煙草種子萌發(fā)過(guò)程低溫響應(yīng)相關(guān)蛋白與多肽研究

索文龍　王國(guó)平　牛永志　李元君　許杰　喬雨　鄭昀曄

摘要：為探究煙草種子萌發(fā)過(guò)程對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)，對(duì)萌發(fā)1 d 、2 d 和3 d 的種子分別進(jìn)行2 d 低溫處理（LT1、LT2和 LT3），分析不同萌發(fā)時(shí)期種子遇到低溫的蛋白與多肽變化，分別以萌發(fā)2 d、3 d 和4 d 的種子為對(duì)照（GS2、GS3和 GS4），形成3個(gè)組合 GS2 vs LT1、GS3 vs LT2和 GS4 vs LT3。結(jié)果顯示， GS2 vs LT1、GS3 vs LT2和 GS4 vs LT3的差異多肽集合的交集共計(jì)20個(gè)多肽， GO 和 KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)組合的差異蛋白均與碳代謝、氨基酸生物合成相關(guān)；此外鑒定到8個(gè)參與到低溫應(yīng)答的多肽，其中 Nitab4.5_0002257g0090多肽在3個(gè)組合中同時(shí)被鑒定到，可能在低溫應(yīng)答過(guò)程中存在重要的功能。本研究為后續(xù)挖掘多肽在低溫應(yīng)答過(guò)程的功能提供了研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：煙草種子；低溫；蛋白；多肽

中圖分類號(hào)： S572.01???????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A???????? 文章編號(hào)：1007-5119（2023）03-0031-08

Study on Differentially Expressed Proteins and Polypeptides in Response to Low Temperature Stress during Tobacco Seed Germination

SUO Wenlong， WANG Guoping， NIU Yongzhi， LI Yuanjun， XU Jie， QIAO Yu， ZHENG Yunye*

（Yuxi Zhongyan Tobacco Seed Co.， Ltd， Yuxi， Yunnan 653100， China）

Abstract： To investigate the response of tobacco seed germination process to low temperature stress， the seeds germinated for 1， 2 and 3 days were treated with low temperature for 2 days （samples were named LT1， LT2 and LT3 respectively）， and the changes of proteins and polypeptides in seeds exposed to low temperature at different stages of germination were analyzed. The seeds germinated for 2， 3 and 4 days were used as control （samples were named GS2， GS3 and GS4 respectively）， forming three combinations of treatment GS2 vs LT1， GS3 vs LT2 and GS4 vs LT3. The results showed that the intersection of differentially expressed protein of GS2 vs. LT1， GS3 vs. LT2 and GS4 vs. LT3 had a total of 20 polypeptides. The results of GO and KEGG enrichment analysis indicated that the differential polypeptides of the three combinations were related to carbon metabolism and amino acid biosynthesis. In addition， eight peptides were identified to be involved in low temperature response， and the peptide Nitab4.5_0002257g0090 was identified in three combinations at the same time， suggesting that it may have an important function in low temperature response. This study revealed the responsiveness of tobacco seeds to low temperature signaling pathways， and provided a data basis for the subsequent mining of peptides in the low temperature response process.

Keywords： tobacco seeds; low temperature; protein; peptipide

煙草（Nicotiana tabacum）是一種特殊的經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)我國(guó)的國(guó)民經(jīng)濟(jì)起到重要作用。目前，我國(guó)大部分煙葉產(chǎn)區(qū)在育苗過(guò)程中經(jīng)常遇到低溫，對(duì)煙草種子正常萌發(fā)造成不利影響，從而影響育苗進(jìn)程和育苗質(zhì)量。研究煙草種子萌發(fā)期間對(duì)低溫應(yīng)答相關(guān)機(jī)制對(duì)調(diào)控種子萌發(fā)具有重要意義。

蛋白質(zhì)差異表達(dá)是生物體自身基因表達(dá)模式在多變的環(huán)境條件下的綜合體現(xiàn)，有助于人們更全面地了解低溫脅迫的傷害機(jī)制和植物的適應(yīng)機(jī)理[1]。目前關(guān)于植物低溫脅迫的蛋白質(zhì)應(yīng)答研究較多，在番茄、馬鈴薯、小麥、玉米等有相關(guān)報(bào)道[2-5]，關(guān)于種子萌發(fā)過(guò)程中蛋白質(zhì)的變化在大豆、燕麥、水稻、小麥、玉米等[1，6-9]也有相關(guān)研究報(bào)道。煙草種子蛋白質(zhì)的研究主要集中在種子成熟過(guò)程[10]以及不同類型煙草種子蛋白比較[11]，而關(guān)于低溫脅迫對(duì)煙草種子萌發(fā)過(guò)程中蛋白質(zhì)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

