朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒 RT-LAMP 快速檢測體系的建立

趙正婷　蓋曉彤　張俊蕾　夏振遠　姜寧　劉雅婷

摘要：為快速檢測朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（hippeastrum chlorotic ringspot virus， HCRV），根據(jù) HCRV 的核殼體（N ）蛋白基因保守核苷酸序列，設(shè)計了5組引物進行篩選，并采用單一變量法對 RT-LAMP 體系反應(yīng)溫度、時間、甜菜堿濃度、 dNTPs 濃度、Mg2+濃度、內(nèi)外引物濃度比等進行逐一優(yōu)化，建立了 HCRV 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（RT-LAMP ）檢測體系。結(jié)果表明，最佳引物組為 P1，最適反應(yīng)溫度為64℃ ， Betaine 、dNTPs 、Mg2+的最佳終濃度分別為0.8、0.2、6 mmol/L，最佳內(nèi)外引物濃度比為5∶1，最佳反應(yīng)時間50 min 。檢測結(jié)果顯示優(yōu)化后的 RT-LAMP 經(jīng) SYBR Green I 染色可通過肉眼直接判斷結(jié)果，具有高度特異性，且靈敏度是常規(guī) RT-PCR 的100倍。本研究為 HCRV 的檢測提供了一種便捷、高效、可靠的方法。

關(guān)鍵詞：朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒； RT-LAMP ；特異性；靈敏度

中圖分類號： S435.72???????? 文獻標(biāo)識碼： A???????? 文章編號：1007-5119（2023）03-0039-08

Development of an RT-LAMP Assay for Rapid Detection of hippeastrumchlorotic ringspot virus （HCRV）

ZHAO Zhengting1， GE Xiaotong2， ZHANG Junlei3， XIA Zhenyuan2， JIANG Ning2*， LIU Yating1，4*

（1. College of Agronomy and biotechnology， Yunnan Agriculture University， Kunming 650201， China;2. Yunnan Academy ofTobacco Agricultural Sciences， Kunming 650021， China;3. College of Plant Protection， Yunnan Agriculture University， Kunming650201， China;4. College of Tobacco Science， Yunnan Agriculture University， Kunming 650201， China）

Abstract： In order to quickly detect the hippeastrum chlorotic ringspot virus（HCRV）， five sets of primers were designed and screened according to the conserved nucleotide sequence of the nucleocapsid （N） protein gene of HCRV， and the RT-LAMP system reaction temperature， time， betaine concentration， dNTP concentration， Mg2+ concentration， and concentration ratio of internal and external primers were optimized by single variable method. A detection system of HCRV reverse transcription loop mediated isothermal amplification （RT-LAMP） was established. The results showed that the optimal primer group was P1， the optimal reaction temperature was 64℃， and the optimal final concentrations of Betaine， dNTPs， and Mg2+ were 0.8， 0.2， 6 mmol/L. The optimal concentration ratio of internal and external primers is 5∶1， and the optimal reaction time is 50 minutes. The test results showed that after staining with SYBR Green I， the optimized RT-LAMP can be directly evaluated by naked eyes， with high specificity and sensitivity， 100 times higher than that of conventional RT-PCR. This study provides a convenient， efficient， and reliable method for the detection of HCRV.

Keywords： hippeastrum chlorotic ringspot virus （HCRV）; RT-LAMP; specificity; sensitivity

朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus， HCRV）是2013年首次在云南昆明朱頂紅植株上發(fā)現(xiàn)并報道的布尼亞病毒目（Bunyavirales）番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus）新成員[1]。該病毒在云南、海南等中國南部省份廣泛分布[2]，可導(dǎo)致寄主植株葉片局部褪綠，出現(xiàn)壞死斑，葉片畸形等[3]，嚴重損害作物經(jīng)濟價值[4]。2020年本課題組在對云南省煙草正番茄斑萎病毒屬病毒的調(diào)查中首次發(fā)現(xiàn) HCRV 可單獨或復(fù)合侵染煙草，陽性檢出率高達25%，僅次于番茄斑萎病毒（tomatospotted wilt virus， TSWV），使煙葉出現(xiàn)嚴重的黃化、沿葉脈壞死的癥狀[5]，因其侵染速度快、傳播范圍廣，所以對煙草產(chǎn)業(yè)危害潛力極大，目前尚無有效的防治措施[6，8]。

