肺腺癌中可變剪接調控因子KHSRP調控的差異剪接基因分析

劉曉麗，柴文君，孫 磊，閆明霞，潘洪玉，孫躍喜

1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

2.同濟大學附屬同濟醫(yī)院急診醫(yī)學科，上海 200065

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。2018年，全球癌癥統(tǒng)計報告估計有209萬肺癌新發(fā)病例和176萬肺癌死亡病例［1］。肺癌分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌占全部肺癌的80% ～ 90%，包括肺鱗癌和肺腺癌，其中肺腺癌為最常見的病理學類型。雖然目前關于肺腺癌的治療已取得較大進步，但是由于肺腺癌患者的個體差異性、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變及對化療藥物的耐藥性，導致其死亡率仍較高，因此急需發(fā)掘腫瘤特異性新抗原，從而為肺腺癌治療提供新靶點。

可變剪接也稱為選擇性剪接，可使前體mRNA產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構體，導致不同的蛋白產(chǎn)物形成，從而形成新的細胞表位。作為基因調控較為普遍的機制之一，可變剪接在細胞增殖、生長、凋亡及分化中發(fā)揮著至關重要的作用，參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程［2］。在胰腺癌［3-4］、卵巢癌［5-6］、乳腺癌［7-8］、黑色素瘤［9-10］和膠質母細胞瘤［11-12］等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了大量高信度的可變剪接事件，剪接調控因子在過表達或敲減后，能夠引起可變剪接的發(fā)生，從而導致細胞致瘤特性的改變。KH型剪接調控蛋白（KHtype splicing regulatory protein，KHSRP）在調節(jié)RNA剪切、RNA轉運、RNA編輯、mRNA穩(wěn)定及降解等過程中均具有重要作用，從而調控細胞增殖、分化、生長、凋亡及腫瘤形成等多種生物學過程［13］。目前，KHSRP與異質性核糖核蛋白C（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C，HNRNPC）相互作用后如何調控下游靶分子，從而影響Janus激酶-信號轉導及轉錄激活因子（Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT）信號通路變化的具體機制尚未闡明。考慮到KHSRP對可變剪接的可能調控作用，本研究旨在研究KHSRP對下游差異可變剪接基因的調控，以確定KHSRP是否通過調控下游基因可變剪接促進肺腺癌進展。

1 材料和方法

1.1 細胞總RNA提取及反轉錄

研究中使用的所有細胞樣本的總RNA均采用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）提取，然后使用PrimeScript RT試劑（日本TaKaRa公司）進行反轉錄獲得cDNA。

1.2 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）

以cDNA為模板，設計ADD3、LIMCH1及NUMB引物，采用PrimeScript RT試劑進行PCR，15 μL PCR反應體系如下：3 μL 5×PrimeSTAR、1.2 μL脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）、10 μmol/L正向引物和反向引物各0.6 μL，使用稀釋10倍的反轉錄產(chǎn)物1.5 μL作為模板，將0.15 μL DNA聚合酶用ddH2O補至15 μL。按照以下程序進行PCR：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，退火5 ～ 15 s（退火溫度≥55 ℃，5 s；退火溫度＜55 ℃，15 s），72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。所使用的基因引物序列如下：ADD3正向引物序列為GCTCCTCCTAACCCATTT，反向引物序列為CATATCATCCTTGCCATTTA；LIMCH1正向引物序列為AACCAGTACCTCCCGAACA，反向引物序列為CCAACGAGCCAGGTCATC；NUMB正向引物序列為CTCCGATGACCAAACCAG，反向引物序列為GGACGCTCTTAGACACCTC。引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 DNA非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

配制8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，10 mL凝膠液配方如下：5.224 mL H2O，2.666 mL 30%丙烯酰胺（北京蘭博利德生物技術有限公司），2 mL 5×TBE（上海碧云天生物技術有限公司），100 μL 10% APS（上海碧云天生物技術有限公司），10 μL TEMED（上海碧云天生物技術有限公司）。以1×TBE作為緩沖液，120 V電泳30 min左右，電泳完成后，將凝膠浸泡于3×核酸染料［天根生化科技（北京）有限公司］中，30 min后用凝膠成像儀拍照。

