燕麥麩皮枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

張倩芳，李 敏，栗紅瑜，孟晶巖

（山西功能食品研究院，山西 太原 030031）

燕麥，禾本科一年生作物，主要種植于北方冷涼地區(qū)，是一種公認(rèn)的全營養(yǎng)谷物[1]。燕麥不僅含有豐富的膳食纖維、必需氨基酸、不飽和氨基酸，其多酚類抗氧化物質(zhì)含量也十分豐富[2-3]。燕麥的抗氧化活性近年來受到了越來越多的關(guān)注[4]。

固體發(fā)酵作為微生物發(fā)酵技術(shù)的一種，具有操作簡便、酶系豐富、成本低、無污染等優(yōu)點[5]。目前對燕麥的發(fā)酵研究主要集中于改善燕麥的風(fēng)味特性及燕麥活性成分的釋放方面[6-7]。采用枯草芽孢桿菌對燕麥麩皮進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，分析不同發(fā)酵條件對燕麥麩皮多酚含量的影響，并通過正交試驗找到最佳的發(fā)酵工藝，以期為燕麥麩皮抗氧化成分的開發(fā)和利用提供思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

燕麥麩皮，山西華啟順食品科技有限責(zé)任公司提供；枯草芽孢桿菌，南京樂診生物技術(shù)有限公司提供；PBS 緩沖液、ABTS 工作液，上海尚寶生物科技有限公司提供；福林酚、碳酸鈉、沒食子酸，均為分析純。

1.2 儀器

CJ-1D 型凈化工作臺，北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司產(chǎn)品；HY-08 型高速粉碎機(jī)，北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司產(chǎn)品；YX-18HDD 型蒸汽滅菌鍋，江陰濱州醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；303-3B 型恒溫培養(yǎng)箱，天津市通利信達(dá)儀器廠產(chǎn)品；ZXY-48 型恒溫?fù)u床，常州潤華電器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 活化菌種

以2%的接種量將枯草芽孢桿菌菌液接種于LB培養(yǎng)基中，于32 ℃下以轉(zhuǎn)速100 r/min 培養(yǎng)24 h 獲得活化的菌種。

1.3.2 燕麥麩皮發(fā)酵

燕麥麩皮粉碎后過60 目篩，稱取20 g，高壓蒸汽滅菌后，按試驗所需料液比加入活化后的枯草芽孢桿菌混懸液，混合均勻，按試驗設(shè)計所需溫度、時間進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵完成后55 ℃下烘干，粉碎后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

（1） 發(fā)酵溫度的優(yōu)化。根據(jù)預(yù)試驗，選擇接種量為10%，發(fā)酵時間為5 d，料液比為1∶1.75，研究不同發(fā)酵溫度（24，27，30，33，36 ℃） 對燕麥麩皮多酚含量的影響。

（2） 發(fā)酵時間的優(yōu)化。選擇接種量為10%，發(fā)酵溫度為33 ℃，料液比為1∶1.75，研究不同發(fā)酵時間（2，3，4，5，6，7 d） 對燕麥麩皮多酚含量的影響。

（3） 料液比的優(yōu)化。選擇接種量為10%，發(fā)酵時間為5 d，發(fā)酵溫度為33 ℃，研究不同料液比（1 ∶1.00，1 ∶1.25，1 ∶1.50，1 ∶1.75，1 ∶2.00，1∶2.25，1∶2.50） 對燕麥麩皮多酚含量的影響。

（4） 接種量的優(yōu)化。選擇發(fā)酵溫度為33 ℃，發(fā)酵時間為5 d，料液比為1∶1.75，研究不同接種量（2.5%，5.0%，7.5%，10.0%，12.5%，15.0%，17.5%） 對燕麥麩皮多酚含量的影響。

1.3.4 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取最優(yōu)的發(fā)酵條件，以燕麥麩皮多酚含量作為指標(biāo)設(shè)計正交試驗，研究燕麥麩皮發(fā)酵的最佳工藝。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

1.3.5 多酚的提取

稱取發(fā)酵好的樣品1.0 g，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的無水乙醇溶液100 mL，55 ℃水浴振蕩提取2 h，以轉(zhuǎn)速5 500 r/min 離心20 min，取上清液即為多酚提取液[8]。

1.3.6 多酚含量的測定

參考A F V D、聶攀等人[9-10]方法并加以改進(jìn)，取多酚提取液1 mL，福林酚試劑0.5 mL，加入6 mL純水中，混勻，反應(yīng)6 min 后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的Na2CO3溶液5 mL，混勻，避光反應(yīng)1 h 后于波長765 nm 處測定吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為：Y=0.087X+0.019（R2=0.999 7），以沒食子酸當(dāng)量（mg/g） 計算多酚含量，同時做空白對照。

