基于單細(xì)胞水平的孕二烯酮誘導(dǎo)雌性西部食蚊魚雄性化的研究

馮婷茵，鄧?？?珂

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

【研究意義】動(dòng)物的性別決定機(jī)制有兩種類型，分別是遺傳性別決定型（Genetic sex determination，GSD）和環(huán)境依賴性別決定型（Environment dependent sex determination，ESD）。高等脊椎動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物和鳥類的性別決定機(jī)制屬于遺傳性別決定型［1］，而魚類、兩棲類和爬行類動(dòng)物的性別決定機(jī)制不完全依賴于染色體，環(huán)境溫度、pH 值、激素、行為模式等因素都會(huì)改變和影響個(gè)體的性別分化［2-5］，而且這種影響可以貫穿個(gè)體發(fā)育的全過(guò)程。因此，在很多魚類和爬行類動(dòng)物中都可以觀察到環(huán)境因素誘導(dǎo)的性別逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，魚類的個(gè)體大小、外形、體色等具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的性狀通常與某一特定性別關(guān)聯(lián)。如雄性羅非魚（Oreochromis niloticus）和烏斑雜交鱧（Channa）都比其雌性個(gè)體生長(zhǎng)速度快、體型大，具有更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［6-7］；而大菱鲆（Scophthalmus maximus）雌魚體型比雄魚大50%［8］。西部食蚊魚（Gambusia aff inis）為暖水性的小型硬骨魚類，生活于水庫(kù)、湖泊、壩塘、沼澤、稻田、水渠、洼地等各類靜水水體中。因其嗜食蚊子幼蟲及具有觀賞價(jià)值而被引入我國(guó)，分布于長(zhǎng)江以南諸多省區(qū)［9］。由于食蚊魚具有容易獲得、生長(zhǎng)速度快、繁殖能力強(qiáng)、性別二態(tài)性，且與哺乳動(dòng)物對(duì)化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)方式相似等特點(diǎn)，近年來(lái)食蚊魚被當(dāng)成一種很好的模式生物，廣泛應(yīng)用于進(jìn)化和生態(tài)等研究領(lǐng)域［10-12］。因此，利用食蚊魚研究魚類性別逆轉(zhuǎn)，有助于在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中控制種群性別比例、培養(yǎng)全單性種群，具有重要的科學(xué)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值［13-15］。

【前人研究進(jìn)展】食蚊魚的性別決定染色體為ZW/ZZ 型，但其性別分化同時(shí)受到環(huán)境因素的影響。研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)豬場(chǎng)、紙漿造紙廠和城鎮(zhèn)污水處理廠附近水域中高含量的孕激素使雌性食蚊魚的性腺發(fā)育、生殖交配行為受到損害，并使其出現(xiàn)雄魚的第二性征，進(jìn)而改變?cè)摲N群的雌雄比例［16-17］。深入研究表明由雌性食蚊魚通過(guò)性別逆轉(zhuǎn)產(chǎn)生的偽雄性食蚊魚具有與野生雄性食蚊魚相似的追逐、搖擺、交配等行為［18-19］，但其擺動(dòng)臀鰭的頻率更低。此外，這些偽雄性食蚊魚的生殖足無(wú)法與雌性個(gè)體完全匹配，需要在交配中保持更高的交配頻率。以上研究表明，雌性食蚊魚在環(huán)境中高劑量孕激素的誘導(dǎo)下可發(fā)生性別逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，且其產(chǎn)生的偽雄性個(gè)體獲得了部分生殖行為能力。