篩選無毒幼苗是預(yù)防 HCRV 大面積傳播的主要方法之一[9]，但寄主在病毒侵染早期癥狀表現(xiàn)不明顯，給病害防治帶來諸多困難。目前 HCRV 的檢測方法主要包括電子顯微鏡檢測[10]、血清學(xué)檢測[11]、分子生物學(xué)檢測[12]。電子顯微鏡檢測需要專業(yè)設(shè)備，且樣品制備耗時長，操作繁瑣，難以滿足生產(chǎn)上快速、高效、準(zhǔn)確檢測病原的要求[13]；酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）檢測需要制備高質(zhì)量的病毒血清和特異性抗體，檢測時間較長[14]；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction ，PCR）檢測要求大量儀器設(shè)備，對試驗操作要求嚴格[15]，這些缺點大大限制了這些檢測方法在實際生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。因此，亟需開發(fā)一種靈敏度更高、特異性更強的檢測方法。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年日本學(xué)者Notomi等[16]發(fā)明的重要檢測技術(shù)，針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計6條特異引物，在恒溫條件利用 DNA 鏈置換聚合酶（Bst DNA polymerase）即可完成靶基因的擴增，加入熒光染料可直接觀察結(jié)果，具有檢測速度快，靈敏度高，不需要專業(yè)設(shè)備的優(yōu)點[17-18]，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品等[19-21]各種領(lǐng)域。

核殼體（N）蛋白是番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）中最保守的蛋白，N 基因序列是番茄斑萎病毒屬不同病毒的主要分類依據(jù)[22]，因此多數(shù)番茄斑萎病毒屬病毒檢測技術(shù)都是基于 N 基因開發(fā)[23-24]。目前還沒有 LAMP 應(yīng)用于 HCRV 的報道，本研究基于 N 基因設(shè)計引物，對反應(yīng)體系進行逐一優(yōu)化，并通過特異性、靈敏性及實驗室接種樣品檢測等對其效果進行評估，建立了一種 HCRV 快速高效、特異性好、靈敏度高的 RT-LAMP 快速檢測技術(shù)，為 HCRV 早期快速診斷和防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒樣品

本研究中使用的朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（HCRV）、煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus， TMV）、馬鈴薯 Y 病毒（potato virus Y， PVY）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus， TSWV）、番茄環(huán)紋斑點病毒（tomato zonate spot virus， TZSV）、南美紅辣椒脈斑駁病毒（chilliveinal mottle virus， ChiVMV）、番茄褐色皺紋果病毒（tomato brown rugose fruit virus， ToBRFV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus， CMV）、煙草脈帶花葉病毒（tobacco vein banding mosaic virus， TVBMV）等，均由本課題組純化保存后接種于本氏煙，樣本經(jīng) RT-PCR 檢測確認含有單一病毒后，儲存在–80℃冰箱。選擇在室溫生長的健康脫毒煙草作為陰性對照（Negative Control ，NC）。

1.2 主要試劑

TRNzol Universal 總RNA 提取試劑購自北京天根公司， MgSO4（100 mmol/L）、WarmStart?通用 LAMP/RT-LAMP 2×預(yù)混液、Bst 2.0 DNA 聚合酶購自美國 New England Biolabs 公司， M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promege公司，甜菜堿 Betaine、熒光指示劑 SYBR GreenⅠ購自北京索萊寶科技有限公司， dNTPs（10 mmol/L）購自上海 CWBIO 公司，HiScript?II 1st strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑購自江蘇Vazyme公司等。

1.3 引物設(shè)計

將 HCRV 的 N 基因保守區(qū)域（GenBank 序列登錄號： JX 833564.1）作為引物設(shè)計的參考序列。通過在線軟件Primer Explorer 5.0（http：//primerexplorer. jp/e/）設(shè)計5組引物，其中 F3和 B3為外引物，F(xiàn)IP（F1c+F2）和 BIP（B1c+B2）為內(nèi)引物，LF 和 LB 為環(huán)引物，所有引物均用 PAGE 法純化，并由生工生物工程（成都）有限公司合成（表1）。

1.4 RNA 提取

參照TRNzol Universal 總 RNA 提取試劑說明書從新鮮葉組織中提取總 RNA。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳測定 RNA 的質(zhì)量， RNA 樣本在–80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RT-PCR 檢測

以總 RNA 為模板，采用PrimeScriptTM II 1st strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進行 cDNA 的合成。 PCR 檢測以等體積 cDNA 為模板， HCRV-F/R 引物進行 cDNA 的 PCR 擴增。得到的 PCR 產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

1.6 RT-LAMP 引物篩選

用設(shè)計出的5組RT-LAMP 引物（表1）對 HCRV 進行擴增，體系如下：參照Bst 2.0 Warm Start? DNA Polymerase 說明書：10×Thermopol Buffer 2.5μL、MgSO4（100 mmol/L）0.5μL、dNTP （10 mmol/L）0.5μL、 Betaine （5 mmol/L）5μL、FIP/BIP Primers（25×）2μL、 F3/B3 Primers（25×）1μL、LoopF/B Primers（25×）1.5μL、Bst 2.0 DNA 聚合酶（8000 U）0.5μL、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（10000 U）0.2μL、Total RNA 1μL、DEPC H2O 補足至總體積25μL。每組引物均設(shè)置一個NC，62℃恒溫擴增60 min，擴增產(chǎn)物加1000×SYBR GreenⅠ 1μL 進行染色，顯示熒光綠為陽性，橙黃色為陰性。取擴增產(chǎn)物4μL 進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，呈現(xiàn)梯狀條帶為陽性，無條帶為陰性。篩選出一組擴增效率高且不出現(xiàn)假陽性的引物。

