LncRNA SNHG5/miR-26a-5p/MTDH信號(hào)軸促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究

冶俊玲，鄭小影，郭新建，陳瑞慧，楊 柳，茍笑丹，蔣漢梅

1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，青海 西寧 810001；

2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，青海 西寧 810001

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第4大常見癌癥［1］。由于CRC缺乏早期癥狀，且篩查方法存在一定局限性，許多患者確診時(shí)已為晚期［2］。CRC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率很高，常用的手術(shù)治療、放療及化療對(duì)患者的預(yù)后影響較小［3］，因此需要深入研究CRC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子機(jī)制，以提高CRC的早期診斷和治療水平。長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因5（long noncoding RNA small nucleolar RNA host gene 5，lncRNA SNHG5）位于染色體6q14.3區(qū)域，由6個(gè)外顯子和2個(gè)核仁RNA組成，在惡性黑色素瘤、食管癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達(dá)異常［4-6］。miRNA是由19 ～ 25個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼小分子RNA，能夠影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，有研究［7］顯示，miR-26a-5p在多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用，而lncRNA SNHG5能夠通過海綿吸附作用調(diào)控miR-26a-5p表達(dá)［8］。異黏蛋白（metadherin，MTDH）是一種基因序列高度保守的蛋白，可激活癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，通過多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與血管生成和化療耐藥，從而發(fā)揮促癌作用［9］。本研究通過檢測(cè)lncRNA SNHG5、miR-26a-5p和MTDH在CRC組織、細(xì)胞系中的表達(dá)情況，觀察細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等方面的變化，分析lncRNA SNHG5、miR-26a-5p和MTDH之間的相互關(guān)系，探究lncRNA SNHG5、miR-26a-5p、MTDH在CRC中的具體調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本與數(shù)據(jù)庫資料

收集2012年10月—2016年10月經(jīng)手術(shù)切除的100例CRC樣本，經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為CRC［10］。所有患者的臨床資料完整，術(shù)前均未接受放療和化療。其中男性59例，女性41例，年齡55 ～ 73（61.86±5.14）歲。同時(shí)收集100例癌旁組織，病理學(xué)診斷為正常結(jié)腸組織，液氮凍存。本研究通過青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意并自愿提供組織樣本。

通過癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫下載398例CRC和39例正常結(jié)腸組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，使用R 4.0.2軟件尋找CRC與正常結(jié)腸組織間差異表達(dá)的lncRNA，篩選標(biāo)準(zhǔn)：相同lncRNA在腫瘤組織與正常組織間表達(dá)量差異在2倍以上，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取369例CRC患者的完整臨床數(shù)據(jù)，以lncRNA SNHG5的表達(dá)水平中位數(shù)將患者劃分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116、HCT-8、SW480、SW620、DLD-1、HT-29購自武漢普諾賽生命科技有限公司，人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC購自南京科佰生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、鏈霉素/青霉素、TRIzol試劑、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit、mirVana miRNA分離試劑盒、鏈霉親和素偶聯(lián)磁珠、SuperSignal West Pico PLUS化學(xué)發(fā)光底物購自美國Thermo Fisher公司，慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定、包裝及滴度測(cè)定由廣州源井生物科技有限公司完成，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自大連寶森生物科技有限公司，All-in-One miRNA qRT-PCR試劑盒購自亞太恒信生物科技（北京）有限公司，PCR引物與內(nèi)參購自生工生物工程（上海）股份有限公司，RNA熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）檢測(cè)試劑盒購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、H-E染色試劑盒、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Matrigel基質(zhì)膠購自上海研卉生物科技有限公司，Argonaute 2抗體（AGO2，ab186733）、MTDH（ab227981）、E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）抗體及Ki-67增殖指數(shù)分析用抗體購自英國Abcam公司，SP法兔抗體免疫組織化學(xué)試劑盒購自福州飛凈生物科技有限公司。其他試劑均為市售分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染