【本研究切入點(diǎn)】雖然目前針對(duì)硬骨魚類的性別逆轉(zhuǎn)已有一些研究，但針對(duì)食蚊魚的性別逆轉(zhuǎn)研究鮮有報(bào)道，從單細(xì)胞基因表達(dá)水平探討其性別逆轉(zhuǎn)機(jī)制的研究仍為空白。本研究以養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用的新型孕激素——孕二烯酮（Gestodene，GES）作為外源激素［20］，以西部食蚊魚(以下簡(jiǎn)稱食蚊魚）為研究對(duì)象，從形態(tài)學(xué)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平研究孕二烯酮誘導(dǎo)下雌性食蚊魚雄性化過(guò)程中性腺單細(xì)胞水平基因表達(dá)的變化?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，從單細(xì)胞水平分析孕二烯酮誘導(dǎo)后雌性食蚊魚性腺基因表達(dá)譜的變化，挖掘雌性食蚊魚雄性化的關(guān)鍵基因，初步解析食蚊魚性別逆轉(zhuǎn)的分子機(jī)理，豐富動(dòng)物性腺單細(xì)胞數(shù)據(jù)，為后續(xù)研究提供更多有效的數(shù)據(jù)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2022 年10 月于廣州市花地灣花鳥魚蟲市場(chǎng)購(gòu)買4 月齡左右的西部食蚊魚，轉(zhuǎn)至廣州大學(xué)實(shí)驗(yàn)室水循環(huán) 養(yǎng)殖系統(tǒng)培養(yǎng)馴化，設(shè)置溫度26(±1)℃，光周期14 h∶10h（光照∶黑暗），水體硬度140(±2.5) mg/L，水體導(dǎo)電性20(±0.3)μS/cm，pH 值7.4(±0.5)，溶解氧含量7.4(±0.2)mg/L。經(jīng)過(guò)2 個(gè)月馴化穩(wěn)定后，食蚊魚死亡率小于5%，已性成熟可用于試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)魚的使用和實(shí)驗(yàn)操作符合“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R 原則”［21］。

主要試劑包括孕二烯酮（GES,純度99.4%）購(gòu)自上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司（Sigma-Aldrich）、二甲基亞砜（DMSO,純度99.9%）購(gòu)自上海生工生物工程公司。500 ng/L 孕二烯酮溶液：將24 μL 2 mg/mL 孕二烯酮溶液溶于4 776 μL二甲基亞砜中，取1 250 μL 加進(jìn)25 L 水中。

4 ℃預(yù)冷的400 μg/mL 磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）溶液（含0.04% BSA,無(wú)Ca2+、Mg2+）；30℃預(yù)熱的400 μg/mL 1×HBSS 緩沖液（含0.04%BSA，有Ca2+、Mg2+）；消化酶混合液：1 000 μL 1× HBSS 緩沖液（30℃預(yù)熱）+1 μL DNA 酶Ⅰ（2 000 U/mL）+10 μL 膠原酶Ⅰ（10%）+10 μL膠原酶Ⅱ（10%）+10 μL 膠原酶Ⅳ（10%）+5 μL 透明質(zhì)酸酶（10%）+10 μL 中性蛋白酶（5%）+2 μL 離子緩沖液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)分組與處理 挑選 體長(zhǎng)為3.0（±0.5）cm、體質(zhì)量為130（±50）mg 的成年雌性食蚊魚（6 月齡）和體長(zhǎng)為1.9（±0.6）cm、體質(zhì)量為110（±70）mg 的成年雄性食蚊魚（6 月齡）參與孕二烯酮暴露實(shí)驗(yàn)。設(shè)置雄性和雌性食蚊魚的空白對(duì)照（FC，female control；MC，male control）以及雌性食蚊魚孕二烯酮暴露4 周和8周的處理組（F4，female treated for 4 weeks；F8，female treated for 8 weeks），各組設(shè)3 個(gè)重復(fù)。孕二烯酮處理組為每個(gè)容積12 L 的缸中放置10 條雌性成魚和10 L 孕二烯酮暴露溶液。

1.2.2單細(xì)胞懸液制備 用解剖剪刀由食蚊魚肛門開始沿腹部剪至鰓蓋下緣，再?gòu)膬啥朔謩e向背部解剖，在體視鏡下取出性腺組織，使用 預(yù)冷至4 ℃的1×PBS 洗滌 2～3 次。將組織切成小碎片，然后轉(zhuǎn)移到消化酶混合液中，30 ℃消化30～50 min，每隔3 min 搖1 次，進(jìn)行初步顯微鏡檢查。消化后的細(xì)胞懸液用70 μm 過(guò)濾器過(guò)濾，用2 mL 1× PBS 清洗離心管和細(xì)胞篩。用水平離心機(jī)在4 ℃下以200 g 離心5 min；取上清，加入5 mL 1×PBS 重懸細(xì)胞，再以200 g 離心5 min，洗滌2～3 次；根據(jù)沉淀的量加入預(yù)冷的1×PBS 溶液（沉淀較大加入1 mL，較少則加入0.5 mL，幾乎看不到沉淀則加100 μL），輕輕混勻。利用顯微鏡細(xì)胞計(jì)數(shù)板和0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色液檢測(cè)細(xì)胞濃度和活性并記錄。

