宰后肌肉嫩度檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

狄雨晗　廖博群　李加慧　張雅瑋

摘 要：嫩度作為評(píng)價(jià)肉品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，影響消費(fèi)者對(duì)于肉制品的購(gòu)買選擇。對(duì)宰后肉品的組成結(jié)構(gòu)、蛋白特性進(jìn)行檢測(cè)，可以準(zhǔn)確判定肉品嫩化程度。本文就宰后成熟過(guò)程中各類肌肉蛋白質(zhì)的變化及其嫩化作用、現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)及相關(guān)機(jī)理進(jìn)行綜述，討論目前技術(shù)存在的局限性，為研發(fā)新型嫩度檢測(cè)技術(shù)提供理論參考。

關(guān)鍵詞：肌肉蛋白質(zhì)；檢測(cè)技術(shù)；肉的嫩度；肉品質(zhì)；宰后嫩化

Advances in Techniques for Testing Postmortem Muscle Tenderness

DI Yuhan， LIAO Boqun， LI Jiahui， ZHANG Yawei*

（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract： Tenderness is one of the most important indicators of meat quality and influences consumers choice of meat products. Meat tenderness can be determined accurately by testing the composition， structure and protein characteristics of postmortem meat. This paper presents a review of the changes in various muscle proteins during postmortem aging， their roles in meat tenderization， the existing detection techniques for meat tenderness and the related mechanisms， and discusses the limitations of the current techniques. It is hoped that this review will provide a theoretical reference for the development of new tenderness detection techniques.

Keywords： muscle proteins; detection techniques; meat tenderness; meat quality; postmortem tenderization

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230509-041

中圖分類號(hào)：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2023）07-0052-08

引文格式：

狄雨晗， 廖博群， 李加慧， 等. 宰后肌肉嫩度檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 肉類研究， 2023， 37（7）： 52-59. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230509-041.? ? http：//www.rlyj.net.cn

DI Yuhan， LIAO Boqun， LI Jiahui， et al. Advances in techniques for testing postmortem muscle tenderness[J]. Meat Research， 2023， 37（7）： 52-59. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230509-041.? ? http：//www.rlyj.net.cn

肉品的食用品質(zhì)可以通過(guò)感官評(píng)定和客觀測(cè)定的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)檢測(cè)肉品嫩度、風(fēng)味、色澤和多汁性等指標(biāo)，反映肉品食用價(jià)值[1]。嫩度作為評(píng)價(jià)肉質(zhì)優(yōu)劣及優(yōu)質(zhì)畜禽肉選種的重要指標(biāo)，展現(xiàn)了肌肉組織的機(jī)械強(qiáng)度，包括蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性、脂肪的數(shù)量及分布等[2-4]。

研究影響嫩度的關(guān)鍵因子、檢測(cè)技術(shù)以及提高肉品嫩度是國(guó)內(nèi)外肉品加工科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。肉品嫩度受到宰前因素和宰后因素的共同影響，宰前因素包括畜禽品種、年齡、性別、飼養(yǎng)條件及宰前狀況等；動(dòng)物宰后處理過(guò)程中的影響因素包括排酸時(shí)間、貯藏溫度、嫩化技術(shù)及烹調(diào)方式等[5-8]。肉品在宰后成熟的過(guò)程中會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，肉的嫩化是鈣激活酶、細(xì)胞凋亡酶、過(guò)氧化物還原酶等多種內(nèi)源酶共同調(diào)控的結(jié)果[9-12]，多種酶的共同作用使得肌原纖維蛋白發(fā)生降解，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失[13]。因此，深入研究宰后肌肉蛋白質(zhì)的變化是理解肉品嫩化機(jī)制的關(guān)鍵。