1.4 數(shù)據(jù)庫分析

可變剪接差異靶基因在肺腺癌組織中的轉錄組表達水平采用腫瘤免疫評估資源（Tumor IMmune Estimation Resource，TIMER）數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）和阿拉巴馬大學伯明翰分校癌癥數(shù)據(jù)分析門戶（the University of Alabama at Birmingham cancer data analysis portal，ULCAN）-癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）分析；采用肺腺癌Kaplan網(wǎng)站分析基因與肺腺癌患者預后的相關性；采用TIMER Gene（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析基因與肺腺癌中免疫細胞功能的相關性。

1.5 Transwell遷移和侵襲實驗

用于遷移和侵襲實驗的小室購自美國Corning公司。遷移實驗將空穿小室插入24孔板中，下室加入800 μL含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的細胞培養(yǎng)基作為化學引誘劑，上室加入0.5×105個重懸于200 μL無血清細胞培養(yǎng)基中的肺癌細胞。侵襲實驗將膠穿小室插入24孔板中，下室加入800 μL含有10% FBS的細胞培養(yǎng)基作為化學引誘劑，上室加入1×105個重懸于200 μL無血清細胞培養(yǎng)基中的肺癌細胞。遷移實驗的肺腺癌細胞培養(yǎng)16 h，侵襲實驗的肺腺癌細胞培養(yǎng)18 h，用棉簽擦去小室上室的細胞，用甲醇溶液固定從小室上室通過膜遷移到小室下室的細胞30 min，并使用結晶紫染色液染色細胞20 min，晾干后，對染色細胞進行拍照計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學處理

本研究中兩組數(shù)據(jù)之間的比較均采用GraphPad Prism 9軟件中的雙側Studentt檢驗，通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/）分析基因與肺腺癌患者的預后相關性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 KHSRP調控的可變剪接事件及信號通路

分別提取A549細胞的KHSRP-siRNA（2條干擾片段）及對照載體的總RNA，采用RNA-Seq高通量測序和生物信息學分析，鑒定KHSRP敲除后發(fā)生的可變剪接事件。結果共鑒定出356個KHSRP調控的可變剪接事件［以偽發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05，P＜0.05作為判斷標準］，樣品中有外顯子跳躍、5’末端選擇性剪接、3’末端選擇性剪接等7種類型的可變剪接，其中，外顯子跳躍出現(xiàn)221個，占總數(shù)的62.08%。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)主要集中在腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、緊密連接、肌動蛋白細胞骨架調節(jié)等信號通路（圖1）。

圖1 KHSRP調控的下游可變剪接事件Fig.1 Downstream alternative splicing events regulated by KHSRP

2.2 KHSRP調控的差異剪接靶基因

為進一步驗證RNA-Seq測序結果的可靠性，因外顯子跳躍是最常見的可變剪接類型，本研究挑選了測序結果中KHSRP敲低后的前20個可變剪接靶基因，按照篩選條件（FDR＜0.05，P＜0.05）初步篩選到14個外顯子跳躍類型的可變剪接靶基因，進一步通過IGV軟件查詢外顯子的表達水平，排除肉眼可見的表達水平非常低的基因，從而縮小感興趣基因的范圍，通過以上方法，我們最終找到3個基因作為感興趣的KHSRP差異剪接靶基因。經(jīng)反轉錄（reverse transcription，RT）-PCR電泳證實在A549細胞中敲除KHSRP后，ADD3的17號外顯子和NUMB的13號外顯子表達顯著增加，并且Uniprot查詢外顯子序列發(fā)現(xiàn)，ADD3的17號外顯子和NUMB的13號外顯子均存在于基因的經(jīng)典轉錄本上，提示包含17號外顯子的經(jīng)典轉錄本ADD3 L-異構體和包含13號外顯子的經(jīng)典轉錄本NUMBL-異構體可能發(fā)揮抑癌作用；而LIMCH1的20號外顯子表達顯著下降，并且Uniprot查詢外顯子序列發(fā)現(xiàn)，LIMCH1的20號外顯子不在基因的經(jīng)典轉錄本，提示包含20號外顯子的LIMCH1 L-異構體可能發(fā)揮促癌作用，而其不包含20號外顯子的經(jīng)典轉錄本LIMCH1S-異構體可能發(fā)揮抑癌作用。由此推測ADD3、NUMB及LIMCH1可能為KHSRP調控的差異剪接靶基因，并且在肺腺癌中可能均發(fā)揮抑制肺腺癌進展的作用（圖2）。

