基于HS-SPME-GC-O/MS 方法分析新、陳大紅袍中的關(guān)鍵差異性香氣活性成分

張 悅，Kang Suyoung，呂海鵬，郭 麗，戴偉東，朱 蔭，林 智*

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 杭州 310008 2 浙江省茶葉加工工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310008）

大紅袍產(chǎn)于福建武夷山，類屬閩北烏龍茶。因其香氣馥郁，滋味醇厚回甘等優(yōu)異品質(zhì)特征，大紅袍長(zhǎng)期以來躋身武夷四大名叢之首，屬武夷巖茶之珍品[1]。近年來，由于儲(chǔ)藏一定年份的茶葉往往具有獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)及顯著的保健功效，因此市場(chǎng)上掀起一股“陳茶熱”，比如陳年普洱茶[2-3]、陳年鐵觀音[4]和老白茶[5]等，紛紛成為消費(fèi)者收藏和品飲的對(duì)象，而陳年武夷巖茶也逐漸進(jìn)入人們的視野[6]，引起消費(fèi)者及科研工作者的關(guān)注。陳年大紅袍在外觀上與新大紅袍無明顯差異。除專業(yè)性極強(qiáng)的感官審評(píng)技術(shù)外，目前尚無科學(xué)量化的手段來判別新、陳大紅袍。這一短板給不法商販提供了可乘之機(jī)。鑒于茶葉內(nèi)含的揮發(fā)性化合物會(huì)因儲(chǔ)藏過程中環(huán)境、時(shí)間等因素的影響而發(fā)生顯著變化[7]，因此查明其關(guān)鍵差異性香氣成分可為新、陳大紅袍的科學(xué)判別提供新的理論依據(jù)。目前，對(duì)大紅袍的研究不僅包括生物活性[8-9]、組培繁育[10]和品種選育[11]等方面，還更多聚焦于加工工藝對(duì)大紅袍香氣成分的影響。柴斐等[12]發(fā)現(xiàn)烘干大紅袍中吡嗪類化合物和芳樟醇遠(yuǎn)大于冰凍大紅袍中的含量，而α-法尼烯、香葉醇和橙花叔醇等含量遠(yuǎn)低于冰凍大紅袍，兩者都有較高含量的苯乙醛。王芳等[13]認(rèn)為橙花叔醇、α-法尼烯、吲哚、苯乙腈、苯乙醇、己酸己酯、己酸-順-3-己烯酯、己酸-反-2-己烯酯、苯甲酸己酯、苯甲酸-3-己烯-1-酯和苯甲酸反-2-己烯酯等成分在做青和殺青工藝中大量轉(zhuǎn)化生成，是賦予大紅袍濃郁花果香的主要香氣成分，也是與大紅袍品種特征密切關(guān)聯(lián)的香氣成分。另外，有人研究了不同焙火溫度對(duì)大紅袍香氣的影響[1，14]，結(jié)果表明：在較高的焙火溫度下，酯類和雜環(huán)化合物含量相對(duì)較高，特別是雜環(huán)化合物中具有焦香與蜜香氣味特征的吡嗪類、呋喃類等物質(zhì)均隨溫度的升高呈現(xiàn)明顯增加的趨勢(shì)。

雖然茶葉中含有成百上千種揮發(fā)性化合物，但是由于氣味閾值及香氣特征迥異，僅有少數(shù)低閾值且高含量的化合物可被人體嗅聞系統(tǒng)所感知，且對(duì)茶葉香氣品質(zhì)的形成起到直接的促進(jìn)作用，這類化合物稱之為“香氣活性化合物”[15]。香氣活性化合物的鑒定方法主要包括氣相色譜-嗅覺測(cè)量技術(shù)（GC-O）、香氣活性值法（Odor Activity Value，OAV）、香氣化合物重組以及香氣化合物添加/缺失試驗(yàn)等[16]。GC-O 技術(shù)可將GC 的分離能力與人類鼻子的靈敏性結(jié)合，通過專業(yè)審評(píng)員嗅聞，確定各化合物對(duì)香氣的實(shí)際貢獻(xiàn)，通常與質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用來確定關(guān)鍵活性香氣成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)、香氣特征及氣味強(qiáng)度等。目前，不同類型綠茶[17-18]、紅茶[19]、普洱茶[20]以及鳳凰單叢[21]等多種茶葉中的關(guān)鍵香氣活性成分已通過GC-O 手段被系統(tǒng)查明。相比之下，大紅袍中的香氣活性成分卻鮮見報(bào)道，而更深層次的新、陳大紅袍中的關(guān)鍵差異性香氣活性成分更是尚未明晰，限制了人們對(duì)大紅袍香氣物質(zhì)基礎(chǔ)的科學(xué)認(rèn)知。本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（HS-SPMEGC-MS）分析新、陳年大紅袍樣品的整體香氣組成，采用GC-O 方法分析鑒定它們的香氣活性成分，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析手段明確其關(guān)鍵差異性香氣活性成分，以期豐富茶葉香氣化學(xué)基礎(chǔ)理論體系，并為新、陳大紅袍的鑒別及儲(chǔ)藏年份判別等質(zhì)量控制方面提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