復(fù)蘇HCT-116、HCT-8、SW480、SW620、DLD-1、HT-29和FHC，使用含10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素/青霉素的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。SW620分為對(duì)照組（正常培養(yǎng)）、si-SNHG5組（轉(zhuǎn)染si-SNHG5）、SNHG5組（轉(zhuǎn)染SNHG5）、SNHG5-MUT組（轉(zhuǎn)染突變型SNHG5）、miR-26a-5p mimic組（轉(zhuǎn)染miR-26a-5p mimic）、SNHG5+miR-26a-5p mimic組（轉(zhuǎn)染SNHG5+miR-26a-5p mimic）、si-SNHG5+miR-26a-5p inhibitor組（轉(zhuǎn)染si-SNHG5+miR-26a-5p inhibitor）、si-MTDH組（轉(zhuǎn)染si-MTDH）和SNHG5+si-MTDH組（轉(zhuǎn)染SNHG5+si-MTDH），按照分組進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)異種移植實(shí)驗(yàn)所用SW620分為對(duì)照組（正常培養(yǎng)）、sh-SNHG5組（轉(zhuǎn)染sh-SNHG5）和SNHG5組（轉(zhuǎn)染SNHG5），按照分組進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測(cè)lncRNA SNHG5、miR-26a-5p、MTDH的相對(duì)表達(dá)

組織、細(xì)胞：使用TRIzol試劑、mirVana miRNA分離試劑盒分別提取各組癌組織、細(xì)胞總RNA和miRNA?？俁NA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用1 μg cDNA模板、上下游引物各0.5 μg和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒配制20 μL PCR體系。miRNA用All-in-One miRNA qRTPCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循環(huán)35次。引物序列見表1。使用ABI 7500 RTFQPCR儀完成RTFQ-PCR操作，應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算lncRNA SNHG5、miR-26a-5p和MTDH的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3.3 FISH檢測(cè)

使用FISH試劑盒檢測(cè)SW620細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG5的定位情況。細(xì)胞常規(guī)接種于24孔板內(nèi)的載玻片上，培養(yǎng)24 h后加入4%多聚甲醛溶液固定10 min。加入0.5%的Triton X-100通透處理5 min。預(yù)雜交液、雜交液37 ℃預(yù)熱30 min后加至載玻片上，置于37 ℃環(huán)境中反應(yīng)20 min。用雜交液1∶50稀釋lncRNA SNHG5探針，加至載玻片上，37 ℃避光過夜。洗脫未結(jié)合的探針，加入4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚（4′, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）避光反應(yīng)8 min，滴加防熒光淬滅劑，封片，于熒光顯微鏡下避光觀察拍 照。

1.3.4 RNA下拉實(shí)驗(yàn)

取SW620細(xì)胞，轉(zhuǎn)染生物素標(biāo)記的miR-26a-5p，正常培養(yǎng)48 h后加入適量裂解液充分裂解細(xì)胞，收集裂解產(chǎn)物，加入鏈霉親和素偶聯(lián)磁珠，充分混勻，置于4 ℃環(huán)境中溫育3 h，洗滌后加入TRIzol試劑提取結(jié)合RNA，采用RTFQ-PCR檢測(cè)lncRNA SNHG5水平。

1.3.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

通過生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)SNHG5內(nèi)Chr6存在片段GGUUUACUUGA、MTDH 3′非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR）第652 ～ 659片段UACUUGAA為與miR-26a-5p潛在結(jié)合的種子序列，擴(kuò)增miR-26a-5p結(jié)合位點(diǎn)的種子序列，構(gòu)建野生型psiCheck2-SNHG5-Luc、psiCheck2-MTDH-Luc熒光質(zhì)粒。使用SNHG5 Chr6、MTDH 3′-UTR基因點(diǎn)突變后的片段構(gòu)建突變型psiCheck2-SNHG5-MUT-Luc、psiCheck2-MTDHMUT-Luc熒光質(zhì)粒，使用LipofectamineTM3000分別將熒光質(zhì)粒與miR-26a-5p模擬物（5′-UCUACAGUGCACGUGUCUCCG-3′）共轉(zhuǎn)染至SW620細(xì)胞中；將野生型psiCheck2-MTDH-Luc轉(zhuǎn)染至對(duì)照組、si-SNHG5組、si-SNHG5+miR-26a-5p inhibitor組、SNHG5組、SNHG5-MUT組和SNHG5+miR-26a-5p mimic組細(xì)胞中，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.3.6 RNA免疫共沉淀