借助現(xiàn)代儀器對(duì)肌肉的物理、生化和組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，能夠客觀、定量化地評(píng)定肉品嫩度[14]。常見的嫩度測(cè)定方法包括剪切力法、光譜分析、質(zhì)地剖面分析（texture profile analysis，TPA）等，這些傳統(tǒng)檢測(cè)方法也存在一定局限性。例如，剪切力法是最早、最常用的機(jī)械測(cè)定方法[1]，但也存在難以區(qū)分不同處理組間肌肉嫩度差異的問題[15-17]。關(guān)于宰后肉品嫩度的檢測(cè)技術(shù)很多，綜合國(guó)內(nèi)外學(xué)者的相關(guān)研究，本文就有關(guān)反映肌肉蛋白質(zhì)變化的嫩度檢測(cè)技術(shù)及其原理等方面進(jìn)行綜述，為改進(jìn)和開發(fā)肉品嫩度檢測(cè)技術(shù)提供思路。

1 宰后成熟過(guò)程中肌肉蛋白質(zhì)的變化對(duì)嫩度的影響

1.1 肉的嫩度

畜禽宰后會(huì)發(fā)生由僵直、解僵到成熟一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)過(guò)程，肌肉組織的生化條件會(huì)發(fā)生較大轉(zhuǎn)變。宰后早期肉品逐步進(jìn)入僵直階段，肌纖維收縮導(dǎo)致肌節(jié)長(zhǎng)度明顯減小，肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白交聯(lián)導(dǎo)致硬度明顯增大[18-19]，嫩度降低。僵直持續(xù)時(shí)間受到三磷酸腺苷（ATP）、糖原儲(chǔ)備等因素的影響[20]，在僵直結(jié)束時(shí)肉品達(dá)到極限pH值，肉品嫩度最小，口感最差。隨著肌肉解僵進(jìn)入成熟期，維持肌原纖維完整性的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，如肌聯(lián)蛋白、伴肌動(dòng)蛋白等被鈣蛋白酶降解[21]，肌肉超微結(jié)構(gòu)受到破壞，大部分Z線斷裂，M線和I帶消失[22]，H區(qū)模糊難辨，肌原纖維小片化程度增加，肉品持水能力和嫩度增加。針對(duì)肉品成熟機(jī)制，有學(xué)者提出四大成熟理論：鈣蛋白酶理論、溶酶體組織蛋白酶理論、細(xì)胞凋亡酶理論和蛋白酶體理論，其中鈣蛋白酶理論在大量研究中得到了更多學(xué)者的認(rèn)可，鈣蛋白酶也被認(rèn)為在降解宰后肌肉蛋白質(zhì)的過(guò)程中起到主導(dǎo)作用[23-24]。

1.2 肌肉蛋白質(zhì)的嫩化作用

骨骼肌由肌纖維、結(jié)締組織、肌內(nèi)脂肪細(xì)胞、血管和神經(jīng)組織組成[25]，其中水約占75%，蛋白質(zhì)約占19%[26]。肌肉中的蛋白質(zhì)主要分為三大類：肌原纖維蛋白、結(jié)締組織蛋白和肌漿蛋白。肌原纖維蛋白占總蛋白含量的一半以上，是影響肉品品質(zhì)的重要因素之一；結(jié)締組織蛋白在肌肉中起到結(jié)構(gòu)支撐作用，因此對(duì)肉品嫩度也有較大影響。

肌纖維作為骨骼肌結(jié)構(gòu)的組成單位，是成束排列的多核條帶狀細(xì)胞。大量研究表明，肌纖維特性與肉品嫩度密切相關(guān)[27-29]，肌纖維類型（Ⅰ型和Ⅱ型）及其完整性、肌纖維蛋白的降解、肌纖維直徑、肌節(jié)長(zhǎng)度和收縮狀態(tài)等均會(huì)影響嫩度。肌原纖維占肌纖維含量的65%左右，每條肌原纖維由許多平行排列的肌球蛋白粗絲和肌動(dòng)蛋白細(xì)絲構(gòu)成。目前研究表明，在肉品成熟過(guò)程中，肌原纖維的關(guān)鍵蛋白質(zhì)水解是肉品嫩化的主要原因，這些關(guān)鍵蛋白質(zhì)在維持肌原纖維結(jié)構(gòu)中起到重要作用，例如，肌間線蛋白參與肌原纖維間的連接，肌聯(lián)蛋白和伴肌動(dòng)蛋白參與肌原纖維內(nèi)的連接等[23，30]。通過(guò)電子顯微鏡觀察肉品的超微結(jié)構(gòu)，如肌原纖維的排列情況、肌原纖維中肌節(jié)、A帶、I帶、Z線、H區(qū)的清晰程度，可以判斷肉品成熟程度。