茶葉樣品：選用由大紅袍茶樹品種制備的試驗(yàn)當(dāng)年（2018 年）新大紅袍5 個(gè)。加工工藝流程為：鮮葉→萎凋→做青→殺青→揉捻→烘干（初烘，攤晾，復(fù)烘）→毛茶→精制。樣品編號(hào)為NDHP1～N-DHP5；2013 年陳年大紅袍3 個(gè)，來源于福建武夷山市永生茶業(yè)有限公司，茶樹品種與加工工藝與新大紅袍一致，樣品貯存標(biāo)準(zhǔn)符合GB/T 30375-2013，編號(hào)為A-DHP1～A-DHP3。上述茶樣均用研磨機(jī)磨粉后過40 目篩。GC-O 樣品為茶葉混合樣，新大紅袍混合樣為5 個(gè)大紅袍樣品磨粉后等比例混合，陳年大紅袍混合樣為3 個(gè)陳年大紅袍樣品磨粉后等比例混合。所有樣品保存于4 ℃冰箱備用。

試劑、耗材：正構(gòu)烷烴C8-C40 混合標(biāo)準(zhǔn)品，北京百靈威科技有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)。HS-SPME 萃取頭型號(hào)為65 μm PDMS/DVB涂層纖維萃取頭，美國(guó)Supelco 公司；20 mL 頂空萃取瓶，美國(guó)Agilent 公司。

1.2 儀器設(shè)備

GC-MS 分析儀（Agilent 7890B-5977B），美國(guó)Agilent 公司；自動(dòng)化HS-SPME 裝置裝載于GCMS 儀配備的自動(dòng)前處理平臺(tái)MPS-2，德國(guó)Gerstel 公司；GC-O/MS 分析通過MPS-2 平臺(tái)上連接的嗅覺檢測(cè)端口ODP-3（德國(guó)Gerstel 公司）完成；研磨機(jī)（Tube Mill Control），德國(guó)IKA 公司；分析電子天平（SQP 型），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 GC-MS 樣品前處理 參考Kang 等[19]的方法，采用HS-SPME 方法對(duì)茶葉中香氣成分進(jìn)行萃取。準(zhǔn)確稱取茶葉樣品1.00 g 至20 mL 頂空萃取瓶中，加入6.0 mL 沸水沖泡后立即置于MPS-2前處理平臺(tái)的恒溫金屬孵化器中，設(shè)置平衡時(shí)間為3.0 min，孵化溫度為60 ℃，萃取時(shí)間為60 min，解析附時(shí)間為5.0 min。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.3.2 GC-MS 分析 GC 條件：色譜柱為HP-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm，美國(guó)Agilent 公司）；進(jìn)樣口和傳輸線溫度均為250 ℃；載氣為高純度氦氣，純度≥99.99%，柱流量為1.6 mL/min，不分流進(jìn)樣，升溫程序：初始柱溫50 ℃，保持3 min，以4 ℃/min 升溫至265 ℃，保持5 min，總分析時(shí)間為60.75 min。

MS 條件：EI 電離能量：-70 eV；質(zhì)量掃描范圍：33～600 u；離子源溫度：220 ℃。

GC-MS 定性：采用NIST 2014 譜庫(kù)檢索結(jié)合保留指數(shù)（Retention Index，RI）驗(yàn)證，對(duì)所分離的香氣化合物進(jìn)行定性，保留RI 文獻(xiàn)值和計(jì)算值差值小于20 的化合物[22]。

香氣化合物含量計(jì)算：采用峰面積歸一法計(jì)算各化合物的相對(duì)百分含量。計(jì)算公式為：含量（%）=（化合物峰面積/可定性的所有化合物峰面積總和）×100%。

1.3.3 GC-O/MS 分析 茶葉香氣萃取物經(jīng)GC 分離后，1 ∶1 分流分別進(jìn)入嗅聞端及質(zhì)譜端，GC 及MS 部分的參數(shù)條件與1.3.2 節(jié)中GC-MS 條件相同；嗅聞端的嗅聞口及傳輸線的溫度分別設(shè)為200 ℃及250 ℃；高純氮?dú)猓兌取?9.99%）作為GC-O 補(bǔ)償氣，流速設(shè)置為50 mL/min。