1.7 RT-LAMP 體系優(yōu)化

為確定最佳擴增條件，采用控制單一變量法，每個條件設(shè)置3次試驗重復(fù)，對 RT-LAMP 體系條件進行逐一全面優(yōu)化。每個變量分別設(shè)置梯度試驗：反應(yīng)溫度58、60、62、64、66、68℃;反應(yīng)時間30、40、50、60、70、80 min；甜菜堿濃度0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol/L；dNTPs 濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L ；Mg2+濃度0、2、4、6、8、10 mmol/L；內(nèi)外引物濃度比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1。每個梯度各設(shè)置一個 NC，反應(yīng)結(jié)束后取擴增產(chǎn)物4μL 進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

1.8 RT-LAMP 與 RT-PCR 靈敏度比較

在最佳反應(yīng)條件下，為了評估 RT-LAMP 與 RT-PCR 的靈敏度，將HCRV 的RNA 稀釋100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍，分別作為 RT-LAMP 和 RT-PCR 的模板，進行靈敏度比較測試。通過 SYBR Green I 染色和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.9 RT-LAMP 特異性檢驗

在最佳反應(yīng)條件下，通過使用9種煙草常見病毒：HCRV、TMV、PVY、TSWV、TZSV、ChiMV、ToBRFV、CMV、TVBMV 的 RNA 作為擴增的模板，分析檢測的交叉反應(yīng)性來評估所建立 RT-LAMP 體系的特異性。通過 SYBR Green I 染色和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測

使用 HCRV-F/R 引物擴增 HCRV 的 RNA（圖1），結(jié)果顯示，擴增出樣品相關(guān) DNA 片段，且無雜帶，電泳檢測結(jié)果與目的片段大小一致（432 bp）。而 NC 并未擴增到目標(biāo)條帶，說明樣品被 HCRV 成功侵染，而 NC 未被 HCRV 侵染，可進行后續(xù)試驗。

2.2 引物篩選

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖2A），第一組引物擴增出明亮條帶且未出現(xiàn)假陽性，第二、四、五組引物擴增出現(xiàn)假陽性，第三組引物未擴增出條帶且 NC 出現(xiàn)假陽性，熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖2B）。所以選定第一組引物為最佳引物以進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.3 反應(yīng)時間優(yōu)化

反應(yīng)時間優(yōu)化結(jié)果表明，用第一組引物擴增時，30 min 開始出現(xiàn)較淡的梯狀條帶，50 min 開始出現(xiàn)明亮的梯狀條帶（圖3A），熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖3B），NC 均未出現(xiàn)假陽性，結(jié)合高效性考慮，選擇最佳反應(yīng)時間為50 min。

2.4 反應(yīng)溫度優(yōu)化

酶的活性在很大程度上受到溫度的限制，因此必須優(yōu)化反應(yīng)溫度。反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果表明，擴增溫度為58～68℃均有梯狀條帶產(chǎn)生，NC 均未出現(xiàn)假陽性。但擴增溫度為58～62℃時梯狀條帶較淡，擴增溫度為64～68℃時梯狀條帶較明亮（圖4A），熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖4B），結(jié)合實用性考慮，選擇最佳反應(yīng)溫度為64℃。

2.5 甜菜堿濃度優(yōu)化

甜菜堿濃度優(yōu)化結(jié)果表明，當(dāng)甜菜堿濃度為0 mmol/L 時幾乎沒有梯狀條帶，0.6～1.2 mmol/L 梯狀條帶亮度逐漸增強，從1.4 mmol/L 開始梯狀條帶亮度減弱， NC 均未出現(xiàn)假陽性（圖5A），熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖5B）。結(jié)合降低檢測成本考慮，選擇最佳甜菜堿濃度0.8 mmol/L。

2.6 dNTPs 濃度優(yōu)化

dNTPs 濃度優(yōu)化結(jié)果表明，dNTPs 濃度為0 mmol/L 時沒有梯狀條帶產(chǎn)生，從0.2～0.6 mmol/L 梯狀條帶較為明亮，0.8 mmol/L 開始梯狀條帶消失。NC 均未出現(xiàn)假陽性（圖6A），熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖6B）。結(jié)合降低檢測成本考慮，選擇最佳 dNTPs 濃度為0.2 mmol/L。