1.3.7 ABTS 自由基清除率的測定

參考王廣慧等人[11]的方法，稱取發(fā)酵前后的樣品1 g 溶于10 mL 純水中，于55 ℃條件下振蕩提取1 h，以轉(zhuǎn)速5 500 r/min 離心20 min 得到上清液。取上清液1 mL，加入PBS 緩沖液1 mL，ABTS 工作液2 mL，室溫下反應(yīng)30 min，于波長734 nm 處測定吸光度A1。將ABTS 工作液替換為純水，測定吸光度A2，將上清液替換為PBS 緩沖液，測定吸光度A0。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥麩皮發(fā)酵單因素試驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對燕麥麩皮多酚含量的影響

發(fā)酵溫度對燕麥麩皮多酚含量的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對燕麥麩皮多酚含量的影響

由圖1 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，燕麥麩皮多酚含量呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，在33 ℃時多酚含量達(dá)到最大值。這是因為枯草芽孢桿菌的生長受溫度影響較大，隨著發(fā)酵溫度的提高，菌株活性增強(qiáng)，代謝速率加快，多酚含量也逐漸增加，溫度繼續(xù)升高，菌株的生長受阻，酶活力降低，多酚含量下降。

2.1.2 發(fā)酵時間對燕麥麩皮多酚含量的影響

發(fā)酵時間對燕麥麩皮多酚含量的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵時間對燕麥麩皮多酚含量的影響

由圖2 可知，發(fā)酵初期枯草芽孢桿菌處于對數(shù)生長期，代謝旺盛，發(fā)酵產(chǎn)物逐漸積累，多酚含量逐漸升高，隨著枯草芽孢桿菌生長進(jìn)入穩(wěn)定期，5 d時多酚含量達(dá)到最高，繼續(xù)發(fā)酵，菌株進(jìn)入衰亡期，代謝廢物增加，多酚被分解利用，從而導(dǎo)致含量降低，故選擇5 d 為最優(yōu)發(fā)酵時間。

2.1.3 料液比對燕麥麩皮多酚含量的影響

料液比對燕麥麩皮多酚含量的影響見圖3。

圖3 料液比對燕麥麩皮多酚含量的影響

由圖3 可知，當(dāng)料液比低于1∶1.75 時，多酚含量與料液比呈正相關(guān)，料液比大于1∶1.75 時，隨著料液比的增加，多酚含量緩慢下降，因此選擇1∶1.75為燕麥麩皮發(fā)酵的最佳料液比。培養(yǎng)基中的水分含量直接影響菌株的生長，水分較低時，培養(yǎng)基黏度大，流動性差，枯草芽孢桿菌生長緩慢，水分含量過高，培養(yǎng)基通氣性變差，菌株呼吸作用受到抑制，都影響多酚的積累。

2.1.4 接種量對燕麥麩皮多酚含量的影響

接種量對燕麥麩皮多酚含量的影響見圖4。

圖4 接種量對燕麥麩皮多酚含量的影響

由圖4 可知，燕麥麩皮多酚含量隨著接種量的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在接種量為10%時達(dá)到最高值。接種量較低時，培養(yǎng)基營養(yǎng)充足，有利于菌體產(chǎn)酶，多酚逐漸積累，接種量大于10%時，培養(yǎng)基不足以提供菌體生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，代謝廢物增加，多酚的積累受到限制。

2.2 燕麥麩皮發(fā)酵工藝優(yōu)化

燕麥麩皮正交試驗結(jié)果見表2。

表2 燕麥麩皮正交試驗結(jié)果

由表2 可知，影響發(fā)酵燕麥麩皮多酚含量的因素依次為發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>料液比>接種量，最佳發(fā)酵工藝為A2B2C2D2，以最優(yōu)的發(fā)酵工藝進(jìn)行3 次發(fā)酵試驗，得出燕麥麩皮的多酚含量為10.808 mg/g，因此燕麥麩皮發(fā)酵的最佳工藝為發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間5 d，料液比1∶1.75，接種量10%，此時發(fā)酵麩皮的多酚含量達(dá)到最高。

2.3 發(fā)酵前后燕麥麩皮多酚含量和抗氧化活性檢測

燕麥麩皮發(fā)酵前后多酚含量和抗氧化活性對比見表3。

表3 燕麥麩皮發(fā)酵前后多酚含量和抗氧化活性對比

發(fā)酵后，燕麥麩皮多酚含量達(dá)到10.81 mg/g，是未發(fā)酵麩皮的6.93 倍，同時抗氧化活性也大幅提高，ABTS 自由基清除率是未發(fā)酵麩皮的1.36 倍。表明枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵對于燕麥麩皮多酚的釋放和富集有明顯作用，可以用于之后對燕麥麩皮多酚的研究中，但是具體的作用機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

利用枯草芽孢桿菌對燕麥麩皮進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，通過單因素試驗及正交試驗確定了燕麥麩皮發(fā)酵的最佳工藝為發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間5 d，料液比1∶1.75，接種量10%。在此條件下，發(fā)酵后燕麥麩皮多酚含量為10.81 mg/g，ABTS 自由基清除率為95.21%，分別是未發(fā)酵麩皮的6.93 倍和1.36 倍，為燕麥麩皮多酚的高效利用提供了理論基礎(chǔ)。