植物多肽分子是植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要媒介，具有廣泛的生物學(xué)功能，近年來(lái)隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，多肽分子鑒定與功能分析技術(shù)逐步成熟，多肽分子鑒定與功能研究成為熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)多肽分子廣泛參與植物細(xì)胞的增殖、花粉調(diào)控、氣孔調(diào)控、根系發(fā)育、抵御病蟲(chóng)害等生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)性調(diào)控過(guò)程[12-16]，而參與煙草種子萌發(fā)過(guò)程低溫響應(yīng)的多肽分子尚未見(jiàn)研究報(bào)道。

本研究通過(guò)分析低溫脅迫下煙草種子萌發(fā)過(guò)程中差異蛋白和多肽，以期篩選潛在的煙草種子萌發(fā)過(guò)程響應(yīng)低溫的多肽分子，為后續(xù)研究相關(guān)多肽在低溫響應(yīng)中的功能及多肽產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)，為解決低溫天氣對(duì)煙草種子萌發(fā)影響提供有效方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)材料為煙草品種 K326，由玉溪中煙種子有限責(zé)任公司提供。

將煙草種子均勻播撒到墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，放置于人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行萌發(fā)。本研究對(duì)25℃萌發(fā)1、2和3 d 的種子分別再進(jìn)行8℃、2 d 的低溫處理，樣品命名為 LT1、LT2和 LT3；對(duì)照按照生長(zhǎng)狀態(tài)一致的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行取樣，分別為25℃下萌發(fā)2、3和4 d 的樣品，命名為 GS2、GS3和 GS4。最后形成3個(gè)組合 GS2 vs LT1、GS3 vs LT2和 GS4 vs LT3。將萌發(fā)不同天數(shù)的種子樣品保存于?80℃冰箱備用。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗氧化酶活性測(cè)定稱取0.05 g 樣品，利用試劑盒（分光光度法，北京索萊寶科技有限公司）測(cè)定不同樣品種子的過(guò)氧化氫酶（CAT）活性。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取與制備向樣品中加入裂解液[1%十二烷基硫酸鈉，8 mol/L 尿素，1×蛋白酶抑制劑混合物（Roche Ltd. Basel， Switzerland）]，振蕩研磨3×400 s ，冰上裂解30 min。高速離心15 min （15000 r/min，4℃）后取上清。采用10 K 超濾管（Millipore， Billerica）于4℃下8000 g 離心30 min 去除高分子量的蛋白。收集流穿液，流穿液用離心濃縮儀濃縮抽干，用100 mmol/L 三乙胺-碳酸緩沖液復(fù)溶。采用 C18除鹽柱除鹽后，肽段洗脫液真空抽干，?80℃保存。

1.2.3 多肽檢測(cè)將?80 ℃凍存的樣品用 LC-MS/MS 進(jìn)行分析。 LC-MS/MS 為串聯(lián) EASY-nanoLC 1000的 Orbitrap Fusion Lumos 質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific， MA， USA），配備在線納噴離子源。上樣量5μL，分析柱 Acclaim PepMap C18，75μm×25 cm，柱流量400 nL/min，柱溫55℃ ， 電噴霧電壓2 kV，色譜梯度如下：流動(dòng)相 A 相，0.1%甲酸水溶液； B 相，含0.1%甲酸的 ACN 溶液；以120 min 的梯度分離樣品，柱流量控制在400 nL/min，柱溫為55℃ ， 梯度從4%的B 相起始，在110 min 以非線性梯度升高到60%，8 min 內(nèi)升高到100%，維持8 min。

質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)依賴采集模式下運(yùn)行，自動(dòng)在 MS 和 MS/MS 采集間切換。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：

（1）MS：掃描范圍（m/z）=200～1500，分辨率=120000，AGC target=4e5，最大注入時(shí)間=50 ms，掃描電荷=1～7。（2）HCD-MS/MS（top 10）：分辨率=15000，隔離窗口 m/z=3，AGC target=5e4，最大注入時(shí)間=35 ms，碰撞能量=35，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間=30 s。