GC-O 嗅聞試驗(yàn)由6 名經(jīng)驗(yàn)豐富的審評(píng)員完成，其中4 名女性、2 名男性，年齡在24～40 歲之間。所有審評(píng)員都經(jīng)過30 h 以上的聞香培訓(xùn)，對(duì)GC-O 嗅聞試驗(yàn)有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。6 名審評(píng)員分別對(duì)新大紅袍和陳年大紅袍混合樣進(jìn)行嗅聞，并記錄氣味描述和香氣強(qiáng)度（Aroma Intensity，AI）。GC-O 嗅覺檢測(cè)端口ODP-3 連接帶有1、2、3、4 不同數(shù)字按鍵標(biāo)記的手柄，審評(píng)員根據(jù)香氣強(qiáng)度強(qiáng)弱選擇手柄上對(duì)應(yīng)的數(shù)字按鍵?！?”表示香氣強(qiáng)度“弱”，“2”表示香氣強(qiáng)度“中等”，“3”表示香氣強(qiáng)度“強(qiáng)”，“4”表示香氣強(qiáng)度“非常強(qiáng)”。隨后對(duì)6 名審評(píng)員的嗅聞結(jié)果進(jìn)行匯總和綜合分析，篩選出同一時(shí)間區(qū)間內(nèi)至少有3 名審評(píng)員可以聞到且氣味特征描述相似的氣味，再通過NIST 譜庫(kù)檢索、保留指數(shù)以及文獻(xiàn)和網(wǎng)站氣味描述驗(yàn)證等方式對(duì)嗅聞到的化合物進(jìn)行定性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013（美國(guó)微軟公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)初步處理，計(jì)算平均含量（Mean）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（Standard Deviation，SD）以及繪制餅圖和柱狀圖等。采用SPSS Statistics 20.0（美國(guó)IBM 公司）、SIMCA 14.1（瑞典Umetrics 公 司）及MultiExperiment Viewer 4.8.1（美國(guó)Oracle 公司）對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 新大紅袍和陳年大紅袍中香氣成分的GCMS 分析

采用GC-MS 技術(shù)對(duì)新大紅袍和陳年大紅袍中的香氣成分進(jìn)行鑒定。圖1a 和1b 分別為新大紅袍和陳年大紅袍香氣成分的總離子流圖。經(jīng)NIST 2014 質(zhì)譜庫(kù)自動(dòng)檢索后，初步確定新大紅袍和陳年大紅袍中336 個(gè)色譜峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)。然后通過對(duì)比保留指數(shù)（RI）文獻(xiàn)值和計(jì)算值，保留二者差值小于20 的化合物，從而實(shí)現(xiàn)大紅袍和陳年大紅袍香氣成分的精確定性分析。最終在兩種大紅袍中共鑒定出185 種香氣化合物，包括醛類（25 種），含氮化合物（19 種），芳香烴類（12 種），酯類（32 種），酮類（26 種），烯烴類（29 種），醇類（14 種），烷烴類（12 種），氧雜環(huán)化合物（8 種），內(nèi)酯類（4 種），酚類（2 種），含硫化合物（1 種）以及有機(jī)酸類（1 種）等。

圖1 新大紅袍（a）和陳年大紅袍（b）香氣成分的總離子流圖Fig.1 The total ion chromatorgraphy of new and aged Dahongpao oolong teas

各類別化合物相對(duì)含量如圖2 所示。在新大紅袍（a）和陳年大紅袍（b）樣品中，均以醛類化合物的相對(duì)含量最高，分別占所有香氣化合物的30.44%和33.27%。在新大紅袍樣品中，含氮化合物相對(duì)含量排名第2 位，占所有香氣化合物的16.29%，芳香烴類化合物相對(duì)含量為14.01%，排名第3 位；而在陳年大紅袍樣品，以芳香烴類化合物排名第2 位，占所有香氣成分的15.57%，含氮化合物相對(duì)含量排名第3 位（13.23%）；酯類和酮類化合物含量也相對(duì)較高，均占所有香氣化合物的10%以上。其次是烯烴類化合物，它們?cè)谛麓蠹t袍和陳年大紅袍樣品中相對(duì)含量分別為5.16%和4.48%。以上6 類化合物相對(duì)含量總和占所有香氣成分的90%以上。其余7 類化合物相對(duì)含量總和不足所有香氣成分的10%，各類化合物含量在0.02%～4.24%之間，它們按照醇類＞烷烴類＞氧雜環(huán)化合物＞內(nèi)酯類＞酚類＞含硫化合物＞有機(jī)酸類的規(guī)律分布于新大紅袍和陳年大紅袍樣品中。