肌肉中的結(jié)締組織以肌外膜、肌束膜和肌內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)形式存在，在維持肌肉結(jié)構(gòu)完整性方面起到關(guān)鍵作用[31-32]。結(jié)締組織蛋白包括膠原蛋白、彈性蛋白、網(wǎng)狀蛋白和糖蛋白，結(jié)締組織中還含有少量起到連接作用的蛋白多糖[33-34]。膠原蛋白作為結(jié)締組織的主要組成成分，其含量、熱溶解性、蛋白交聯(lián)程度等均會(huì)對(duì)肉品嫩度產(chǎn)生影響[35]，牛肉嫩度與膠原蛋白含量和交聯(lián)程度呈負(fù)相關(guān)[36-37]，而與膠原蛋白熱溶解性呈正相關(guān)[38]。

宰后成熟過(guò)程中，早期肌原纖維蛋白發(fā)生降解，肌原纖維結(jié)構(gòu)弱化，肉品處于快速嫩化階段；成熟階段后期肉品處于慢速嫩化階段，肌束膜和肌內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)破壞，結(jié)締組織結(jié)構(gòu)發(fā)生弱化[39-40]。肌漿蛋白中包括大多數(shù)與糖酵解有關(guān)的酶，如丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶等，這些蛋白的磷酸化水平與肌肉嫩度密切相關(guān)[41]，磷酸化水平越高越不利于肉的嫩化。Carlson等[42]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化物還原酶2等應(yīng)激反應(yīng)蛋白在氧化應(yīng)激中的含量變化也可能會(huì)對(duì)豬肉嫩度產(chǎn)生影響，應(yīng)激反應(yīng)蛋白含量升高會(huì)導(dǎo)致肉嫩度的降低。

2 肉嫩度檢測(cè)技術(shù)

嫩度能夠反映肉的質(zhì)地，以及肉在食用時(shí)的口感[43]，是肉品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。肌原纖維的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致嫩度的差異，肌內(nèi)結(jié)締組織的含量和性質(zhì)決定了肉的硬度[1]，因此針對(duì)肌內(nèi)蛋白質(zhì)對(duì)肉品的嫩化作用，可以從觀察質(zhì)構(gòu)、持水性等肉品品質(zhì)變化、組成結(jié)構(gòu)以及肌肉蛋白特性的角度進(jìn)行研究（圖1），開發(fā)肉嫩度的檢測(cè)方法。下文選取了部分具有代表性的用于嫩度測(cè)定的常用檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)其基本原理和應(yīng)用進(jìn)行描述。

2.1 測(cè)定肌肉品質(zhì)變化

2.1.1 pH值測(cè)定

pH值常用作評(píng)價(jià)肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，其能夠直接影響肉的風(fēng)味、嫩度、持水性等品質(zhì)[44]。宰后早期肌肉細(xì)胞通過(guò)糖酵解途徑產(chǎn)生乳酸，ATP水解產(chǎn)生磷酸，引起pH值下降[45]。pH值變化的程度和速率會(huì)影響嫩度、持水力等肉品品質(zhì)[46]，pH值的降低會(huì)導(dǎo)致肌原纖維收縮，鈣蛋白酶活性降低，影響蛋白質(zhì)的降解程度，從而影響肉品嫩度[47]。在宰后成熟過(guò)程中，肉品pH值會(huì)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)先快速降低到極限pH值，再緩步上升達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，整體仍呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由于畜禽種類、測(cè)量部位、屠宰條件的不同會(huì)導(dǎo)致蛋白水解、能量代謝等情況的差異，因此同一宰后時(shí)間肉品的pH值也會(huì)存在一定差異，但總體趨勢(shì)不會(huì)發(fā)生變化[48]。