取SW620細(xì)胞，加入適量裂解液充分裂解細(xì)胞。磁珠中分別加入AGO2抗體、免疫球蛋白G，室溫溫育30 min后加入細(xì)胞裂解物，置于4 ℃環(huán)境中溫育過夜，采用RTFQ-PCR檢測(cè)純化的免疫沉淀RNA。

1.3.7 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取處于對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞，胰酶消化后以1 000個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板上，正常培養(yǎng)5 d，每天進(jìn)行1次CCK-8檢測(cè)，每孔加入10 μL CCK-8試劑后避光培養(yǎng)2 h，于450 nm波長下檢測(cè)各孔吸光度（D）值。

1.3.8 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力

取處于對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞，胰酶消化后以1 000個(gè)/孔的接種密度將各組細(xì)胞接種于6孔板中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，棄去培養(yǎng)基，用1×磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗后加入4%多聚甲醛溶液固定20 min，加入1%結(jié)晶紫染色10 min，觀察拍照并進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。

1.3.9 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

各組處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，觀察細(xì)胞覆蓋率達(dá)到90%，用200 μL移液器吸嘴劃痕，清去脫落的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別于劃痕后和培養(yǎng)24 h后拍照，用Image J軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率=（最初劃痕寬度-24 h后劃痕寬度）/最初劃痕寬度×100%。

1.3.10 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力

遷移：取處于對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于transwell小室上室，向下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)24 h。穿過上室的細(xì)胞用4%多聚甲醛溶液固定20 min，1%結(jié)晶紫染色10 min，于光鏡下觀察拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率=各組遷移細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)×100%。

侵襲：無血清DMEM培養(yǎng)基與Matrigel基質(zhì)膠按1∶3的比例稀釋，混勻后均勻涂抹于小室上室膜底部，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中過夜，第2天置于紫外線燈下照射30 min。其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)方法一致，計(jì)算細(xì)胞侵襲率=各組侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.11 EdU檢測(cè)細(xì)胞DNA復(fù)制活性

取處于對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞，以4 000個(gè)/孔的接種密度接種于24孔板中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。加入含有EdU工作液的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用4%多聚甲醛溶液固定后加入TritonX-100通透細(xì)胞，加入Click反應(yīng)液，37 ℃避光反應(yīng)30 min，加入Hoechst染核，37 ℃避光反應(yīng)10 min，滴加防熒光淬滅劑，封片，于熒光顯微鏡下觀察拍照，計(jì)算EdU陽性細(xì)胞的百分比。

1.3.12 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)E-cadherin、vimentin、Cyclin D1、MMP-9、MTDH表達(dá)情況

CRC、癌旁組織樣本制成勻漿，加入適量預(yù)冷RIPA，充分混勻后冰上溫育1.5 h；各組細(xì)胞加入適量預(yù)冷RIPA，充分混勻后冰上溫育30 min。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA定量后加入上樣緩沖液，于沸水中煮樣5 min。每道上樣10 μg蛋白，進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，使用聚偏二氟乙烯膜完成轉(zhuǎn)膜，截取目的條帶浸于5%脫脂奶粉制成的封閉液中，置于搖床上室溫封閉1 h。檢測(cè)E-cadherin、vimentin、Cyclin D1、MMP-9、MTDH，使用吐溫-20三羥甲基氨基甲烷緩沖生理鹽水洗膜3次，用封閉液1∶500稀釋一抗制成溫育液，加至條帶上，充分搖勻后置于4 ℃環(huán)境下過夜。第2天取出膜，平衡至室溫后洗膜3次，加入稀釋比例為1∶5 000的對(duì)應(yīng)二抗溫育液，室溫溫育2 h，洗膜3次，加入電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）液，避光反應(yīng)5 min，用定量成像儀分析結(jié)果。

1.3.13 體內(nèi)異種移植瘤模型

BALB/c裸小鼠按照各組細(xì)胞名稱隨機(jī)分組，每組16只。各組隨機(jī)分出8只于腋窩兩側(cè)注射密度為5×106個(gè)/mL的人結(jié)腸癌細(xì)胞系細(xì)胞懸液，每4 d用數(shù)字卡尺測(cè)量1次皮下腫瘤的體積，計(jì)算公式：體積=1/2（長×寬2）。23 d后處死動(dòng)物，完整取出腫瘤，測(cè)量體積并拍照后置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋并制成切片。剩余8只經(jīng)尾靜脈注射密度為3×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，60 d后處死動(dòng)物，完整取出肺組織，拍照后制成石蠟切片。