1.2.4 多肽組樣本搜庫(kù)完成質(zhì)譜分析后，串聯(lián)質(zhì)譜的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò) PEAKS Studio version X+（Bioinformatics Solutions Inc.， Waterloo， Canada） 分析。PEAKS DB 對(duì)煙草基因組數(shù)據(jù)來(lái)源的烤煙數(shù)據(jù)庫(kù)搜庫(kù)。設(shè)置非酶切，搜庫(kù)參數(shù)碎片離子質(zhì)量容許誤差為0.02 Da，母離子質(zhì)量容許誤差為7×10-6 Da，可變修飾： Oxidation （M）15.99，Acetylation （Protein N-term）42.01。肽段經(jīng)過(guò)1% FDR 質(zhì)控過(guò)濾。

通過(guò)1% FDR 質(zhì)控過(guò)濾的肽段的非標(biāo)計(jì)定量通過(guò) PEAKS Studio version X+完成。首先，軟件分別識(shí)別各樣本中肽段母離子的峰面積即肽段的相對(duì)豐度，然后采用高性能的保留時(shí)間對(duì)齊算法對(duì)來(lái)源于不同樣本的相同肽段進(jìn)行對(duì)齊。采用樣本的總離子流（TIC）進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，樣本中各肽段的豐度由原始豐度除以歸一化系數(shù)獲得。

1.2.5 多肽數(shù)據(jù)初步分析獲得的多肽原始數(shù)據(jù)使用 PEAKS 鑒定，鑒定的最小肽段長(zhǎng)度為7，在譜圖水平接近1% FDR 時(shí)曲線平滑上升，且鑒定的肽譜匹配數(shù)值合理，表明該次鑒定結(jié)果可信且數(shù)量理想。

使用 PEAKS 提取肽段峰強(qiáng)度、峰面積、液相色譜保留時(shí)間等信息用以計(jì)算多肽定量值，定量使用 PEAKS 默認(rèn)參數(shù)。接著使用總和歸一化方法對(duì)不同重復(fù)間蛋白的定量值進(jìn)行歸一化處理。

1.2.6 GO 和 KEGG 富集分析 GO 富集分析以及 KEGG 注釋使用以下 R 包：clusterProfiler[14]（用于富集分析）、topGO（用于繪制 GO 富集圖片）、

AnnotationHub[15]（用于下載數(shù)據(jù)庫(kù)）、BioFileCache（依賴包）、dbplyr（依賴包）、pathview（用于分析 KEGG pathway）。采用的煙草數(shù)據(jù)庫(kù)為烤煙 v1.0 Edwards 2017 BLAST （ https：//solgenomics.net/ organism/Nicotiana_tabacum/genome），分析過(guò)程所使用的數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)為 AH93857。信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析采用 signal IP4.1（ https：//services.healthtech.dtu.dk/ service.php？SignalP-4.1）。

2 結(jié)果

2.1 低溫脅迫后的 CAT 活性

按照生長(zhǎng)狀態(tài)一致的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行取樣，對(duì)不同樣品的抗氧化酶活性進(jìn)行分析[17]。從圖1可知，由于低溫脅迫時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)種子萌發(fā)速度影響較大，處理 LT1與對(duì)照 GS2相比（GS2 vs LT1），經(jīng)過(guò)低溫8℃處理后，LT1的過(guò)氧化氫酶活性顯著高于 GS2，處理 LT1過(guò)氧化氫酶活性為21295.62 U/g，GS2處理為10733.12 U/g；同樣，處理 LT2、LT3的過(guò)氧化氫酶活性也顯著高于對(duì)照 GS3、GS4。說(shuō)明處理和對(duì)照樣品存在表型差異，可用于后續(xù)分析。

2.2 低溫脅迫后的差異多肽分析

為了分析種子萌發(fā)過(guò)程低溫脅迫處理后的差異多肽，采用10 kDa超濾管除去高分子蛋白，并將低分子蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。鑒定的差異多肽數(shù)量如圖2A 所示，GS2 vs. LT1鑒定到243個(gè)上調(diào)表達(dá)，529個(gè)下調(diào)表達(dá)； GS3 vs. LT2鑒定到685個(gè)上調(diào)表達(dá)，221個(gè)下調(diào)表達(dá)； GS4 vs. LT3鑒定到183個(gè)上調(diào)表達(dá)，320個(gè)下調(diào)表達(dá)。3個(gè)組合差異多肽集合的交集共計(jì)20個(gè)，其中 GS2 vs. LT1與 GS3 vs. LT2組差異多肽共計(jì)189個(gè)，GS2 vs. LT1與 GS4 vs. LT3組差異多肽共計(jì)91個(gè)， GS3 vs. LT2與 GS4 vs. LT3組差異多肽共計(jì)85個(gè)（圖2B）；各組差異多肽火山圖和聚類分析圖見(jiàn)圖3。