pH值的測(cè)定通常使用pH檢測(cè)儀，在經(jīng)4 ℃校準(zhǔn)液校準(zhǔn)后，將電極沿肌原纖維方向插入樣品內(nèi)部或加入緩沖液將樣品勻漿，平行重復(fù)測(cè)定，記錄最終數(shù)值[49-50]。在測(cè)定過(guò)程中，由于宰后早期pH值下降較快，應(yīng)當(dāng)注意時(shí)間的把控，避免檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致數(shù)據(jù)誤差過(guò)大，以牛肉為例，一般牛肉的檢測(cè)時(shí)間為0、6、12、24、48、72、120 h。

近年來(lái)，研究學(xué)者通過(guò)檢測(cè)宰后肉品pH值的變化，分析肌肉中能量代謝過(guò)程中的關(guān)鍵因子。Schulte等[51]指出，鈣蛋白酶-1自溶和肌間線蛋白降解越多，到達(dá)極限pH值的速度越快。糖酵解速率的升高將加速pH值下降速率。Wang Chengcheng等[52]通過(guò)動(dòng)力學(xué)研究模型，發(fā)現(xiàn)磷酸果糖激酶將加速宰后豬肉pH值的降低速率。

2.1.2 剪切力法

最常用的剪切力測(cè)定儀器為Warner-Bratzler剪切儀，用于測(cè)量切割一定厚度的肉柱所需力的大小[1]。常見的剪切力測(cè)定方法還有切片剪切力法等。最早的肉類剪切力測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)由美國(guó)肉類科學(xué)協(xié)會(huì)制定[53]。剪切儀的使用是在樣品中插入熱電偶溫度計(jì)，水浴加熱至肉樣中心溫度為70～72 ℃時(shí)取出，流水冷卻或自然冷卻至室溫后平行于肌原纖維方向取肉柱，再用剪切力測(cè)試儀沿肌纖維垂直方向進(jìn)行剪切，記錄峰值，重復(fù)測(cè)量取

均值[54]。切割速度及V型切割刀片的夾角大小會(huì)影響剪切力[55]，為了提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，每組至少取6 個(gè)直徑相同的肉柱進(jìn)行檢測(cè)[56]。不過(guò)剪切力法仍會(huì)受到肌肉類型、烹飪方式、設(shè)備差異等干擾因素的影響，造成一定的誤差[57]。

剪切力和肉嫩度呈負(fù)相關(guān)，隨著宰后時(shí)間的延長(zhǎng)，剪切力整體上呈先增大后減小的趨勢(shì)，其下降幅度大于上升幅度[58]。宰后成熟過(guò)程中，在內(nèi)源性蛋白酶系統(tǒng)和微生物的作用下，肌肉中的肌原纖維蛋白發(fā)生降解，剪切力下降。肉的嫩度可直觀表現(xiàn)為肉品在咀嚼時(shí)牙齒所用力的大小，Warner-Bratzler剪切力（Warner-Bratzler shear force，WBSF）是最常用的將肉品嫩度進(jìn)行量化的檢測(cè)方法[59]。將WBSF與感官評(píng)價(jià)方法結(jié)合是目前研究的熱點(diǎn)，通過(guò)可量化數(shù)據(jù)與感官評(píng)分進(jìn)行比較分析可以確定肉品可接受嫩度的閾值[60]。Silva等[61]研究發(fā)現(xiàn)，用方形橫截面芯的WBSF測(cè)量方法在檢測(cè)肉品嫩度中的效果較使用圓形橫截面芯的Warner-Bratzler剪切儀更好，表明剪切儀的特性也會(huì)影響嫩度的檢測(cè)效果，這也為進(jìn)一步改進(jìn)嫩度檢測(cè)儀器與檢測(cè)方法提供了一定的方向和思路。

