酯為中間體，將取代基引入植物甾醇是一種常用的方法。由于獨特的分子結構，新型植物甾醇衍生物可能具有突出的功能特性。例如，植物甾醇琥珀酸聚乙二醇酯具有良好的表面活性[4]。β-谷甾醇琥珀酸兒茶素酯在乳液中表現出一定的抗氧化性[5]。此外，植物甾醇琥珀酸單酯能夠有效降低動物模型血液中的膽固醇和LDL-C 水平且對肝臟沒有明顯的負面影響[6]，說明植物甾醇二酸單酯保留了植物甾醇的降膽固醇活性且未表現出毒性。

植物甾醇酯的合成方法主要有化學法和生物酶法。然而，以植物甾醇和二元酸或二元酸酐為底物，植物甾醇二元酸單酯的酶促合成效率非常低[7]。Chung 等[8]以4-二甲基氨基吡啶為催化劑，在甲苯中，將β-谷甾醇與琥珀酸酐進行偶聯。在回流溫度下反應6 h，植物甾醇琥珀酸單酯的產率為81%。王慧慧[9]以甲苯為溶劑，以離子液體為催化劑制備植物甾醇琥珀酸單酯。結果表明，1-丁基磺酸-3-甲基咪唑硫酸氫鹽（[BSO3HMim][HSO4]）為最適宜催化劑，在100 ℃下反應2 h，酯化率達94%。Klumphu 等[10]以甲苯和三乙胺為溶劑和催化劑，在60 ℃下制備植物甾醇琥珀酸單酯，產率達98%。植物甾醇和琥珀酸酐在干燥甲苯中，氮氣氛圍下，120 ℃無催化劑合成植物甾醇琥珀酸單酯，產率為95%[11]。雖然這些方法都有效，但是化學方法往往涉及催化劑殘留和植物甾醇高溫易氧化等風險。

生物酶催化劑被越來越多地用于非水溶劑中，催化非天然酯化和酯交換反應[12]。前期研究發(fā)現，以β-谷甾醇和己二酸二乙烯酯為反應底物制備β-谷甾醇己二酸乙烯酯時，β-谷甾醇己二酸乙烯酯會發(fā)生部分水解，生成β-谷甾醇己二酸單酯[13]，這有望成為一條溫和的高效制備植物甾醇己二酸單酯的酶促路線。同時，在體外胃腸道消化模擬過程中，β-谷甾醇己二酸多元醇酯也會被胰脂酶水解成β-谷甾醇己二酸單酯，最大水解率超過25%，因此有必要評估β-谷甾醇己二酸單酯是否保留了重要的降膽固醇活性。本文擬對β-谷甾醇己二酸單酯的制備工藝進行優(yōu)化，考察其物理特性，探討其體外降膽固醇的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-谷甾醇（＞75%）、油酸（分析純）、膽固醇（99%），阿拉丁試劑（上海）有限公司；己二酸二乙烯酯（＞99.0%）、牛磺膽酸鈉（＞95.0%），西亞化學科技（山東）有限公司；Novozym 435（來自南極念珠菌的脂肪酶B，10 U/mg）、Lipozyme RM（來自米黑根霉的脂肪酶，250 IUN/g）、Lipozyme TL IM（來自疏毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶，250 IUN/g），諾維信（中國）有限公司；皺褶假絲酵母脂肪酶（Type VII，≥700 U/mg），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

正己烷、異辛烷、叔丁醇，天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇（色譜純），德國Meker 公司；甲酸（色譜純），阿拉丁試劑（上海）有限公司；所有反應用有機溶劑均為國產分析純級。