圖2 新大紅袍（a）和陳年大紅袍（b）中各類香氣化合物的相對(duì)含量分布Fig.2 The relative content distribution of each category of aroma compounds in new and aged Dahongpao oolong teas

2.2 新大紅袍和陳年大紅袍香氣成分含量差異比較

新大紅袍和陳年大紅袍中鑒定出的香氣化合物及其相對(duì)含量如表1 所示。在醛類化合物中，糠醛相對(duì)含量最高，在新大紅袍和陳年大紅袍中含量高達(dá)8.91%和11.71%之多。反，反-2，4-庚二烯醛（7.46%，7.14%；前為新大紅袍含量，后為陳年大紅袍含量，下同）、5-甲基糠醛（4.68%，5.46%）、苯甲醛（4.34%，3.89%）及己醛（1.48%，1.42%）含量也相對(duì)較高，其余化合物含量均在1.00%以下。在含氮化合物中，茶吡咯含量排名第一，在大紅袍和陳年大紅袍中分別占所有香氣成分含量的5.38%和6.00%，苯乙腈（4.54%，2.38%）含量次之，咖啡因（1.40%，0.95%）含量居第3 位，其余化合物的含量在兩種大紅袍中均低于1%。在芳香烴類化合物中，1，1，6-三甲基-1，2-二氫萘（4.27%，5.24%）含量最高，間二甲苯（3.06%，2.44%）和對(duì)傘花烴（2.50%，3.15%）含量緊隨其后，1，3-二叔丁基苯（1.42%，1.80%）和甲苯（1.29%，1.03%）在新大紅袍和陳年大紅袍中相對(duì)含量大于1%。

水楊酸甲酯（3.57%，4.72%；酯類）、苯丙酮（1.29%，2.88%；酮類）、檸檬烯（1.28%，1.22%；烯烴類）、苯乙醇（1.32%，0.77%；醇類）、十二烷（0.50%，0.81%；烷烴類）、2-乙酰基呋喃（1.01%，0.86%；氧雜環(huán)化合物）、二氫獼猴桃內(nèi)酯（1.03%，1.20%；內(nèi)酯類）是相應(yīng)類別化合物中含量最高的揮發(fā)性物質(zhì)。此外，酚類、含硫化合物和有機(jī)酸類的化合物數(shù)目少，含量也普遍較低，所有化合物相對(duì)含量均在0.08%以下。

2.3 新大紅袍和陳年大紅袍關(guān)鍵差異性香氣成分的鑒定

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）是多變量數(shù)據(jù)分析的一種常用的重要方法[24]， 主要通過降維手段， 將大量的多維數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為可以直觀觀察的樣品分布散點(diǎn)圖（主成分得分圖），從而可以直觀看出各個(gè)觀測(cè)變量或各組觀測(cè)變量的靠近程度。它是一種非監(jiān)督模式多變量統(tǒng)計(jì)分析方法[25]。偏最小二乘法判別分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA）是一種常用的有監(jiān)督模式的統(tǒng)計(jì)分析方法， 它通過人為加入分組變量， 強(qiáng)化了組間差異。PLS-DA 變量重要性因子（Variable Important for the Projection，VIP）可以量化PLS-DA 模型中每個(gè)變量對(duì)分組的貢獻(xiàn)，通常VIP 值大于1的化合物，可作為分組變量互相區(qū)分的關(guān)鍵特征成分[26-27]。PCA 和PLS-DA 兩種模型結(jié)合使用，相互驗(yàn)證，可以使得分類結(jié)果更科學(xué)合理。