2.1.3 TPA

TPA廣泛應(yīng)用于各類食品的質(zhì)構(gòu)分析，包括果蔬制品、面制品、肉制品等。通過(guò)模仿咀嚼過(guò)程，能夠客觀反映食品硬度、黏性、內(nèi)聚性、彈性、咀嚼性和回復(fù)性等質(zhì)構(gòu)指標(biāo)[62]，能夠較為全面衡量肉的質(zhì)地特性。實(shí)驗(yàn)方法參照NY/T 1180—2006《肉嫩度的測(cè)定 剪切力測(cè)定法》[62]，用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定即可。魏直升等[63]通過(guò)研究不同部位牛肉在宰后成熟過(guò)程中的品質(zhì)特性，發(fā)現(xiàn)宰后成熟能夠改善肉的質(zhì)構(gòu)，且由于測(cè)量部位、肉品成熟時(shí)間等因素的不同，肌纖維類型及肌纖維蛋白的降解模式存在差異，對(duì)質(zhì)構(gòu)特性結(jié)果存在一定影響。

TPA是常見的用于食品質(zhì)地評(píng)估的方式，de Huidobro等[64]在研究中發(fā)現(xiàn)，TPA與WBSF相比，能夠更好地預(yù)測(cè)感官特性中的硬度。TPA和WBSF作為2 種公認(rèn)有效的食品機(jī)械評(píng)估方式，TPA能夠模擬食物在口腔咀嚼時(shí)的變化，WBSF能夠模擬最佳的切割效果。目前越來(lái)越多的研究關(guān)注于儀器測(cè)定指標(biāo)（TPA和WBSF）與感官評(píng)定測(cè)定數(shù)據(jù)間的相關(guān)性分析，TPA能夠提供更全面的量化參數(shù)進(jìn)行嫩度預(yù)測(cè)，且TPA的成本和耗時(shí)相較于感官評(píng)定更低。不過(guò)基于食品機(jī)械屬性的食品質(zhì)地評(píng)估也存在一定的局限性，由于受到主觀因素的影響，TPA所測(cè)量參數(shù)不能完全代表食物在口腔中的真實(shí)口感，測(cè)量結(jié)果也會(huì)受到材料機(jī)械性能的影響[65-66]。

2.2 測(cè)定肌肉結(jié)構(gòu)特性

2.2.1 光譜檢測(cè)技術(shù)

常用于食品分析的光譜檢測(cè)技術(shù)包括近紅外光譜（near infrared spectroscopy，NIRS）、拉曼光譜、高光譜成像技術(shù)、熒光光譜技術(shù)等。光譜檢測(cè)技術(shù)可以深入了解食品的組成結(jié)構(gòu)、分子間相互作用及各向異性。NIRS分析廣泛應(yīng)用于肉嫩度檢測(cè)中，其根據(jù)吸收峰在光譜中的位置和強(qiáng)度進(jìn)行定性和定量分析，可以測(cè)得肌肉的基本成分，如水、蛋白質(zhì)、脂肪、灰分和結(jié)締組織含量。

近年來(lái)，研究人員將NIRS在肉類研究中的應(yīng)用進(jìn)行擴(kuò)展，不僅用于肉品成分分析，還通過(guò)建立預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)肉品質(zhì)量。de Nadai Bonin等[67]通過(guò)偏最小二乘回歸模型成功預(yù)測(cè)剪切力和嫩度；Tejerina等[68]利用NIRS進(jìn)行肉質(zhì)分級(jí)，其設(shè)計(jì)的近紅外定量預(yù)測(cè)模型在肉品色度和色相角中表現(xiàn)出良好的預(yù)測(cè)效果；Balage等[69]通過(guò)可見光/NIRS（Vis/NIRS）技術(shù)預(yù)測(cè)豬肉樣品的最終pH值和顏色等品質(zhì)指標(biāo)。一些研究報(bào)告也指出，NIRS在預(yù)測(cè)肉的質(zhì)量性狀方面仍存在一定的缺陷，Balage等[69]研究發(fā)現(xiàn)，Vis/NIRS在定量預(yù)測(cè)豬肉肌內(nèi)脂肪方面效果較差，WBSF預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性較低。目前近紅外檢測(cè)技術(shù)在肉品品質(zhì)檢測(cè)方面仍存在一定的局限性，需要進(jìn)一步的研究來(lái)建立更加精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)模型。