圖2 KHSRP調控的下游可變剪接事件驗證Fig.2 Verification of downstream alternative splicing events regulated by KHSRP

2.3 差異剪接靶基因在肺腺癌腫瘤組織和細胞系中的表達水平

為進一步驗證這3個基因在肺腺癌中的表達情況，本研究利用TIMER和ULCAN兩個癌癥數(shù)據(jù)庫進行轉錄組表達分析，發(fā)現(xiàn)ADD3、LIMCH1和NUMB基因在肺腺癌腫瘤組織中均低表達（圖3A ～ 3C）。

通過查詢美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）發(fā)現(xiàn)，ADD3編碼2個可變剪接異構體，LIMCH1編碼20個可變剪接異構體，NUMB編碼4個可變剪接異構體，本研究挑選編碼剪接異構體最少的ADD3進行進一步的實驗驗證。首先，在20對肺癌臨床樣本cDNA中檢測了ADD3可變剪接異構體的轉錄本表達情況，發(fā)現(xiàn)在20對肺癌樣本中，ADD3 L/S-異構體在65%肺癌腫瘤組織中的表達高于配對癌旁組織，在10%肺癌腫瘤組織中的表達低于配對癌旁組織，在25%肺癌腫瘤組織中的表達與配對癌旁組織接近（圖3D）。另外，在8個肺腺癌細胞系中檢測ADD3可變剪接異構體的表達，發(fā)現(xiàn)ADD3 L-異構體在H1975、PC9、H292和H358細胞中的表達比S-異構體高，而ADD3 L-異構體在A549、H1299、H838和H1650細胞中的表達比S-異構體少（圖3E），ADD3可變剪接異構體在多種肺腺癌細胞系中的表達模式差異顯著。

2.4 差異剪接靶基因在肺腺癌腫瘤組織中低表達與患者預后不良有關

為進一步分析ADD3、LIMCH1及NUMB基因與肺腺癌患者的預后相關性，本研究利用肺腺癌生存分析數(shù)據(jù)庫Kaplan進行分析，發(fā)現(xiàn)ADD3、LIMCH1和NUMB基因在肺腺癌中低表達與肺腺癌患者預后不良有關，提示ADD3、LIMCH1及NUMB基因與肺腺癌惡性表型相關（圖4）。

圖4 差異剪接基因與肺腺癌預后相關性分析Fig.4 Analysis of the correlation between differential alternative genes and overall survival of lung cancer

2.5 差異剪接靶基因與肺腺癌中免疫細胞功能呈正相關

可變剪接和免疫細胞功能在癌癥中均發(fā)揮重要作用，因此，本研究將KHSRP可能的差異剪接靶基因與肺腺癌中免疫細胞的功能進行分析，發(fā)現(xiàn)ADD3、NUMB與B細胞、T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞及樹突狀細胞功能呈正相關，而LIMCH1與巨噬細胞功能呈正相關（圖5），提示ADD3、NUMB及LIMCH1可能作為肺腺癌特異性新抗原，在肺腺癌中可能通過調節(jié)免疫細胞功能，使免疫系統(tǒng)功能總體呈激活狀態(tài)，從而起到抑制肺腺癌進展的作用。

圖5 差異剪接基因與免疫細胞功能相關性分析Fig.5 Correlation analysis between differential splicing genes and immune cell function