1.2.3單細(xì)胞文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 使用10×GenomicsTM微流控芯片，將單細(xì)胞懸液和Chromium Single Cell 3’ Reagent（v3，10×Genomics）試劑盒混合，在油相反應(yīng)體系中形成單細(xì)胞珠狀凝膠液滴［22］。隨后，在53 ℃下反轉(zhuǎn)錄45 min、85 ℃下反應(yīng)5 min 后終止反應(yīng)，制備出測(cè)序所需的cDNA。將cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對(duì)得到的擴(kuò)增cDNA 進(jìn)行片段化、末端修復(fù)和補(bǔ)全polyA 尾巴，添加測(cè)序接頭并進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增，最終制備出單細(xì)胞cDNA文庫(kù)。單細(xì)胞測(cè)序采用10×Genomics Novaseq 6000 測(cè)序平臺(tái)，并用CellRanger（10×GenomicsTM）比對(duì)得到原始測(cè)序數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

使用Seurat［23］進(jìn)行主成分分析（Principle Component Analysis，PCA），選擇適當(dāng)?shù)闹鞒煞诌M(jìn)行下一步非監(jiān)督聚類和UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）分析。根據(jù)單細(xì)胞聚類結(jié)果，在Seurat 中進(jìn)行特征基因篩選，確定每個(gè)細(xì)胞亞群的特征基因，并利用CellKB［24］和Fish Enrichr［25-26］數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定每個(gè)細(xì)胞亞群對(duì)應(yīng)的細(xì)胞類型。

根據(jù)細(xì)胞類型注釋的結(jié)果，選擇相關(guān)的細(xì)胞群進(jìn)行細(xì)胞軌跡分析。使用Monocle［27］將單細(xì)胞數(shù)據(jù)集轉(zhuǎn)換成CDS（Cell dataset object）類型，進(jìn)行預(yù)處理（使用降維函數(shù)將數(shù)據(jù)縮小到較低維 度，reduction_method=“UMAP”，preprocess_method=“Aligned”），嵌入降維數(shù)據(jù)，進(jìn)行擬時(shí)序計(jì)算。在過(guò)濾掉低質(zhì)量數(shù)據(jù)后進(jìn)行細(xì)胞聚類分析，根據(jù)不同的細(xì)胞狀態(tài)分類并進(jìn)行可視化分析。

根據(jù)上述擬時(shí)序計(jì)算和細(xì)胞分化軌跡結(jié)果，找到關(guān)鍵細(xì)胞群的分化節(jié)點(diǎn)，通過(guò)BEAM（Branch Expression Analysis Modeling）分析篩選對(duì)分化節(jié)點(diǎn)最關(guān)鍵的基因［28-29］，并使用cluster Profiler［30］進(jìn)行KEGG 富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 孕二烯酮誘導(dǎo)后的食蚊魚鰭部形態(tài)變化

孕二烯酮誘導(dǎo)后的雌性食蚊魚臀鰭形態(tài)發(fā)生了雄性化的變化。野生雌性食蚊魚的臀鰭為扇形或三角形，而雄性的臀鰭具有特化的生殖足結(jié)構(gòu)。經(jīng)孕二烯酮誘導(dǎo)處理4～8 周后，雌性食蚊魚臀鰭發(fā)生了不同程度的特化現(xiàn)象，呈現(xiàn)出類似于雄性生殖足的結(jié)構(gòu)（圖1）。結(jié)果表明，孕二烯酮在雌性食蚊魚的性別逆轉(zhuǎn)過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用，能夠促進(jìn)其雄性化外部特征的出現(xiàn)。