1.3.14 H-E染色觀察CRC轉(zhuǎn)移肺結(jié)節(jié)

取各組石蠟切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，蘇木精染色8 min，蒸餾水沖洗，1%鹽酸乙醇分化15 s，蒸餾水沖洗并浸泡10 min返藍(lán)，95%乙醇處理1 min，酸化伊紅染液2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于光鏡下觀察，計(jì)算肺結(jié)節(jié)數(shù)量并拍照記錄。

1.3.15 免疫組織化學(xué)檢測(cè)MTDH、E-cadherin、vimentin表達(dá)情況及Ki-67增殖指數(shù)

檢測(cè)CRC、癌旁組織MTDH與裸鼠腫瘤Ki-67增殖指數(shù)及E-cadherin、vimentin的表達(dá)情況。取各組石蠟切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，1×PBS清洗2次，加入3% H2O2室溫封閉10 min，蒸餾水清洗3次，加入抗原修復(fù)液，加入對(duì)應(yīng)一抗，稀釋比例為1∶100，置于4 ℃環(huán)境中過夜。第2天取出，平衡至室溫后1×PBS清洗3次，加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫溫育1 h，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物，室溫溫育1 h，二氨基聯(lián)苯胺顯色后用蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下拍攝照片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不同視野，用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，取平均值作為MTDH、E-cadherin、vimentin的相對(duì)表達(dá)量及Ki-67增殖指數(shù)的最終判定值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料使用±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LncRNA SNHG5、miR-26a-5p、MTDH在CRC中的表達(dá)情況

CRC中存在多種異常表達(dá)的lncRNA，TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，lncRNA SNHG5是相對(duì)豐度較高的顯著上調(diào)的lncRNA之一（圖1A）。RTFQ-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，CRC組織lncRNA SNHG5水平顯著上調(diào)（P＜0.05，圖1B），miR-26a-5p水平下降（P＜0.05，圖1C）；在CRC細(xì)胞系中，lncRNA SNHG5相對(duì)表達(dá)量均升高（P＜0.05，圖1D），miR-26a-5p相對(duì)表達(dá)量均降低（P＜0.05，圖1E）。SW620細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG5相對(duì)表達(dá)量最高，因此選擇SW620細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CRC樣本免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，MTDH在CRC中表達(dá)上調(diào)，SNHG5高表達(dá)的樣本MTDH水平也較高（圖1F、1G）。

圖1 LncRNA SNHG5、miR-26a-5p、MTDH在CRC中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of lncRNA SNHG5, miR-26a-5p and MTDH in CRC

2.2 LncRNA SNHG5在CRC中的相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特征及生存期的關(guān)系

LncRNA SNHG5表達(dá)量與臨床病理學(xué)特征間的關(guān)系見表2。不同性別、年齡與CRC組織lncRNA SNHG5表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；漿膜及漿膜外浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM Ⅲ期的CRC組織lncRNA SNHG5表達(dá)量高于漿膜下浸潤、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM Ⅰ ～ Ⅱ期的組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。生存分析結(jié)果顯示，lncRNA SNHG5高表達(dá)與總生存率顯著相關(guān)（P＜0.05，圖2）。

表2 LncRNA SNHG5在CRC中的相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between relative expression level of lncRNA SNHG5 in CRC and clinicopathological features

圖2 LncRNA SNHG5在CRC中的相對(duì)表達(dá)水平與生存期的關(guān)系Fig.2 Relationship between relative expression level of lncRNA SNHG5 in CRC and survival period

2.3 LncRNA SNHG5對(duì)CRC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)CCK-8、克隆形成、transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，s i-SNHG5組增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力均明顯下降（P＜0.05），SNHG5組增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力均明顯提升（P＜0.05，圖3A ～ 3D）。體內(nèi)異種移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，sh-SNHG5組腫瘤體積明顯減?。≒＜0.05），SNHG5組腫瘤體積明顯增加（P＜0.05，圖3E，表3）。通過RTFQ-PCR檢測(cè)lncRNA SNHG5水平驗(yàn)證各組重組載體穩(wěn)定性，與對(duì)照組相比，sh-SNHG5組腫瘤lncRNA SNHG5表達(dá)量下降（P＜0.05），SNHG5組lncRNA SNHG5表達(dá)量上升（P＜0.05），提示各組重組載體均穩(wěn)定表達(dá)（圖3F）。肺組織H-E染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，sh-SNHG5組轉(zhuǎn)移肺結(jié)節(jié)數(shù)量減少（P＜0.05），SNHG5組轉(zhuǎn)移肺結(jié)節(jié)數(shù)量增多（P＜0.05，圖3G，表4）。