本研究采用多元統(tǒng)計(jì)分析手段對(duì)新、陳大紅袍中鑒定出的185 種共有香氣化合物進(jìn)行分析，首先基于香氣成分的定量離子峰面積建立了PCA 模型（擬合參數(shù)為R2X=0.896，Q2=0.617），通過PCA 得分圖（圖3a）可見，新大紅袍和陳年大紅袍兩組樣品可以得到較好的區(qū)分，說明兩個(gè)組別的大紅袍樣品的香氣物質(zhì)基礎(chǔ)存在顯著性差異。為了查明兩組別樣品間的具體差異性香氣成分， 進(jìn)一步建立了PLS-DA 模型（擬合參數(shù)為R2X=0.942，Q2=0.840），通過該模型更好地的區(qū)分了新大紅袍和陳年大紅袍兩組樣品（圖3b），并且鑒定出區(qū)分兩組樣品的40 種關(guān)鍵變量（VIP＞1）。為了避免模型“過擬合”，進(jìn)一步對(duì)PLS-DA模型進(jìn)行200 次的交叉驗(yàn)證， 結(jié)果表明該驗(yàn)證模型Q2回歸直線與Y軸的截距均小于零（R2=0.288，Q2=-0.340），說明了該模型的可靠性。進(jìn)一步對(duì)上述40 種關(guān)鍵變量進(jìn)行Mann-Whitney U 非參數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果表明共有31 種香氣化合物在新大紅袍和陳年大紅袍兩組樣品之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。這些關(guān)鍵差異香氣成分（表1 標(biāo)注*）包括苯乙腈、順-3-己酸己烯酯、苯丙酮、苯甲醛、反，反-2，4-庚二烯醛、反-β-紫羅蘭酮、己酸己酯、2-糠酸甲酯、反-橙花叔醇、苯乙醇、反-2-己酸己烯酯、反，反-3，5-辛二烯-2-酮、吲哚、1-硝基-2-乙苯、β-月桂烯、2-乙?；秽?、3，5-辛二烯-2-酮、2-甲基丁酸己酯、2，6-二甲基-2，6-辛二烯、橙花醇、丁酸苯乙酯、α-紫羅蘭酮、β-環(huán)檸檬醛、2-甲基丁酸-2-苯乙酯、芳樟醇、檸檬烯、3，5-二甲基-2-乙基-吡嗪、十二烷、壬醛、萘和乙酸苯乙酯。

圖3 新大紅袍和陳年大紅袍香氣成分的PCA 得分圖（a）和PLS-DA 得分圖（b）Fig.3 PCA score plot（a）and PLS-DA score plot（b）of aroma compounds in new and aged Dahongpao oolong teas

為了直觀地展示這些關(guān)鍵差異香氣化合物在新大紅袍和陳年大紅袍中的分布規(guī)律， 我們采用層序聚類分析（Hierarchical ClusterAnalysis，HCA）對(duì)這些成分進(jìn)行了分析（圖4），圖中橫向表示新大紅袍（N-DHP）和陳年大紅袍（A-DHP）樣品編號(hào)，每個(gè)樣品重復(fù)3 次（編號(hào)-1，-2，-3），縱向?yàn)殛P(guān)鍵差異化合物根據(jù)聚類趨勢(shì)自動(dòng)排布。黃色表示化合物在樣品中含量高于平均值，黃色越深表示含量越高；藍(lán)色代表化合物在樣品中含量低于平均值， 藍(lán)色越深表示含量越低。從圖中可以看出，這些化合物分布具有較強(qiáng)的規(guī)律性，基本可被分為兩組。苯丙酮、2-糠酸甲酯、十二烷和萘在陳年大紅袍中含量顯著高于新大紅袍中；而其余27 種化合物包括2-乙?；秽?、3，5-二甲基-2-乙基-吡嗪、2，6-二甲基-2，6-辛二烯、β-月桂烯、β-環(huán)檸檬醛、檸檬烯、順-3-己酸己烯酯、2-甲基丁酸己酯、2-甲基丁酸-2-苯乙酯、芳樟醇、壬醛、反，反-3，5-辛二烯-2-酮、反，反-2，4-庚二烯醛、3，5-辛二烯-2-酮、苯甲醛、苯乙醇、橙花醇、反-β-紫羅蘭酮、α-紫羅蘭酮、苯乙腈、反-橙花叔醇、己酸己酯、反-2-己酸己烯酯、1-硝基-2-乙苯、丁酸苯乙酯、吲哚和乙酸苯乙酯等在新大紅袍中含量顯著高于陳年大紅袍中。由此可見，雖然在化合物種類分布上，新、陳大紅袍并無明顯差異， 但陳年大紅袍的揮發(fā)性化合物的含量普遍低于新大紅袍， 推測(cè)與儲(chǔ)藏過程中大紅袍內(nèi)含的香氣物質(zhì)隨著環(huán)境條件的改變而緩慢揮發(fā)或轉(zhuǎn)化有關(guān)。

圖4 新大紅袍和陳年大紅袍中關(guān)鍵差異成分熱圖Fig.4 Heat map of key aroma compounds with statistical differences in new and aged Dahongpao oolong teas

2.4 新大紅袍和陳年大紅袍中香氣活性成分的GC-O 分析

為鑒定出對(duì)大紅袍香氣品質(zhì)起到直接貢獻(xiàn)作用的香氣活性化合物，分別對(duì)新大紅袍和陳年大紅袍樣品的混合樣進(jìn)行GC-O 分析。針對(duì)可被3名及以上審評(píng)員聞到的氣味進(jìn)行綜合分析，最終有45 種香氣活性成分被鑒定出來，包括醛類化合物11 種，酮類10 種，含氮化合物5 種，酯類5 種，烯烴類5 種，醇類3 種以及芳香烴、氧雜環(huán)和內(nèi)酯類化合物各2 種。6 名審評(píng)員對(duì)新大紅袍和陳年大紅袍樣品中香氣活性化合物的氣味描述和香氣強(qiáng)度（AI）打分如表2 所示。