圖1 孕二烯酮誘導(dǎo)后的食蚊魚鰭部形態(tài)變化Fig.1 Changes in fin morphology of mosquitofish exposed to GES

2.2 孕二烯酮誘導(dǎo)后的食蚊魚性腺細(xì)胞構(gòu)成變化

為進(jìn)一步探究孕二烯酮誘導(dǎo)下雌性食蚊魚雄性化的分子機(jī)制，本研究分別收集MC、FC、F4和F8 組的食蚊魚性腺進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。測(cè)序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)使用CellRanger 軟件進(jìn)行單細(xì)胞基因表達(dá)定量分析；將表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和篩選，剔除低質(zhì)量單細(xì)胞數(shù)據(jù)，最終獲得每個(gè)樣本的單細(xì)胞基因表達(dá)譜。MC、FC、F4 和F8 樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)如表1 所示，單個(gè)樣本有效細(xì)胞數(shù)介于8 982～13 873 之間，檢測(cè)到的有效表達(dá)基因數(shù)目介于19 891～20 250 之間，有效Barcodes 比例均在97%以上，表明數(shù)據(jù)質(zhì)量?jī)?yōu)秀。

表1 食蚊魚性腺單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)概況Table 1 Overview of single-cell sequencing data on gonads of mosquitofish

分析使用Sctransform 對(duì)4 個(gè)樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化并整合，利用UMAP 進(jìn)行降維處理。由圖2B 可見，野生雌性FC 組和孕二烯酮處理后的雌性F4、F8 組細(xì)胞重疊較好，而雄性MC 組的細(xì)胞相對(duì)呈獨(dú)立分布特征，說(shuō)明成年雌性食蚊魚和雄性食蚊魚性腺細(xì)胞構(gòu)成具有較大差異，且經(jīng)孕二烯酮誘導(dǎo)后的雌性性腺細(xì)胞構(gòu)成仍與雄性不同。

圖2 食蚊魚性腺單細(xì)胞UMAP 圖譜Fig.2 Single-cell UMAP diagrams of gonads in mosquitofish

為了確定食蚊魚性腺的具體細(xì)胞構(gòu)成類型和對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)情況，本研究進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類，提取每個(gè)細(xì)胞類群特異高表達(dá)的marker 基因，利用CellKB 和Fish Enrichr 對(duì)細(xì)胞類型進(jìn)行注釋分析。剔除血液細(xì)胞和免疫細(xì)胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)食蚊魚性腺一共包含6 種主要的細(xì)胞類型（圖2A，表2）。不同樣本間比較發(fā)現(xiàn)，雄性食蚊魚性腺主要由成纖維細(xì)胞、雄性生殖細(xì)胞、上皮細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞構(gòu)成，而雌性性腺主要由內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、卵母細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞構(gòu)成。孕二烯酮誘導(dǎo)處理4～8 周后，雌性食蚊魚性腺中產(chǎn)生少量的雄性生殖細(xì)胞（F4 0.79%，F(xiàn)8 0.39%）。此外，誘導(dǎo)8 周后性腺中原始生殖細(xì)胞比例較野生雌性樣本極顯著上升。

表2 食蚊魚性腺單細(xì)胞細(xì)胞類型比例Table 2 Proportion of cell types in gonads of mosquitofish (%)

2.3 原始生殖細(xì)胞的基因表達(dá)與分化

2.3.1原始生殖細(xì)胞的基因表達(dá) 提取來(lái)自FC、F4和F8樣本的原始生殖細(xì)胞進(jìn)行重聚類和分析，并重點(diǎn)分析與性別決定相關(guān)重要基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，來(lái)自FC、F4 和F8 的原始生殖細(xì)胞可以被劃分為9 個(gè)亞類型（圖3）。值得注意的是，不同性別分化的關(guān)鍵基因在不同細(xì)胞類群里出現(xiàn)差異表達(dá)情況。幾個(gè)與 雄性生殖細(xì)胞分化密切相關(guān)的基因（如amh、fabp3、dmrt1、wt1a和wt1b）在cluster1 和cluster3 中高表達(dá)；對(duì)雌性性腺發(fā)育和卵子形成有重要作用的cyp19a1a及fgf16基因則在cluster 0 和cluster 2 中高表達(dá)（圖4）。結(jié)果表明，在孕二烯酮誘導(dǎo)下原始生殖細(xì)胞類群中同時(shí)出現(xiàn)了兩種具有不同性別決定潛能的細(xì)胞。