表3 各組裸鼠移植瘤體積比較Tab.3 Comparison of transplanted tumor volume in each group of nude mice

表4 各組裸鼠轉(zhuǎn)移肺結(jié)節(jié)數(shù)量比較Tab.4 Comparison of the number of metastatic lung nodules in each group of nude mice

圖3 LncRNA SNHG5對(duì)CRC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響Fig.3 Effects of lncRNA SNHG5 on proliferation, migration and invasion of CRC cells

2.4 CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)移、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)分子表達(dá)水平與lncRNA SNHG5表達(dá)水平的關(guān)系

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，si-SNHG5組E-cadherin相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05），vimentin相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05），SNHG5組E-cadherin相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05），vimentin相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05，圖4A，表5）。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，sh-SNHG5組Ki-67增殖指數(shù)、vimentin相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05），E-cadherin相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05），SNHG5組Ki-67增殖指數(shù)、vimentin相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05），E-cadherin相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05，圖4B，表6）。

圖4 CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)移、EMT相關(guān)分子表達(dá)水平與lncRNA SNHG5表達(dá)水平的關(guān)系Fig.4 Relationship between lncRNA SNHG5 expression and expression of molecules related to metastasis and EMT of CRC cells

表5 各組細(xì)胞E-cadherin、vimentin相對(duì)表達(dá)水平比較Tab.5 Comparison of relative expression levels of E-cadherin and vimentin in cells of different groups （±s）

表5 各組細(xì)胞E-cadherin、vimentin相對(duì)表達(dá)水平比較Tab.5 Comparison of relative expression levels of E-cadherin and vimentin in cells of different groups （±s）

Group E-cadherin/GAPDH Vimentin/GAPDH Control group 0.90±0.08 1.12±0.09 si-SNHG5 group 1.15±0.09 0.81±0.05 SNHG5 group 0.61±0.07 1.44±0.12 F value 122.283 116.203 P value 0.000 0.000

表6 各組移植瘤E-cadherin、vimentin相對(duì)表達(dá)水平及Ki-67增殖指數(shù)比較Tab.6 Comparison of relative expression levels of E-cadherin, vimentin and Ki-67 proliferation index in different groups of transplanted tumors （±s）

表6 各組移植瘤E-cadherin、vimentin相對(duì)表達(dá)水平及Ki-67增殖指數(shù)比較Tab.6 Comparison of relative expression levels of E-cadherin, vimentin and Ki-67 proliferation index in different groups of transplanted tumors （±s）

Group Ki-67 proliferation index E-cadherin Vimentin Control group 2.02±0.20 0.88±0.12 0.63±0.11 si-SNHG5 group 1.20±0.34 1.46±0.32 0.33±0.09 SNHG5 group 2.69±0.17 0.32±0.06 1.04±0.29 F value 78.102 65.896 29.520 P value 0.000 0.000 0.000

2.5 LncRNA SNHG5/miR-26a-5p/MTDH信號(hào)軸促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移的機(jī)制

2.5.1 SNHG5與miR-26a-5p、MTDH與miR-26a-5p存在物理上的相互作用

經(jīng)熒光染色，lncRNA SNHG5呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，可見lncRNA SNHG5主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中（圖5A）。RNA下拉實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-26a-5p能夠與lncRNA SNHG5相互結(jié)合（圖5B）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-26a-5p能夠降低野生型SNHG5、MTDH的熒光信號(hào)強(qiáng)度（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，SNHG5-MUT組、si-SNHG5+miR-26a-5p inhibitor組、SNHG5+miR-26a-5p mimic組Luc-MTDH熒光信號(hào)強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），si-SNHG5組Luc-MTDH熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著下降（P＜0.05），SNHG5組Luc-MTDH熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著提升（P＜0.05，圖5C）。免疫共沉淀檢測(cè)結(jié)果顯示，lncRNA SNHG5與miR-26a-5p都顯著富含AGO2的微核糖蛋白復(fù)合體，沉默lncRNA SNHG5后AGO2在SNHG5上的富集量減少（P＜0.05），在MTDH上的富集量增加（P＜0.05），而過表達(dá)lncRNA SNHG5的細(xì)胞中AGO2在SNHG5上的富集量增加（P＜0.05），在MTDH上的富集量減少（P＜0.05，圖5D）。