表2 新大紅袍和陳年大紅袍中香氣活性成分的氣味特征及強(qiáng)度Table 2 The odor descriptors and aroma intensity of aroma-active components in new and aged Dahongpao oolong teas

在新大紅袍樣品中，鑒定出41 種香氣活性化合物，且有16 種化合物香氣強(qiáng)度可達(dá)到“3”及以上。其中具有甜花香和焦糖香的苯乙酮香氣強(qiáng)度最高（3.4），其次對(duì)傘花烴（甜花香）、反，反-3，5-辛二烯-2-酮（甜香、花果香）、3，5-二甲基-2-乙基-吡嗪（烘烤香，咖啡）、2-甲基-3，5-二乙基-吡嗪（烘烤香、堅(jiān)果）和水楊酸甲酯（冬青、薄荷、青草）香氣強(qiáng)度也較高（3.3）。此外，香氣強(qiáng)度可達(dá)到“3”的化合物還有反，順-2，6-壬二烯醛（青臭、清新草本）、庚醛（脂肪、青草）、2，5-二甲基-吡嗪（烘烤香、堅(jiān)果）、3，5-辛二烯-2-酮（蘑菇、鮮果）壬醛（清新黃瓜、花果香）、苯乙醇（玫瑰花香、甜花香）、吲哚（清新花香）、己酸己酯（清新草本、甜果香）、香豆素（甜香、香草）和反-β-紫羅蘭酮（甜花香、奶香）。值得注意的是2-甲基-3，5-二乙基-吡嗪、吲哚、2-乙?；秽ê婵鞠?、咖啡，2.8）、反-β-羅勒烯（清甜、草本香，2.8）和菖蒲烯（清爽，2.0）雖然在兩種大紅袍樣品中均可被檢測(cè)到，但僅在新大紅袍中能夠被嗅聞到，被認(rèn)為是新大紅袍的特征性香氣活性化合物，其中吲哚和2-甲基-3，5-二乙基-吡嗪具有較高的香氣強(qiáng)度，可能對(duì)大紅袍香氣品質(zhì)的形成起到更重要的作用。

由上述結(jié)果可知，新大紅袍中的香氣活性化合物多數(shù)呈現(xiàn)烘烤香、甜香、花果香和清新等氣味特點(diǎn)，這些化合物以不同濃度形式組合形成了武夷巖茶特有的"巖韻"。其中烘烤香的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)是吡嗪類化合物，這類化合物往往源于茶葉加工過程中發(fā)生的劇烈熱化學(xué)作用，在熱化學(xué)作用下易生成吡嗪類、吡咯類、喹啉類及吡啶類等香氣物質(zhì)[28]。吡嗪類化合物通常認(rèn)為是茶葉中的氨基酸與兒茶素等在高溫下發(fā)生“美拉德” 反應(yīng)的產(chǎn)物。吲哚屬苯并吡咯類化合物，它的呈香特性與濃度有關(guān)，通常在高濃度時(shí)具有強(qiáng)烈的令人不快的臭味，但在低濃度時(shí)則具有花香[29]，是色氨酸參與的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。有研究表明，吲哚主要形成于大紅袍初制過程中的做青和殺青工藝，是賦予大紅袍濃郁花果香的主要香氣成分[13]。此外，苯乙醇（玫瑰花香、甜花香）及己酸己酯（清新草本、甜果香）也是大紅袍“花果香”的主要貢獻(xiàn)成分，前者主要源于茶樹次生代謝的莽草酸合成途徑，后者通過醇類物質(zhì)與乙酰輔酶A 的生物作用生成，其前體物質(zhì)主要源于脂肪酸合成代謝途徑[28]。