圖3 原始生殖細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞來(lái)源UMAP 圖譜Fig.3 UMAP diagrams of primordial germ cells state and sources

圖4 原始生殖細(xì)胞性別特征基因表達(dá)圖譜Fig.4 Gene expression profiles of sex characteristics in primordial germ cells

2.3.2原始生殖細(xì)胞的分化 利用單細(xì)胞軌跡分析和擬時(shí)序分析研究原始生殖細(xì)胞的分化過(guò)程以及對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)變化序列，結(jié)果（圖5B）顯示，來(lái)自FC 的樣本主要集中分布在原始生殖細(xì)胞分化軌跡的早期，來(lái)自F4 和F8 的細(xì)胞主要集中分布在分化軌跡的中晚期。孕二烯酮誘導(dǎo)后，原始生殖細(xì)胞出現(xiàn)了兩種截然不同的分化方向。結(jié)合圖4 中性別分化關(guān)鍵基因的表達(dá)情況，推測(cè)部分原始生殖細(xì)胞出現(xiàn)向雄性生殖細(xì)胞分化的趨勢(shì)，而部分細(xì)胞維持向雌性生殖細(xì)胞分化的趨勢(shì)（圖5C）。

圖5 原始生殖細(xì)胞分化軌跡Fig.5 Trajectory analysis of primordial germ cells

基于上述細(xì)胞分化軌跡，通過(guò)BEAM 分析發(fā)現(xiàn)，有2 477 個(gè)基因在兩個(gè)不同的分化方向表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式（圖6A）。對(duì)差異最大的前200 個(gè)基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Toll-like receptor、TGF-beta、Notch 等信號(hào)通路參與了原始生殖細(xì)胞向雄性化逆轉(zhuǎn)的過(guò)程（圖6B）；甘氨酸，絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝等途徑也與該過(guò)程相關(guān)（圖6C）；不飽和脂肪酸、類固醇激素生物合成，醚酯、亞油酸代謝等途徑則對(duì)維持原始生殖細(xì)胞向雌性性腺分化有重要作用（圖6B）。

圖6 原始生殖細(xì)胞BEAM 分析及基因富集分析結(jié)果Fig.6 BEAM analysis of primordial germ cells and enrichment analysis of genes

3 討論

原始生殖細(xì)胞是一類生殖干細(xì)胞，具有向不同性別生殖細(xì)胞分化的潛能，是魚類性別決定和分化過(guò)程中最重要的一類細(xì)胞。其形成方式目前存在兩種學(xué)說(shuō)，第一種是先成論，指受精卵帶有母源生殖質(zhì)，隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行，生殖質(zhì)被不均等地分配，獲得生殖質(zhì)的細(xì)胞將發(fā)育成原始生殖細(xì)胞，否則發(fā)育成體細(xì)胞，如斑馬魚（Danio rerio）、泥 鰍（Misgurnus anguillicaudatus）和大菱鲆等；另一種是后成論，指受精卵早期分裂中的體細(xì)胞與生殖細(xì)胞沒有區(qū)別，但會(huì)因某些細(xì)胞間信號(hào)誘導(dǎo)分化成原始生殖細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物、青鳉(Oryzias latipes)、真鯛（Pagrosomus major）［31-34］。本研究發(fā)現(xiàn)孕二烯酮刺激下，隨著時(shí)間增加，雌性食蚊魚中的原始生殖細(xì)胞數(shù)量不斷上升，推測(cè)食蚊魚原始生殖細(xì)胞形成方式屬于后成論。通過(guò)富集分析發(fā)現(xiàn)Toll-like receptor、TGF-beta、Notch 等信號(hào)通路參加了食蚊魚雄性化的過(guò)程，推測(cè)以上通路也可能誘導(dǎo)原始生殖細(xì)胞生成。