1.2 儀器與設備

1260 高效液相色譜系統（配有蒸發(fā)光檢測器），美國Agilent 公司；SHA-CA 數顯水浴恒溫振蕩器，上海華燕儀器有限公司；AL104-IC 電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZF 真空干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TGL-16C 高速離心機，上海安亭科學儀器廠；D8 Advance X 射線衍射儀，德國Bruker 公司；DSC 204F1 差示掃描量熱儀，德國Netzsch 公司；DSA-100 接觸角測量儀，德國KRUSS 公司；Axioscope 5 偏振光顯微鏡，德國ZEISS 公司；Zetasizer Nano ZSP 動態(tài)光散射，英國馬爾文儀器公司；HT7700 透射電子顯微鏡，日本日立高新技術公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 β-谷甾醇己二酸單酯的制備 參照前期研究方法[13]，以β-谷甾醇和己二酸二乙烯酯為原料，皺褶假絲酵母脂肪酶（CRL）為催化劑，通過酯交換反應制備β-谷甾醇己二酸乙烯酯。待β-谷甾醇完全反應完后，過濾回收酶。濾液旋轉蒸發(fā)，除去溶劑。將析出的固體加入10 mL 溶劑，溶解完全后加入20 mg/mL 脂肪酶置于50 ℃水浴恒溫振蕩器中，以200 r/min 的速率振蕩。反應1 h 后，過濾回收酶。濾液旋轉蒸發(fā)，除去溶劑。析出的固體加入熱蒸餾水（60 ℃）洗滌，以洗脫過量的己二酸。所得固體經真空干燥過夜，密封保存?zhèn)溆?。?谷甾醇己二酸單酯的合成反應路線圖見圖1。

圖1 β-谷甾醇己二酸單酯的合成反應路線圖Fig.1 Synthetic route of β-sitosterol adipate monester

1.3.2 高效液相色譜儀（HPLC）條件 參照任明星[14]的方法，采用Zorbax 300SB-C18 反相色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），35 ℃柱溫箱溫度，10 μL進樣量，甲醇/甲酸（V/V，1 000/1）流動相，1 mL/min流速，60 ℃蒸發(fā)光檢測器溫度。利用各組分相應的純化產物建立標準曲線，用于定量分析。

1.3.3 X 射線衍射儀（XRD）條件 在檢測池中放置適量的樣品，以銅X 射線管作為X 射線源。以每分鐘0.5 次的速度掃描，衍射掃描區(qū)域為5°～40°。

1.3.4 差示掃描量熱儀（DSC）條件 樣品（5～10 mg）被放入鋁鍋中，以10 ℃/min 的速度從50 ℃加熱到150 ℃。在20.0 mL/min 的氮氣氛圍下記錄熱分析曲線以及數據。一個空的鋁制鍋作為空白。

1.3.5 接觸角測量儀條件 配制高濃度樣品的二氯甲烷溶液，滴于預熱的載玻片上使溶劑蒸發(fā)的同時樣品延展成膜。將載玻片固定于接觸角測定儀操作臺，滴加10 μL 去離子水于樣品上，測量其固液接觸角。

1.3.6 偏振光顯微鏡（PLM）條件 將粉末樣品分散在水中滴到載玻片上，分別使用10 倍（10×）和100 倍（100×）的物鏡觀察。至少捕獲5 張圖像來確定樣本的特征。

1.3.7 膽固醇模型膠束的制備 采用Wang 等[15]的方法制備模型膠束，略做調整。將含有5 mmol/L?；悄懰徕c、2 mmol/L 膽固醇、4 mmol/L 油酸、132 mmol/L 氯化鈉的15 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（PBS，pH 7.4）超聲處理30 min，然后置于35 ℃的水浴恒溫振蕩器中，過夜平衡。所得懸浮液以15000 r/min 離心20 min 后，進一步用0.22 μm 的膜過濾器過濾。濾液即為膽固醇模型膠束，現配現用。

1.3.8 體外降膽固醇活性的測定 將4 mg 樣品加入4 mL 模型膠束中，然后在35 ℃孵育至少24 h。同時，將不添加樣品的模型膠束作為對照組，在相同條件下進行孵育。最后，經離心和過濾后，得到膠束相和沉淀相。采用HPLC 測定樣品在膠束相的溶解度。此外，降膽固醇的活性（%）根據公式（1）[15]計算：