圖5 SNHG5與miR-26a-5p、MTDH與miR-26a-5p存在物理上的相互作用Fig.5 Physical interaction between SNHG5 and miR-26a-5p, MTDH and miR-26a-5p

2.5.2 SNHG5、miR-26a-5p、MTDH對(duì)CRC細(xì)胞增殖、遷移能力的影響

CCK-8、EdU、transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SNHG5組細(xì)胞增殖、遷移能力明顯提升（P＜0.05），miR-26a-5p mimic組、si-MTDH組細(xì)胞增殖、遷移能力明顯降低（P＜0.05），SNHG5+miR-26a-5p mimic組、SNHG5+si-MTDH組細(xì)胞增殖、遷移能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖6A ～ 6C）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SNHG5組MTDH相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05），si-SNHG5組MTDH相對(duì)表達(dá)水平下降（P＜0.05），si-SNHG5+miR-26a-5p inhibitor組、SNHG5+miR-26a-5p mimic組MTDH相對(duì)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖6D，表7）。

圖6 SNHG5、miR-26a-5p、MTDH三者存在功能上的相互關(guān)系Fig.6 The functional relationship among SNHG5, miR-26a-5p and MTDH

表7 各組細(xì)胞MTDH相對(duì)表達(dá)水平比較Tab.7 Comparison of relative expression level of MTDH in cells of different groups

2.5.3 SNHG5、miR-26a-5p、MTDH與遷移、侵襲相關(guān)分子的分析

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SNHG5組E-cadherin相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05），Cyclin D1、vimentin、MMP-9、MTDH相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05），si-SNHG5組、si-MTDH組E-cadherin相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05），Cyclin D1、vimentin、MMP-9、MTDH相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05），SNHG5+si-MTDH組Cyclin D1、E-cadherin、vimentin、MMP-9、MTDH相對(duì)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖7，表8）。

圖7 SNHG5、miR-26a-5p、MTDH與遷移、侵襲相關(guān)分子的分析Fig.7 Analysis of SNHG5, miR-26a-5p, MTDH and related molecules of migration and invasion

表8 各組細(xì)胞MTDH與遷移、侵襲相關(guān)分子相對(duì)表達(dá)水平比較Tab.8 Comparison of relative expression levels of MTDH, migration and invasion related molecules in different groups of cells （±s）

表8 各組細(xì)胞MTDH與遷移、侵襲相關(guān)分子相對(duì)表達(dá)水平比較Tab.8 Comparison of relative expression levels of MTDH, migration and invasion related molecules in different groups of cells （±s）

Group E-cadherin/GAPDH Vimentin/GAPDH Cyclin D1/GAPDH MMP-9/GAPDH MTDH/GAPDH Control group 1.21±0.07 0.98±0.09 0.91±0.07 0.99±0.08 0.63±0.09 si-SNHG5 group 1.81±0.14 0.28±0.04 0.37±0.09 0.47±0.06 0.30±0.05 SNHG5 group 0.43±0.09 1.39±0.11 1.25±0.12 1.33±0.11 1.36±0.11 si-MTDH group 1.68±0.16 0.33±0.04 0.43±0.09 0.45±0.07 0.14±0.04 SNHG5+si-MTDH group 1.24±0.07 0.87±0.09 0.83±0.07 1.02±0.09 0.67±0.11 F value 245.203 443.520 196.911 187.544 289.031 P value 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.6 LncRNA SNHG5通過miR-26a-5p調(diào)控MTDH影響CRC的作用機(jī)制