原始生殖細(xì)胞的基因表達(dá)和細(xì)胞數(shù)量都有可能影響魚類的性別決定。在斑馬魚和青鳉的研究中發(fā)現(xiàn)，原始生殖細(xì)胞數(shù)量不足的個(gè)體傾向于發(fā)育為雄魚，而原始生殖細(xì)胞較多的個(gè)體則傾向于發(fā)育為雌魚［35-37］。相比之下，泥鰍的性別決定則與原始生殖細(xì)胞的數(shù)量無(wú)關(guān)［38］。本研究發(fā)現(xiàn)孕二烯酮刺激下雌性食蚊魚出現(xiàn)向雄性化逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，且伴隨原始生殖細(xì)胞數(shù)量顯著上升，這一結(jié)果與在斑馬魚、青鳉和泥鰍中觀察到的情況均不相同。分析其原因可能與不同魚類多樣化的性別決定機(jī)制有關(guān)，且這一結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明原始生殖細(xì)胞數(shù)目是決定魚類性別分化的重要因素之一。

本研究發(fā)現(xiàn)孕二烯酮刺激下有幾個(gè)與魚類性別分化密切相關(guān)的基因（amh、fabp3、dmrt1、wt1a、wt1b、cyp19a1a和fgf16）在原始生殖細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)差異表達(dá)的情況。其中TGFβ超家族成員amh基因是硬骨魚睪丸分化的關(guān)鍵基因。哺乳動(dòng)物中該基因誘導(dǎo)繆勒氏管退化，并阻止雌性生殖管發(fā)育［39］。而在魚類中amh被發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)調(diào)節(jié)cyp11a1、cyp17和cyp19a1a的表達(dá)進(jìn)而影響性腺中的睪酮含量［40］。研究發(fā)現(xiàn)，東部食蚊魚（Gambusia holbrooki）雄性胚胎中amh基因的表達(dá)量是雌性胚胎的25 倍［41］。本研究中amh基因在孕二烯酮誘導(dǎo)后在部分原始生殖細(xì)胞中出現(xiàn)了高表達(dá)的情況，說(shuō)明這部分細(xì)胞可能出現(xiàn)了向雄性化分化的特征。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)amh和cyp19a1a基因具有截然相反的表達(dá)模式，側(cè)面印證了性腺分化過(guò)程中amh基因?qū)yp19a1a的抑制作用。

促卵泡激素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）和促黃體化激素（Luteninzing hormone，LH）通過(guò)與其對(duì)應(yīng)的受體FSHR 和LHCGR 相結(jié)合調(diào)控性腺發(fā)育。fshr和lhcgr基因在青鳉卵巢和睪丸中均具有較高的表達(dá)水平，在睪丸形成過(guò)程中，兩個(gè)基因的表達(dá)均有上調(diào)現(xiàn)象［42］，說(shuō)明這兩個(gè)基因?qū)π坌孕韵俚陌l(fā)育有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在食蚊魚原始生殖細(xì)胞向雄性化分化的過(guò)程中，fshr出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象，但lhcgr則并未出現(xiàn)明顯上調(diào)。由于在卵泡形成過(guò)程中l(wèi)hcgr的表達(dá)相比f(wàn)shr存在一定的滯后現(xiàn)象［43］，推測(cè)這兩個(gè)基因在雄性化過(guò)程中的表達(dá)同樣存在表達(dá)時(shí)間差異的可能。比較野生雌性食蚊魚和孕二烯酮處理后雌性食蚊魚的單細(xì)胞圖譜，本研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的原始生殖細(xì)胞開始出現(xiàn)向雄性化分化的特征，出現(xiàn)極少量的分化后雄性生殖細(xì)胞（精原細(xì)胞），這說(shuō)明誘導(dǎo)后的雌魚已經(jīng)在一定程度上具有雄性食蚊魚的生殖功能，但其生殖能力還遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常的雄性食蚊魚。在本試驗(yàn)所用孕二烯酮?jiǎng)┝肯拢耆男坌曰^(guò)程可能需要更長(zhǎng)的時(shí)間。在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)環(huán)境中孕二烯酮濃度達(dá)到500 ng/L 時(shí)，培養(yǎng)2 個(gè)月后的食蚊魚就開始出現(xiàn)死亡情況，且隨著時(shí)間增加死亡數(shù)目不斷上升，3 個(gè)月時(shí)70%的食蚊魚已經(jīng)死亡。因此，為了確保獲得足夠的樣本進(jìn)行測(cè)序和分析，本研究選擇8 周作為最長(zhǎng)的暴露時(shí)間來(lái)觀察食蚊魚的性別逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。下一步研究將通過(guò)調(diào)節(jié)暴露濃度和延長(zhǎng)暴露時(shí)間進(jìn)一步跟蹤雌性食蚊魚完全雄性化的過(guò)程。