2.6 ADD3 L-異構體抑制肺腺癌細胞系A549細胞遷移和侵襲潛能

為進一步驗證ADD3可變剪接異構體在肺腺癌中的功能，針對ADD3 L-異構體和S-異構體分別設計了2條siRNA，在A549細胞中敲低L-異構體和S-異構體（圖6A），transwell實驗發(fā)現(xiàn)，敲低ADD3 L-異構體可以促進肺腺癌細胞的體外遷移和侵襲潛能，而敲低ADD3 S-異構體后A549細胞的體外侵襲和遷移潛能無顯著變化（圖6B），提示KHSRP可能通過下調ADD3基因L-異構體剪接體的表達促進肺腺癌進展。

圖6 ADD3可變剪接異構體在A549細胞中對遷移和侵襲潛能的影響Fig.6 The effect of ADD3 variable splicing isomers on migration and invasive potential in A549 cells

3 討 論

選擇性剪接的異常變化可能會影響腫瘤進展［14］，還可能破壞腫瘤進展中的蛋白質相互作用途徑［15-16］。前期研究［17］發(fā)現(xiàn)，可變剪接調控蛋白KHSRP在肺癌中顯著促進肺癌細胞增殖、侵襲和遷移功能。KHSRP基因編碼一種多功能RNA結合蛋白，參與多種細胞生物學過程，包括轉錄、選擇性前信使核糖核酸剪接和信使核糖核酸定位［18］。我們推測KHSRP可能通過調控下游蛋白的可變剪接促進肺腺癌細胞增殖、侵襲及遷移潛能。因此，在肺腺癌細胞A549中敲低KHSRP后，按照篩選條件（FDR＜0.05，P＜0.05）進行初步篩選，通過IGV軟件查詢外顯子的表達水平，排除肉眼可見的表達水平非常低的基因，從而縮小感興趣基因的范圍，最終找到3種基因作為感興趣的KHSRP差異剪接靶基因。通過PCR電泳對測序結果進行實驗驗證，發(fā)現(xiàn)ADD3的17號外顯子及NUMB的13號外顯子表達顯著增加，LIMCH1的20號外顯子表達顯著下降，3個基因均發(fā)生顯著的外顯子跳躍現(xiàn)象，提示KHSRP可能通過調控ADD3、NUMB及LIMCH1的外顯子跳躍這一最常見的可變剪接類型進而影響肺癌進展。2013年Bechara等［19］發(fā)現(xiàn)NUMB在肺癌細胞中發(fā)生可變剪接，并被RNA結合蛋白RBM5/6/10調控；2021年Wang等［20］發(fā)現(xiàn)細胞骨架蛋白ADD3被RNA結合蛋白QKI-5調控從而影響肺癌進展，這兩項研究與本研究相呼應，進一步說明本研究的可變剪接測序結果是可靠的。本研究發(fā)現(xiàn)并證實ADD3、NUMB及LIMCH1在肺腺癌中作為KHSRP的可變剪接靶基因影響肺腺癌進展。