在陳年大紅袍樣品中，鑒定出40 種香氣活性化合物，大部分成分在大紅袍中也可被嗅聞到，但香氣強(qiáng)度達(dá)到“3”及以上的化合物相比大紅袍更少，只有6 種，包括反，反-3，5-辛二烯-2-酮（甜香、花果香，3.3）、壬醛（清新黃瓜、花果香，3.3）、反-2-壬醛（青臭、油脂，3.2）、3，5-辛二烯-2-酮（蘑菇、鮮果，3.0）、反-β-紫羅蘭酮（甜花香、奶香，3.0）和辛醛（清新、果香、木香，3.0），除辛醛以外，其它5 種嗅感化合物在大紅袍中同樣有著較強(qiáng)的香氣強(qiáng)度。而新大紅袍中較為突出的烘烤香型化合物（如吡嗪類、2-乙?；秽龋┰陉惸甏蠹t袍中的香氣強(qiáng)度大部分較低，甚至無法被嗅聞到，這可能是陳年大紅袍香氣品質(zhì)更為柔和且協(xié)調(diào)的重要原因。此外，值得注意的是苯甲酸甲酯（花果香、冬青，1.8）、2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮（清甜、木頭，2.0）、反-2-癸烯醛（青臭、微甜，2.7）和反，反-2，4-癸二烯醛（油脂、清新草本，2.5）等幾種成分雖然在兩種大紅袍樣品中均可被檢測(cè)到，但是它們?cè)陉惸甏蠹t袍中含量均高于在新大紅袍中的含量（表1），并且僅在陳年大紅袍中被嗅聞到，因此認(rèn)為它們是陳年大紅袍的特征性香氣活性成分。茶葉中的許多酮類化合物源于類胡蘿卜素的降解，貯藏過程中的光照、溫度等變化可能促進(jìn)大紅袍中的類胡蘿卜素衍生物發(fā)生復(fù)雜的降解反應(yīng)，從而導(dǎo)致某些酮類成分的生成[28]。類似地，陳年大紅袍中特有的部分脂肪醛類化合物可能源自茶葉儲(chǔ)藏過程中飽和或不飽和脂肪酸的氧化降解。關(guān)于陳年大紅袍特征香氣成分的研究罕見報(bào)道，但有研究表明，3，5-辛二烯-2-酮和2，4-庚二烯醛等較小分子質(zhì)量的酮和醛類物質(zhì)是陳（綠）茶中的特征香氣物質(zhì)[28，30]；此外，反-2-癸烯醛等成分曾被證實(shí)在黑茶陳化過程中含量有一定程度的提高[31]。

2.5 新大紅袍和陳年大紅袍的關(guān)鍵差異性香氣活性成分分析

由于茶葉香氣化合物種類繁多、成分復(fù)雜，本研究通過降維手段將GC-MS 鑒定出的185 種香氣化合物聚焦到31 種關(guān)鍵差異香氣成分上（圖4），然后將這些關(guān)鍵差異香氣成分與GC-O 鑒定出的45 種香氣活性化合物（表2）綜合分析，發(fā)現(xiàn)2-乙?；秽?，5-二甲基-2-乙基-吡嗪、芳樟醇、壬醛、反，反-3，5-辛二烯-2-酮、3，5-辛二烯-2-酮、苯乙醇、反-β-紫羅蘭酮、α-紫羅酮、己酸己酯、反-2-己酸己烯酯、吲哚、乙酸苯乙酯和萘等14 種化合物既在新、陳兩組大紅袍樣品之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)又可通過GC-O 被實(shí)際嗅聞到。由于儀器檢測(cè)存在一定的不穩(wěn)定性，且GC-O 分析受審評(píng)人員主觀性影響，因此這兩部分試驗(yàn)結(jié)果難免出現(xiàn)不一致的情況。為最大程度減少誤差且準(zhǔn)確鑒定出兩種大紅袍中的關(guān)鍵差異性香氣活性化合物，接下來結(jié)合新大紅袍和陳年大紅袍兩組樣品的平均峰面積和GC-O 香氣強(qiáng)度值（AI）對(duì)這些化合物進(jìn)行綜合分析。

在圖5 中，上、下兩個(gè)縱坐標(biāo)分別表示定量離子峰面積和香氣強(qiáng)度值（AI），柱狀圖中藍(lán)色代表新大紅袍，紅色代表陳年大紅袍，通過比較上、下兩組柱狀圖，可以直觀看出每個(gè)化合物峰面積與其香氣強(qiáng)度值（AI）的對(duì)應(yīng)關(guān)系。如圖所示，2-乙酰基呋喃、3，5-二甲基-2-乙基-吡嗪、芳樟醇、苯乙醇、乙酸苯乙酯、吲哚和己酸己酯等7 種化合物的峰面積與香氣強(qiáng)度值均呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)，說明它們對(duì)于區(qū)分新大紅袍和陳年大紅袍香氣具有重要貢獻(xiàn)，是區(qū)分新、陳大紅袍的關(guān)鍵差異性香氣活性成分。而且這些化合物在新大紅袍中的峰面積和香氣強(qiáng)度值均明顯高于陳年大紅袍中，它們通常表現(xiàn)為烘烤香、花香、甜香等愉悅的氣味特征。雖然通過GC-O 等手段對(duì)大紅袍中關(guān)鍵呈香成分的研究較少，但有研究表明，這些化合物是某些茶葉中的重要呈香成分。比如，芳樟醇是茶葉中常見的關(guān)鍵呈香成分之一，它是一種單萜烯醇類物質(zhì)，具有令人愉悅的花香，其在多種茶類特征香氣研究中已受到較多關(guān)注[23，32-34]；苯乙醇等是碧螺春[35]和工夫紅茶[32]中的關(guān)鍵活性香氣成分；吲哚等則是西湖龍井[36]和金萱烏龍茶[33]中的特征香氣成分。此外，另有研究學(xué)者通過OAV 計(jì)算法結(jié)合香氣重組試驗(yàn)等方法證實(shí)了3，5-二甲基-2-乙基-吡嗪是武夷巖茶（水仙品種）中烘烤香的關(guān)鍵香氣活性化合物[37]。本研究通過化學(xué)計(jì)量學(xué)方法與嗅聞技術(shù)相結(jié)合，最終查明區(qū)分新大紅袍和陳年大紅袍的關(guān)鍵香氣活性成分，其對(duì)于明晰新大紅袍和陳年大紅袍的香氣實(shí)質(zhì)具有重要意義，也為新、陳茶的鑒別及茶葉儲(chǔ)藏年份的判別提供了新思路。