2.3 差異多肽所屬蛋白的 GO 和 KEGG 富集分析

GS2 vs. LT1差異多肽所屬蛋白GO 富集分析表明：在細(xì)胞組分方面主要富集在核、蛋白核酸復(fù)合物和核小體等（圖4A）；在分子功能方面主要富集在順式還原酮加雙氧酶、氧化還原酶活性、加雙氧酶活性和過(guò)氧化物酶活性、抗氧化劑活性等（圖4B）；在生物過(guò)程方面主要富集在單細(xì)胞到多細(xì)胞生物過(guò)程、多細(xì)胞生物發(fā)育及多細(xì)胞生物過(guò)程、系統(tǒng)發(fā)育、生殖發(fā)育、種子發(fā)育和對(duì)刺激的響應(yīng)等（圖4C）。 KEGG 主要富集到次生代謝物生物合成、代謝途徑、碳代謝、氨基酸生物合成等過(guò)程（圖4D）。

GS3 vs. LT2差異多肽所屬蛋白的GO 富集分析表明，在細(xì)胞組分方面主要富集在高爾基體、內(nèi)膜系統(tǒng)、胞外區(qū)等（圖5A）；在分子功能方面主要富集在異構(gòu)酶活性、抗氧化劑活性、翻譯延伸因子活性、順?lè)串悩?gòu)酶活性等（圖5B）；在生物過(guò)程方面主要富集在生殖結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育、參與生殖的發(fā)育過(guò)程、己糖代謝過(guò)程、胚發(fā)育等（圖5C）； KEGG 主要富集到次生代謝物生物合成、核糖體、碳代謝、光合生物中的碳固定、氨基酸生物合成過(guò)程（圖5D）。

GS4 vs. LT3差異多肽所屬蛋白的GO 富集分析表明：在細(xì)胞組分方面主要富集在線粒體內(nèi)膜、細(xì)胞器內(nèi)膜、細(xì)胞器被膜、線粒體被膜、線粒體膜、線粒體等（圖6A）；在分子功能方面主要富集在小分子結(jié)合、氧化還原酶活性、輔酶Ⅰ活性等（圖6B）；在生物過(guò)程方面主要富集在 ATP 代謝過(guò)程、核苷三磷酸代謝過(guò)程、嘌呤核苷三磷酸代謝過(guò)程等（圖6C）。 KEGG 主要富集到代謝途徑、碳代謝、氨基酸生物合成等過(guò)程（圖6D）。

綜合 GS2 vs. LT1、GS3 vs. LT2和 GS4 vs. LT3的 GO 和 KEGG 富集結(jié)果，發(fā)現(xiàn)3個(gè)組合的差異多肽所屬蛋白均參與碳代謝、氨基酸生物合成等，同樣也發(fā)現(xiàn)不同萌發(fā)時(shí)間所富集的蛋白參與的信號(hào)途徑具有一定的差異性。

2.4 低溫脅迫后的目標(biāo)多肽鑒定

為挖掘煙草種子萌發(fā)過(guò)程中對(duì)低溫應(yīng)答起關(guān)鍵功能的多肽分子，對(duì)所匹配的蛋白進(jìn)行篩選，選擇的蛋白條件為：前體蛋白大小不超過(guò)250個(gè)氨基酸，具有 N 端信號(hào)肽。篩選結(jié)果顯示，GS2 vs. LT1中聯(lián)合鑒定到4 個(gè)多肽分子： Nitab4.5_0002257g0090、Nitab4.5_0000477g0210、 Nitab4.5_0011894g0010和 Nitab4.5_0002172g0040； GS3 vs. LT2 中聯(lián)合鑒定到4 個(gè)多肽分子Nitab4.5_0002257g0090、Nitab4.5_0003998g0060、 Nitab4.5_0000077g0160和 Nitab4.5_0003931g0030； GS4 vs. LT3種子中聯(lián)合鑒定到3個(gè)多肽分子 Nitab4.5_0002257g0090、Nitab4.5_0011894g0010和 Nitab4.5_0002046g0190（表1）。其中有1個(gè)多肽分子 Nitab4.5_0002257g0090在3個(gè)組合中同時(shí)被鑒定到，有1個(gè)多肽分子 Nitab4.5_0011894g0010在 GS2 vs. LT1和 GS4 vs. LT3都被鑒定到。