式中，A空白——對照組的膽固醇峰值面積；A——試驗組的膽固醇峰值面積。

1.3.9 膠束相平均粒徑的測定 膠束相的平均粒徑測定范圍為0.6～10 000 nm，樣品在25 ℃下平衡2 min，掃描11 次。所有樣品均直接測定，不稀釋。

1.3.10 透射電子顯微鏡（TEM）條件 為了觀察膠束相和沉淀相的微觀形態(tài)，通過TEM 獲得高分辨率圖像。取少量膠束相溶液直接滴在300 目碳支撐網格上，沉淀相需預分散在PBS 溶液中再滴在碳網上，在室溫下干燥，然后進一步分析。

1.4 數據分析

所有測量均獨立重復至少3 次，以“平均值±標準偏差（SD）”表示。使用SPSS 17.0（美國IBM公司）進行單因素方差分析，顯著性水平設定值為0.05。使用Origin 8.6（美國OriginLab 公司）繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 β-谷甾醇及其衍生物的定量分析

在前期研究[13]中，已采用紅外光譜、核磁共振、液質聯用等手段確定了β-谷甾醇己二酸乙烯酯和β-谷甾醇己二酸單酯的化學結構。各組分的液相色譜圖見圖2。其中，膽固醇、β-谷甾醇、β-谷甾醇己二酸單酯和β-谷甾醇己二酸乙烯酯的保留時間分別為5.5，6.2，6.8，9.2 min。可以看出，所選的液相條件可以有效的分離各組分物質。有文獻指出，保留時間與物質疏水性有關[16]。所以，膽固醇極性較大，β-谷甾醇己二酸單酯和β-谷甾醇的極性相近，β-谷甾醇己二酸乙烯酯的極性最小。為了能夠對各組分進行定量分析，配制了一系列具有濃度梯度的溶液制作標準曲線。水解率及膠束溶解度根據膽固醇含量的標準曲線（y=1.6318x＋8.3474，R2=0.9998）、β-谷甾醇含量的標準曲線（y=1.3711x＋7.2558，R2=0.9990）、β-谷甾醇己二酸單酯含量的標準曲線（y=1.5449x＋7.8429，R2=0.9991）和β-谷甾醇己二酸乙烯酯含量的標準曲線（y=1.6541x＋8.2307，R2=0.9997）來確定。

2.2 脂肪酶和反應溶劑對β-谷甾醇己二酸乙烯酯水解的影響

已知CRL 和正己烷是制備β-谷甾醇己二酸乙烯酯最適宜的生物酶催化劑和反應溶劑[13]。本文考察了4 種商業(yè)脂肪酶和4 種常用反應溶劑對β-谷甾醇己二酸乙烯酯水解的影響。從表1 可以看出，叔丁醇更有利于β-谷甾醇己二酸乙烯酯的水解?？赡艿脑蚴?，只有叔丁醇可以與水互溶，促進了β-谷甾醇己二酸乙烯酯的水解過程。另外，Lipozyme TL IM 在β-谷甾醇己二酸乙烯酯的水解反應中表現出最高活性。因此，Lipozyme TL IM 和叔丁醇分別為β-谷甾醇己二酸乙烯酯水解的最適生物酶催化劑和溶劑。值得注意的是，水解后在反應體系中未發(fā)現游離植物甾醇的生成，說明植物甾醇C-3 位?；⑽窗l(fā)生水解，可能是因為乙烯酯具有高酯交換活性，在發(fā)生酯交換的過程中會生成乙醛，優(yōu)先水解。

表1 脂肪酶和反應溶劑對β-谷甾醇己二酸乙烯酯水解的影響Table 1 Effect of lipase and solvent on the hydrolysis of β-sitosterol vinyl adipate