2.7 Mg2+濃度優(yōu)化

Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果表明，Mg2+濃度為0 mmol/L 時沒有梯狀條帶產(chǎn)生，2～8 mmol/L 梯狀條帶亮度逐漸增強，10 mmol/L 開始 NC 出現(xiàn)假陽性（圖7A），熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖7B）。結(jié)合降低檢測成本及避免假陽性考慮，選擇最佳 Mg2+濃度為6 mmol/L。

2.8 內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化

內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化結(jié)果表明，內(nèi)外引物濃度比為1∶1～2∶1時沒有梯狀條帶產(chǎn)生，3∶1～8∶1梯狀條帶亮度逐漸增強， NC 均未出現(xiàn)假陽性（圖8A），熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖8B）。結(jié)合降低檢測成本考慮，選擇最佳內(nèi)外引物濃度比為5∶1。

2.9 靈敏度試驗

靈敏度試驗結(jié)果表明，在1～10-6稀釋的模板下， RT-LAMP 可以擴增出梯狀條帶，隨著稀釋梯度的增加，條帶變?nèi)酰?0-7時梯狀條帶消失，即 RT-LAMP 的檢測限為10-6（圖9A），熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖9B）。而 RT-PCR 在1～10-4稀釋的模板下隨著稀釋梯度的增加，條帶變?nèi)酰?0-5時條帶消失，即 RT-PCR 的檢測限為10-4（圖9C）。因此，本研究建立的 RT-LAMP 檢測體系比傳統(tǒng)的 RT-PCR 方法靈敏100倍。

2.10 特異性檢測

特異性檢測結(jié)果表明，該 RT-LAMP 體系從 HCRV 中擴增出梯狀條帶，而在其他病毒（TMV、PVY、TSWV、TZSV、ChiVMV、ToBRFV、CMV、TVBMV）及 NC 中，未擴增出條帶（圖10A），熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖10B）。表明建立的 RT-LAMP 體系具有良好的特異性。

3 討論

本研究基于HCRV 的N 基因序列設(shè)計了5組引物，依次對反應(yīng)條件及試劑濃度進行了優(yōu)化，采用傳統(tǒng) RT-PCR 檢測方法進行平行比對驗證，確立了 HCRV 的 RT-LAMP 檢測體系，將 RT-LAMP 首次應(yīng)用于 HCRV 的檢測。

不同病原體 RT-LAMP 檢測的引物、各組分濃度、最佳條件和靈敏度大不相同[25-26]。高彥萍等[27]報道引物、Mg2+濃度和 dNTPs 濃度對馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf froll virus， PLRV）的 RT-LAMP 檢測體系影響較明顯。本研究結(jié)果表明，內(nèi)外引物濃度比、Mg2+濃度和 dNTPs 濃度對 HCRV 的 RT-LAMP 檢測體系影響同樣較為明顯；本研究利用 SYBR Green I 建立的 HCRV 熒光可視化RT-LAMP 檢測體系可以檢測到稀釋10-6倍的 HCRV 基因組 DNA ，檢測靈敏度比高雪等[5]建立的 RT-PCR 提高了100倍。 RT-LAMP 檢測技術(shù)最大的問題就是假陽性，與其他 RT-LAMP 應(yīng)用研究相比，本研究各條件的優(yōu)化試驗在執(zhí)行嚴格的工作分區(qū)以及避免氣溶膠污染的同時每個濃度均設(shè)置 NC，以重點探討除氣溶膠污染外導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)的原因。結(jié)果表明在該體系中只有 Mg2+濃度的變化會引發(fā)假陽性出現(xiàn)，結(jié)合 RT-LAMP 在新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）檢測中降低 Mg2+濃度可消減假陽性的報道[28]，推測在 RT-LAMP 體系中引物較穩(wěn)定的情況下， Mg2+濃度與假陽性的產(chǎn)生關(guān)聯(lián)最強，但還需進一步驗證。

在實驗室接種 HCRV 的本氏煙樣品檢測中，本研究建立的 HCRV RT-LAMP 檢測體系所得結(jié)果與傳統(tǒng) RT-PCR 方法檢測結(jié)果一致，且 RT-LAMP 檢測64℃恒溫擴增50 min 即可通過肉眼觀察直接判斷結(jié)果，較 RT-PCR 簡單，可滿足科研和基層單位及簡陋現(xiàn)場對該病毒檢測的需要，對于生產(chǎn)上快速地診斷和防治 HCRV 具有重要應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

本研究建立了 HCRV RT-LAMP 檢測體系，可快速準(zhǔn)確地從感病煙葉中檢測出 HCRV，為 HCRV 早期快速診斷和防控提供技術(shù)支持。下一步研究可以考慮將 RNA 粗提取與 RT-LAMP 相結(jié)合，建立一步法 RT-LAMP 檢測體系，進一步提高檢測效率。

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