3 討論

種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)的基礎(chǔ)。種子萌發(fā)時(shí)蛋白質(zhì)的變化反映了植物基因組第一次被激活基因的表達(dá)情況[18]。蛋白質(zhì)差異表達(dá)是復(fù)雜的生命活動(dòng)中生物體繁復(fù)的基因表達(dá)模式及多變的環(huán)境條件的綜合體現(xiàn)，因此，從蛋白質(zhì)入手有助于更全面地了解低溫脅迫的傷害機(jī)制和植物的適應(yīng)機(jī)理。本研究對(duì)受到低溫脅迫的 K326煙草種子萌發(fā)期間的蛋白和多肽的變化進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。在 GO 和 KEGG 分析中發(fā)現(xiàn)3個(gè)組合的差異蛋白均參與碳代謝、氨基酸生物合成。

本研究使用10 kDa超濾管去除較大的蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步通過(guò)信號(hào)肽和序列長(zhǎng)度篩選多肽分子，總共鑒定到8個(gè)多肽分子，其中多肽 Nitab4.5_ 0000477g0210（KTI5）參與防御反應(yīng)[19]，Nitab4.5_ 0011894g0010（AGP30）參與根系發(fā)育調(diào)控、種子休眠過(guò)程的調(diào)控[20]，Nitab4.5_0000077g0160（RNS2）參與 rRNA 分解代謝、RNA 分解代謝過(guò)程和自噬的負(fù)調(diào)節(jié)[21-22]，Nitab4.5_0003931g0030（ CYP20-1）參與根發(fā)育[23]，Nitab4.5_0002046g0190（ACP1）參與蛋白質(zhì)去磷酸化，這些過(guò)程均與植物對(duì)低溫逆境響應(yīng)有關(guān)；類似驅(qū)動(dòng)蛋白（KP1）、電壓依賴陰離子通道蛋白3（VDAC3）、冷休克蛋白（CSP1和 CSP2）也參與植物對(duì)低溫逆境響應(yīng)[24-25]。多肽 Nitab4.5_0002257g0090在3個(gè)組合中同時(shí)被鑒定到，暗示該多肽可能在 K326種子對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)過(guò)程中扮演重要角色。本研究鑒定到的3個(gè)多肽分子尚未被研究報(bào)道，為后續(xù)研究相關(guān)多肽在煙草種子對(duì)低溫應(yīng)答中的功能提供了基礎(chǔ)。

本研究?jī)H從蛋白和多肽層面分析了一個(gè)品種的煙草種子萌發(fā)期間受到低溫脅迫后的蛋白質(zhì)的變化，有待對(duì)多個(gè)品種的種子從轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組多個(gè)層面系統(tǒng)分析其萌發(fā)期間受到低溫脅迫后的變化，系統(tǒng)解析煙草種子萌發(fā)期間受到低溫脅迫后應(yīng)答機(jī)制。同時(shí)，煙草幼苗受到低溫脅迫后，幼苗葉形、抗氧化酶活性及相關(guān)基因表達(dá)亦將發(fā)生變化[26-29]，有待從多個(gè)層面系統(tǒng)開(kāi)展種子到幼苗對(duì)低溫響應(yīng)研究，不斷完善低溫脅迫后應(yīng)答機(jī)制，為后續(xù)開(kāi)發(fā)提升種子和幼苗活力的增效劑提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究篩選到煙草種子萌發(fā)過(guò)程響應(yīng)低溫脅迫相關(guān)蛋白與多肽。從分子功能層面，GO 富集發(fā)現(xiàn)3個(gè)組合的差異蛋白均參與碳代謝、氨基酸生物合成； KEGG 富集發(fā)現(xiàn)3個(gè)組合的差異蛋白與碳代謝、氨基酸生物合成相關(guān)。鑒定到8個(gè)參與低溫響應(yīng)的多肽，其中多肽 Nitab4.5_0002257g0090在3個(gè)組合中同時(shí)被鑒定到，暗示其可能在低溫響應(yīng)過(guò)程中存在重要功能。

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