2.3 β-谷甾醇及其衍生物的物理特性

為深入研究β-谷甾醇改性前、后物理特性的變化，采用XRD、DSC、PLM 和接觸角對β-谷甾醇及其衍生物的結晶性、潤濕性和微觀形貌進行表征（見圖3 和圖4）。

圖3 β-谷甾醇及其衍生物的XRD 圖譜、DSC 曲線和接觸角Fig.3 XRD pattern，DSC curves and contact angle of β-sitosterol and their derivatives

圖4 β-谷甾醇及其衍生物的PLM 圖像Fig.4 PLM images of β-sitosterol and their derivatives

在XRD 圖譜中，游離β-谷甾醇顯示出一系列與文獻一致的特征衍射峰[17]，其中2θ=15.0°處出現衍射峰，其強度最高且在所有衍射圖譜中不遮蓋，因此選擇此峰來估計β-谷甾醇及其衍生物的結晶度?？梢钥闯?，β-谷甾醇己二酸乙烯酯和β-谷甾醇己二酸單酯依然具有尖峰，表明晶體的存在。而特征峰強度變弱，說明改性后的β-谷甾醇晶體結構發(fā)生變化，結晶度下降。這一結果與文獻[18]一致，植物甾醇酯的結晶度與游離植物甾醇相比較低，這可能是由于植物甾醇經結構修飾后降低了分子間的有序性。

在DSC 曲線中，β-谷甾醇及其衍生物均表現出一個熔點范圍，說明在受熱過程中不存在相態(tài)的轉變。比較β-谷甾醇及其衍生物的熱行為時，發(fā)現改性后的β-谷甾醇衍生物的熔融溫度顯著降低。結果表明：β-谷甾醇己二酸乙烯酯和β-谷甾醇己二酸單酯的結晶度低于β-谷甾醇，這與XRD 的結果一致。

樣品的潤濕性主要通過接觸角來表征。從圖3 可以看出，β-谷甾醇與水的接觸角為131.4°，屬于超疏水材質。β-谷甾醇己二酸乙烯酯和β-谷甾醇己二酸單酯具有相似的接觸角，并且都低于β-谷甾醇。然而，兩種β-谷甾醇衍生物的接觸角依舊大于90°，說明僅文中改性的效果是有限的，后期可以嘗試繼續(xù)用親水基團對植物甾醇己二酸單酯進行結構修飾。

利用偏振光顯微鏡（PLM）技術進一步表征樣品的結晶。從PLM 圖像中可以看出，β-谷甾醇和β-谷甾醇己二酸乙烯酯具有高結晶度，分散在水中時，呈板狀晶體，與文獻[19]一致。值得注意的是，β-谷甾醇己二酸單酯的小晶體聚集或靜電附著在大晶體的表面，且表面存在明顯缺陷，邊緣出現虛化。結果表明，β-谷甾醇己二酸單酯在水相體系下的結晶度下降，可能是由于其化學結構中存在的端羧基與水分子相互作用，形成氫鍵，促進水合作用而形成低晶基質。

2.4 體外降膽固醇的可能作用機制

植物甾醇經結構修飾后，結晶度和潤濕性等物理特性的改變，可能會影響其生物利用率和降膽固醇活性。多項研究表明，降低血漿膽固醇水平的作用機制主要包括兩個方面：（1）抑制腸道膽固醇吸收；（2）影響膽固醇代謝的基因表達。He 等[20]已在高脂動物模型中發(fā)現，植物甾醇琥珀酸單酯通過影響調控膽固醇穩(wěn)態(tài)相關基因的表達降低膽固醇水平。抑制腸道膽固醇吸收是降低血液膽固醇水平的前瞻性靶點。由于膽固醇是通過摻入膽鹽膠束而被吸收的，考察膽鹽膠束中膽固醇的溶解度常被用作評估物質降膽固醇活性的指標。因此，本文利用膽固醇模型膠束，重點探究β-谷甾醇及其衍生物體外降膽固醇的可能作用機制。