通過Uniprot網(wǎng)站查詢發(fā)生外顯子跳躍的序列，判斷包含跳躍外顯子的L-異構體是否位于基因的經(jīng)典轉錄本上，發(fā)現(xiàn)ADD3的17號外顯子和NUMB的13號外顯子均存在于基因的經(jīng)典轉錄本上，提示包含17號外顯子的經(jīng)典轉錄本ADD3 L-異構體和包含13號外顯子的經(jīng)典轉錄本NUMBL-異構體可能發(fā)揮抑癌作用；而LIMCH1的20號外顯子則不在基因的經(jīng)典轉錄本上，提示不包含20號外LIMCH1 S-異構體為經(jīng)典轉錄本，可能發(fā)揮抑癌作用。由此推測ADD3、NUMB及LIMCH1為KHSRP調控的差異剪接靶基因，并且在肺腺癌中可能均發(fā)揮抑制肺腺癌進展的作用。為驗證這一猜想，本研究分別通過TIMER-Diff EXP基因表達模塊和ULCAN-TCGA模塊分析了ADD3、NUMB及LIMCH1在肺腺癌中的表達情況，發(fā)現(xiàn)這3種基因在肺腺癌中均呈低表達狀態(tài)。另外，本研究進一步檢測了本實驗室收集的20對肺癌臨床樣本中ADD3的可變剪接異構體的表達情況，ADD3 L/S-異構體在65%肺癌腫瘤組織中的表達高于配對癌旁組織，在10%肺癌腫瘤組織中的表達低于配對癌旁組織，在25%肺癌腫瘤組織中的表達與配對癌旁組織接近，此結果與上述數(shù)據(jù)庫表達分析結果不一致，原因可能是本研究的臨床樣本量較少，需要擴大樣本量以進一步驗證。2019年Lechuga等［21］發(fā)現(xiàn)在肺癌細胞H1573中敲低ADD3可以促進肺癌細胞的遷移潛能；而2021年Wang等［20］發(fā)現(xiàn)ADD3可變剪接異構體在肺癌細胞系A549和H520中促進細胞遷移和生長，兩項研究結果相反，原因可能是ADD3在不同細胞系中發(fā)揮的功能不同。因此本研究繼續(xù)檢測了ADD3可變剪接異構體在不同肺腺癌細胞系中的表達情況，發(fā)現(xiàn)ADD3可變剪接異構體在不同肺腺癌細胞中差異較大，這也許可以解釋ADD3在不同細胞系中對細胞遷移能力具有雙重影響的現(xiàn)象。本研究又通過肺腺癌Kaplan網(wǎng)站分析了這3種基因與肺腺癌預后的相關性，發(fā)現(xiàn)3種基因在肺腺癌中呈低表達，且低表達者預后不良，以上分析結果進一步證實了ADD3、NUMB及LIMCH1可能抑制肺腺癌進展的推測。

腫瘤細胞可以修飾其表面抗原，從而改變腫瘤組織的微環(huán)境，逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視、識別和攻擊，并繼續(xù)生長和增殖。腫瘤突變負荷與免疫檢查點阻斷反應之間存在正相關。來自體細胞突變的腫瘤新抗原激活適應性免疫反應，殺死癌細胞。同樣，具有新抗原生成能力的腫瘤相關剪接事件被認為是免疫治療反應的重要預測因子［22-23］。越來越多的臨床研究［24-26］表明，針對癌癥種系抗原的T細胞受體工程化T（T-cell receptor engineered T，TCR-T）細胞治療和基于新抗原的疫苗都具有顯著效果。腫瘤特異性新抗原可以由編碼突變衍生，也可以由其他過程產(chǎn)生，如剪接事件的改變。一些分析高通量測序數(shù)據(jù)的研究［27-29］顯示，腫瘤特異性選擇性剪接非常豐富，并可能產(chǎn)生有助于表位庫的新表位。研究［30］表明，剪接障礙直接影響在免疫途徑中發(fā)揮關鍵作用的基因，從而影響癌癥免疫治療效果。識別不同剪接異構體在特定癌癥中的作用和剪接因子的調節(jié)作用，對于揭示腫瘤逃避免疫反應機制具有重要意義。因此，本研究進一步利用TIMER網(wǎng)站分析了ADD3、LIMCH1及NUMB與肺腺癌中免疫細胞功能的相關性，結果顯示，ADD3、NUMB與B細胞、T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞及樹突狀細胞功能均呈正相關，而LIMCH1與巨噬細胞功能呈正相關，提示ADD3、NUMB及LIMCH1可能作為肺腺癌特異性新抗原，在肺腺癌中可能通過調節(jié)免疫細胞功能，使免疫系統(tǒng)功能總體呈激活狀態(tài)，從而起到抑制肺腺癌進展的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中ADD3、LIMCH1及NUMB為可變剪接調控因子KHSRP的下游關鍵差異剪接靶基因，且其在肺腺癌中低表達與患者預后不良有關；免疫相關性分析發(fā)現(xiàn)ADD3、LIMCH1及NUMB可能與免疫細胞功能增強相關。雖然以上結果還需進一步驗證，但本研究有望為尋找有效的肺腺癌治療靶點提供新的線索。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。