2.2.2 肌原纖維小片化指數(shù)（myofibril fragmentation index，MFI）

MFI是評(píng)估肌肉肌原纖維超微結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵指標(biāo)，可直接反映肌原纖維的降解程度，并間接反映受肌原纖維蛋白降解影響的新鮮肉嫩度。通常情況下，MFI越高，表明肌原纖維結(jié)構(gòu)破壞程度越高，肉品的嫩度越好。MFI的檢測(cè)步驟較為復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，需要精確稱取樣品（少量），進(jìn)行2 次離心，控制實(shí)驗(yàn)溫度，在得到肌原纖維蛋白懸濁液后采用考馬斯亮藍(lán)法或雙縮脲法測(cè)定溶液的蛋白質(zhì)量濃度，再經(jīng)調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度后測(cè)定吸光度[49]。除肉樣自身因素外，MFI也會(huì)受到勻漿速率、刀片類型等其他均質(zhì)條件的影響[67]。MFI一般在540 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行吸光度測(cè)定[70-71]。肉品在宰后成熟過(guò)程中，MFI持續(xù)升高，表明其Z線蛋白發(fā)生降解，肌原纖維細(xì)胞凋亡，嫩度升高。

MFI是測(cè)定宰后早期肉嫩度的有效工具，研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，其與WBSF之間存在顯著的正相關(guān)性（P＜1.8）[72]。Aroeira等[73]研究發(fā)現(xiàn)，肌原纖維的碎裂程度還可以通過(guò)WBSF、MFI等不同方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，目前大部分學(xué)者將MFI作為肉嫩度的檢測(cè)指標(biāo)之一。在未來(lái)的研究中，可以對(duì)MFI與嫩化相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，篩選出影響MFI的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，研究其在蛋白質(zhì)降解和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用，對(duì)于幾種關(guān)鍵蛋白間的協(xié)同作用也可進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

2.2.3 成像技術(shù)

肉中蛋白質(zhì)、脂肪的分布會(huì)直接影響肉品嫩度。宰后成熟期間，肌肉蛋白質(zhì)的降解會(huì)導(dǎo)致肌纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，成像技術(shù)能夠直接觀察肌肉纖維微觀結(jié)構(gòu)以及肌肉蛋白質(zhì)的變化。目前常見的成像技術(shù)包括透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、原子力顯微鏡、X射線斷層掃描等，這些技術(shù)能夠快速、直觀地得到不同長(zhǎng)度尺度的圖像，但與NIRS等光譜技術(shù)相比，這些成像技術(shù)的缺陷是需要制備大量樣品且通常對(duì)樣品具有一定的破壞性[57]。

SEM可以揭示肉類結(jié)構(gòu)中與過(guò)程相關(guān)的變化，SEM在明場(chǎng)不同視線下拍取樣品圖像，用圖像處理軟件測(cè)定肌原纖維直徑（myofibril diameter，MYD）、肌原纖維間距（myofibril spacing，MYS）、肌纖維直徑（muscle fibre diameter，MFD）、肌纖維間距（muscle fibre spacing，MFS）、肌節(jié)長(zhǎng)度（sarcomere length，SL）等指標(biāo)[74]，觀察肌肉表面結(jié)構(gòu)變化、肌纖維分離以及收縮和舒張狀態(tài)等情況。當(dāng)纖維束結(jié)構(gòu)變得松散，肌纖維間密度降低時(shí)，會(huì)引起肌肉硬度和剪切力下降，肉品持水性部分降低，蒸煮損失率增加，肉品嫩度增加[75]。Nishimura等[76]通過(guò)SEM觀察肌內(nèi)結(jié)締組織（intramuscular connective tissue，IMCT）結(jié)構(gòu)的變化，證實(shí)IMCT的降解有助于豬肉在宰后成熟期間嫩度的提高。Soji等[77]將測(cè)得的MYD、MYS、MFD、MFS、SL與WBSF進(jìn)行相關(guān)性分析，確定肌纖維束特征對(duì)提高肉嫩度具有正向作用。