圖5 新大紅袍和陳年大紅袍中關(guān)鍵香氣活性成分的峰面積與香氣強(qiáng)度（AI）對(duì)比Fig.5 The comparison of peak areas and aroma intensity of key aroma-active components in new and aged Dahongpao oolong teas

然而，具有清新花果香、甜香或奶香等愉悅的氣味特性的壬醛、反，反-3，5-辛二烯-2-酮、3，5-辛二烯-2-酮、反-β-紫羅蘭酮、α-紫羅蘭酮和反-2-己酸己烯酯等化合物雖然它們可以通過GC-O鑒定出來，而且香氣活性值也普遍較高（2.5～3.3），但是其峰面積與香氣強(qiáng)度值變化趨勢(shì)并不相同。究其原因，一方面可能是因?yàn)镚C-O 分析結(jié)果在一定程度上受到人為因素的影響。每個(gè)人對(duì)氣味的敏感程度不同，因此各個(gè)審評(píng)員對(duì)氣味等級(jí)的界定具有一定的主觀性，導(dǎo)致在香氣強(qiáng)度值認(rèn)定上存在一定偏差。再者審評(píng)員在持續(xù)幾十分鐘的長(zhǎng)時(shí)間嗅聞過程中很難保證做到完全集中精力并且捕捉到所有氣味，因此不足3 個(gè)以上審評(píng)員捕捉到的氣味，并不能被準(zhǔn)確鑒定出來。另一方面，由于大紅袍樣品間存在個(gè)體差異，導(dǎo)致不同樣品中的香氣物質(zhì)含量也有所不同，為了最大限度萃取出香氣活性化合物，GC-O 分析采用的茶樣為混合樣，加之萃取纖維材料的萃取容量有限，存在一定的競(jìng)爭(zhēng)吸附性，因此GC-O 嗅聞到的香氣活性成分濃度可能與單一樣品的含量存在一定的差異性。這兩方面原因均可能導(dǎo)致部分化合物的峰面積與香氣強(qiáng)度值變化趨勢(shì)不一致，但是不可否認(rèn)它們對(duì)新大紅袍和陳年大紅袍香氣特征形成也具有較為重要的作用。

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-GC-MS 結(jié)合GC-O/MS 技術(shù)分析了新、陳大紅袍樣品中的香氣組成及香氣活性成分，共鑒定出新、陳大紅袍樣品中的185 種香氣化合物及45 種香氣活性化合物，發(fā)現(xiàn)2-甲基-3，5-二乙基-吡嗪、吲哚、2-乙酰基呋喃、反-β-羅勒烯和菖蒲烯僅在新大紅袍中能夠被嗅聞到，是新大紅袍的特征性香氣活性化合物；苯甲酸甲酯、2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮、反-2-癸烯醛和反，反-2，4-癸二烯醛是陳年大紅袍中的特征性香氣活性化合物；綜合比較分析GC-MS及GC-O/MS 結(jié)果，可知2-乙酰基呋喃、3，5-二甲基-2-乙基-吡嗪、芳樟醇、苯乙醇、乙酸苯乙酯、吲哚和己酸己酯是區(qū)分新、陳大紅袍的關(guān)鍵差異性香氣活性成分。本研究有助于人們從更深層次上了解大紅袍和陳年大紅袍香氣品質(zhì)特征的化學(xué)實(shí)質(zhì)，深化茶葉化學(xué)理論知識(shí)體系，為今后茶葉香氣品質(zhì)調(diào)控以及“新陳茶”的科學(xué)評(píng)判提供一定的科學(xué)借鑒。