如表2 所示，膽固醇在單一膠束相中的初始溶解度為（2.145±0.001）mmol/L。β-谷甾醇及其衍生物加入模型膠束后構成二元混合膠束體系，且在一定程度上降低膽固醇的膠束溶解度。與預期結果一致，β-谷甾醇具有顯著的降膽固醇活性。β-谷甾醇的降膽固醇活性為（16.72±1.51）%，略高于Jia 等[21]的試驗結果。β-谷甾醇己二酸乙烯酯的降膽固醇活性最低。Brown 等[22]觀察到一致的現象：完整的植物甾醇脂肪酸酯不能溶解到膽鹽膠束中，不能改變膽固醇的膠束溶解度。β-谷甾醇己二酸單酯的降膽固醇活性為（14.29±0.81）%，證明其對混合膠束中膽固醇的溶解具有抑制作用。值得注意的是，β-谷甾醇和β-谷甾醇己二酸乙烯酯在二元混合膠束體系中的溶解度小于0.1 mmol/L，而β-谷甾醇二酸單酯在混合膠束中具有良好的溶解度（超過1.7 mmol/L）。摻入胃腸道膽鹽混合膠束的部分與生物利用率有關[23]。β-谷甾醇二酸單酯的結晶度降低和潤濕性增強，有利于其摻入混合膠束，提高其生物利用率。猜測β-谷甾醇二酸單酯進入混合膠束后，可能會引起膠束疏水核膨脹，膠粒尺寸增大，導致混合膠束沉淀，從而降低膽固醇的膠束溶解度。為了驗證猜測，利用DLS 和TEM對混合膠束微觀形貌進行表征。DLS 顯示無論單一體系還是混合體系，膠束相的平均粒徑在110～140 nm 之間，與TEM 觀察到的結果（圖5a～5d）一致，說明試驗過程采取的分離膠束相和沉淀相的方法比較穩(wěn)定?；旌夏z束的微觀形態(tài)近似球形，與文獻中顯示的TEM 圖像相似[24]。如圖5e～5f 所示，β-谷甾醇與膽固醇的混合體系的沉淀相呈類似于β-谷甾醇的板狀。Zeng 等[25]報道，β-谷甾醇可與膽固醇共結晶，形成不溶性混合晶體，減少膽固醇在小腸中的吸收。這一結果可以解釋為什么β-谷甾醇與膽固醇形成的二元混合體系的膠束相尺寸最小。此外，觀察到添加β-谷甾醇己二酸乙烯酯和β-谷甾醇己二酸單酯獲得的二元混合體系沉淀相的微觀形態(tài)與單一體系沉淀相的微觀形態(tài)相似，而膠粒尺寸急劇膨脹（圖5g～5h）。結果表明，β-谷甾醇己二酸單酯由于加入到混合膠束中，擴大膠束疏水核尺寸，導致混合膠束沉淀，降低了膠束中膽固醇水平。雖然β-谷甾醇己二酸乙烯酯同樣擴大了混合膠束的尺寸，但它沒有較強的膠束摻入能力，對混合膠束的沉淀作用較弱，因此幾乎不影響膽固醇在膠束相中的溶解度。

表2 單一和混合體系中各組分參數Table 2 Parameters of each component in single and binary mixed micelles systems

圖5 膠束相和沉淀相的TEM 圖像Fig.5 TEM images of micellar phase and precipitation phase

3 結論

采用生物酶促水解制備β-谷甾醇己二酸單酯，條件溫和，產品易于分離純化，水解率達到99%以上。XRD、DSC、PLM 和接觸角的測定結果表明，與β-谷甾醇相比，β-谷甾醇己二酸單酯的結晶度降低和潤濕性增強（接觸角從131.4°降至98.6°）。膽固醇模型膠束的結果表明，β-谷甾醇己二酸單酯具有一定的降膽固醇潛力，可能的作用機制是由于其物理特性的改變，增強其摻入膠束的能力，引起膠束疏水核的膨脹，膠粒尺寸增大，導致模型膠束沉淀，從而降低膽固醇的膠束溶解度。植物甾醇二元酸單酯的優(yōu)良性能表明其在食品工業(yè)中具有一定的應用前景。