TEM能夠提供有關(guān)肉類內(nèi)部結(jié)構(gòu)的信息，通過(guò)TEM能夠觀察到由肌原纖維蛋白降解引起的肌原纖維中Z盤和M線的超微結(jié)構(gòu)變化，觀察肌原纖維排列，肌原纖維中肌節(jié)、A帶、I帶、Z線、M線的長(zhǎng)度、寬度及清晰程度。在宰后成熟過(guò)程中，肌原纖維結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，大部分Z線扭曲斷裂，H區(qū)模糊難辨，明暗帶邊界消失。當(dāng)Z線明顯斷裂、肌節(jié)長(zhǎng)度縮小時(shí)，肌肉發(fā)生自溶[78]。

SEM和TEM作為研發(fā)早、使用廣泛的成像技術(shù)，揭示了肉品微觀結(jié)構(gòu)中的重要信息。近年來(lái)，研究者通過(guò)將激光、紅外光譜等技術(shù)與顯微鏡進(jìn)行結(jié)合開發(fā)了適用范圍更廣、精確度更高的成像技術(shù)。例如，朱瑤迪等[79]基于高光譜成像和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)進(jìn)行豬肉嫩度的快速測(cè)定；環(huán)境掃描電子顯微鏡能夠減少溶液對(duì)顯示圖像的影響，應(yīng)用于觀察各類肌肉的微觀結(jié)構(gòu)[80]。

用于肉嫩度測(cè)定的光學(xué)傳感技術(shù)如表1所示。

2.3 測(cè)定肌肉蛋白質(zhì)特性

2.3.1 免疫印跡技術(shù)（Western blotting，WB）

肌肉宰后成熟過(guò)程中肌纖維蛋白和結(jié)締組織蛋白發(fā)生降解，其中肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白是導(dǎo)致肌肉成熟過(guò)程中嫩度變化最關(guān)鍵的蛋白質(zhì)[87]。通過(guò)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)關(guān)鍵蛋白的降解程度差異可以判斷肉的嫩化進(jìn)程，從而確定肉的嫩度。WB是檢測(cè)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)翻譯后修飾的常用方法，將十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和酶聯(lián)免疫技術(shù)結(jié)合，可以在簡(jiǎn)單或復(fù)雜的生物樣本中對(duì)相關(guān)目的蛋白進(jìn)行半定量或定量分析檢測(cè)[88-89]。

WB作為一門新興的肉嫩度檢測(cè)手段，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。Onopiuk等[71]使用SDS-PAGE和WB評(píng)估牛肉pH值、肌節(jié)長(zhǎng)度、MFI、WBSF等數(shù)據(jù)，并觀測(cè)到MFI與WBSF和肌鈣蛋白T降解值密切相關(guān)。孫金龍等[90]通過(guò)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳和免疫印跡分析方法檢測(cè)到宰后肉品成熟過(guò)程中熱休克蛋白對(duì)肌原纖維降解的抑制作用。WB具有高分辨率、高敏感性和特異性的特點(diǎn)，能夠同時(shí)對(duì)不同蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量比較，也可用于微量級(jí)蛋白質(zhì)的檢測(cè)分析。但該技術(shù)涉及一系列復(fù)雜且連續(xù)的操作步驟，需要先通過(guò)SDS-PAGE將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，電泳后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（聚偏氟乙烯膜或硝酸纖維素膜）上，再使用抗體進(jìn)行分析，以進(jìn)行特異性蛋白質(zhì)檢測(cè)[91]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)受到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及操作精度的影響，包括樣品上樣量、樣品分級(jí)分離等因素，因此如何提升檢測(cè)結(jié)果的精密度和重現(xiàn)性也是該研究領(lǐng)域持續(xù)關(guān)注的問題[92]。Murphy等[93]提出，少量上樣可以更好地檢測(cè)低表達(dá)量蛋白，使蛋白質(zhì)印跡結(jié)果更加可靠。