本研究結(jié)果顯示，lncRNA SNHG5、MTDH在CRC中表達(dá)上調(diào)并發(fā)揮促癌作用，miR-26a-5p表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌作用，且lncRNA SNHG5與miR-26a-5p、miR-26a-5p與MTDH之間存在靶向抑制關(guān)系，推測(cè)lncRNA SNHG5通過miR-26a-5p調(diào)控MTDH，其可能的作用機(jī)制見圖8。

圖8 LncRNA SNHG5通過miR-26a-5p調(diào)控MTDH影響CRC的作用機(jī)制Fig.8 The mechanism of lncRNA SNHG5 regulating MTDH and affecting CRC through miR-26a-5p

3 討 論

LncRNA可以參與許多生物過程，并在疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［11］。Zhao等［12］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MIR17HG可通過介導(dǎo)糖酵解相關(guān)正反饋回路促進(jìn)CRC肝轉(zhuǎn)移，Zhu等［13］的研究顯示，lncRNA NEAT1可通過重塑染色質(zhì)提高CRC對(duì)5-氟尿嘧啶的耐藥性和腫瘤細(xì)胞的干性。上述研究提示，深入了解lncRNA在CRC中的作用有利于提高CRC的診斷和治療效率。

LncRNA SNHG5位于染色體易位斷裂點(diǎn)，是核仁小RNA U50的宿主基因外顯子的剪接體［14］。Guo等［15］研究顯示，lncRNA SNHG5能夠通過影響抑制CRC細(xì)胞存活、遷移及侵襲，促進(jìn)凋亡的miR-363-3p的表達(dá)，促進(jìn)CRC的進(jìn)展。本研究中，lncRNA SNHG5在CRC組織和細(xì)胞系中均表達(dá)異常，其高表達(dá)提示CRC處于進(jìn)展期，預(yù)后不良，體外細(xì)胞增殖、遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)異種移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，lncRNA SNHG5在體外和體內(nèi)均能顯著促進(jìn)CRC的增殖和轉(zhuǎn)移。miR-26a-5p被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子，在某些惡性腫瘤的抗增殖和抗轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［16］。Kong等［17］研究顯示，miR-26a-5p在CRC中表達(dá)下調(diào)，沉默lncRNA生長停滯特異性蛋白6-反義1能夠上調(diào)miR-26a-5p水平，抑制CRC細(xì)胞周期和增殖。本研究中，RNA下拉實(shí)驗(yàn)、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)及RNA免疫共沉淀檢測(cè)結(jié)果顯示，lncRNA SNHG5可作為細(xì)胞質(zhì)中miR-26a-5p的分子海綿，并通過調(diào)節(jié)MTDH水平發(fā)揮其促癌作用。Yang等［18］研究顯示，miR-26a-5p是lncRNA SNHG5的直接靶點(diǎn)。Li等［19］通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MTDH是miR-26a-5p的下游靶標(biāo)，均與本研究結(jié)果一致。MTDH在迄今為止分析的所有類型的癌癥中都呈高表達(dá)，是癌癥發(fā)生、發(fā)展的重要分子［20］。MTDH主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，也存在于細(xì)胞核和核仁中，可在轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上被檢測(cè)到［21］。MTDH可與多種蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)相互作用，從而激活關(guān)鍵的致癌通路，增強(qiáng)癌癥的所有特征［22］。EMT是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程，在此過程中，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞間的黏附能力，獲得了包括侵襲和遷移在內(nèi)的多種間充質(zhì)特性，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin水平上調(diào)、上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin水平下調(diào)是EMT的特征［23］。MTDH水平與EMT密切相關(guān)，He等［24］的研究顯示，MTDH能夠激活ERK信號(hào)通路和EMT過程，從而促進(jìn)腎癌細(xì)胞的遷移和侵襲；Zhang等［25］觀察到正常肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞中上調(diào)MTDH水平均可使E-cadherin低表達(dá)、vimentin高表達(dá)。本研究中，沉默lncRNA SNHG5可下調(diào)MTDH的表達(dá)水平，抑制EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，提示MTDH參與lncRNA SNHG5在CRC中的致癌作用。

綜上所述，lncRNA SNHG5在CRC組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展及生存不良有關(guān)。lncRNA SNHG5作為miR-26a-5p的分子海綿調(diào)節(jié)MTDH表達(dá)促進(jìn)SW620細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，可能成為CRC新的生物標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。