已有多項(xiàng)研究證明雌性食蚊魚暴露在孕激素中會(huì)誘導(dǎo)出與雄魚類似的生殖足，即發(fā)生臀鰭雄性化。雄魚生殖足的形成和發(fā)育主要由類固醇激素決定，特別是雄激素［44-45］。在一些魚類中，雄激素尤其是11-酮睪酮（11KT）可刺激魚鰭的伸長(zhǎng)，而雄激素拮抗劑或雄激素合成抑制劑會(huì)干擾睪丸功能和外生殖器發(fā)育［46］。研究發(fā)現(xiàn)ar、shh、ptc1、cyp19a、er和vtgc等基因都與性別二態(tài)性魚類臀鰭發(fā)育相關(guān)［47-48］，本研究也發(fā)現(xiàn)cyp19a基因存在特異性表達(dá)，與以往研究結(jié)果符合。

單細(xì)胞測(cè)序是一項(xiàng)新興的組學(xué)研究技術(shù)，憑借其高通量的準(zhǔn)確性和特異性，廣泛應(yīng)用于生物的各種生理過(guò)程研究。目前利用單細(xì)胞測(cè)序分析來(lái)研究魚類性別逆轉(zhuǎn)的報(bào)道有半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis），其雌性個(gè)體在發(fā)育早期用高溫誘導(dǎo)可使雌魚的性逆轉(zhuǎn)率達(dá)到73%［49］。利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在未分化的偽雄性精原細(xì)胞中，CaSR基因和MAPK 信號(hào)因子上調(diào)［50］。本研究未發(fā)現(xiàn)該基因和信號(hào)因子上調(diào)，可能原因是不同機(jī)制誘導(dǎo)的性別逆轉(zhuǎn)涉及到的信號(hào)通路不同，以及不同魚類遺傳背景也會(huì)導(dǎo)致性別轉(zhuǎn)變機(jī)制不同。魚類的性別逆轉(zhuǎn)是個(gè)復(fù)雜過(guò)程，仍需要大量的研究來(lái)填補(bǔ)該空白領(lǐng)域。

4 結(jié)論

將雌性食蚊魚置于濃度為500 ng/L 孕二烯酮溶液暴露4～8 周后，發(fā)現(xiàn)雌性食蚊魚臀鰭出現(xiàn)雄性化特征；分別取野生雌性、雄性食蚊魚和暴露4、8 周雌性食蚊魚的性腺進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生雌性食蚊魚和雄性食蚊魚性腺細(xì)胞構(gòu)成明顯不同，暴露4、8 周后的雌性食蚊魚性腺中出現(xiàn)少量的雄性生殖細(xì)胞（精原細(xì)胞），且原始生殖細(xì)胞數(shù)量有明顯上升；在孕二烯酮誘導(dǎo)下雌性食蚊魚原始生殖細(xì)胞中性別決定關(guān)鍵基因amh、fabp3、dmrt1、wt1a、wt1b、cyp19a1a和fgf16出現(xiàn)差異化表達(dá)情況；細(xì)胞軌跡分析表明，部分原始生殖細(xì)胞出現(xiàn)向雄性化分化的特征。Toll-like receptor、TGF-beta、Notch和一些氨基酸代謝信號(hào)通路參與了原始生殖細(xì)胞向雄性化逆轉(zhuǎn)的過(guò)程。