2.3.2 羰基含量的測(cè)定

在宰后肉類貯藏和加工過(guò)程中常會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)氧化，研究表明，蛋白質(zhì)的氧化作用是影響肉嫩度的重要因素之一[94]。蛋白質(zhì)的氧化損傷會(huì)使氨基酸殘基中衍生出羰基化合物，而羰基化通常被認(rèn)為是氧化蛋白質(zhì)中最顯著的化學(xué)修飾之一[95]，因此羰基含量也常被作為評(píng)估蛋白質(zhì)氧化和鑒定蛋白質(zhì)嫩化作用的可靠指標(biāo)。

隨著宰后貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肌肉中羰基含量呈整體上升趨勢(shì)。肌肉中蛋白質(zhì)的氧化作用對(duì)肉嫩度的影響是復(fù)雜的。Chen Qianqian等[96]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)氧化可以通過(guò)抑制蛋白水解酶（特別是μ-鈣蛋白酶）的活性來(lái)降低肌原纖維蛋白的降解程度，不利于肉的嫩化。然而，Malheiros等[94]研究發(fā)現(xiàn)，活性氧的產(chǎn)生可能導(dǎo)致肌原纖維蛋白的損傷并激活蛋白酶體，可能有助于結(jié)構(gòu)蛋白的降解，從而提高肉嫩度。Lei Yongdong等[97]通過(guò)觀察氧化作用對(duì)不同肌原纖維蛋白降解的影響，發(fā)現(xiàn)隨著氧化程度的增加，肌動(dòng)蛋白降解程度增加，肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的降解受到抑制。因此，目前從蛋白組學(xué)角度證明不同類別蛋白質(zhì)的氧化修飾作用對(duì)肌肉嫩度的影響尚未達(dá)成共識(shí)，仍有待進(jìn)一步研究。

2.3.3 膠原蛋白含量及溶解度測(cè)定

膠原蛋白是結(jié)締組織的重要組成部分，膠原蛋白的含量及溶解度會(huì)影響肉的質(zhì)構(gòu)，從而影響肉品嫩度，因此測(cè)定膠原蛋白含量及其溶解度對(duì)于檢測(cè)肉品嫩度、判斷嫩度影響因素具有重要作用。膠原蛋白中的羥脯氨酸含量相對(duì)穩(wěn)定，占總蛋白質(zhì)的13%～14%，因此生肉樣品中總膠原蛋白含量可以通過(guò)羥脯氨酸含量進(jìn)行確定。生肉中的膠原蛋白含量受性別和動(dòng)物年齡等因素的影響，膠原蛋白溶解度受性別、品種和動(dòng)物年齡等因素的影響[98]。

膠原蛋白溶解度可以通過(guò)測(cè)量肉品中總膠原蛋白和可溶性膠原蛋白的含量來(lái)獲得[99]。肌內(nèi)結(jié)締組織中蛋白質(zhì)在肉嫩化中發(fā)揮的作用一直是許多研究的重點(diǎn)。目前Li Xiying等[100]通過(guò)薈萃分析建立統(tǒng)計(jì)學(xué)模型，確定膠原蛋白含量及溶解度對(duì)嫩度的影響，研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白特性與肉嫩度的關(guān)系受到物種因素的影響，僅在牛肉中可以觀察到其膠原蛋白特性與嫩度的顯著相關(guān)性，在豬肉和羊肉中膠原蛋白特性與嫩度屬性之間的相關(guān)性不顯著。Torrescano等[101]對(duì)肌肉剪切力及膠原蛋白特性的關(guān)系進(jìn)行研究，指出膠原蛋白總量和剪切力的相關(guān)性受到肉狀態(tài)的影響，二者在生肉中呈現(xiàn)很強(qiáng)的正相關(guān)性，在熟肉中相關(guān)性較低。Zheng Yanyan等[102]對(duì)不同類型膠原蛋白的熱誘導(dǎo)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原蛋白的降解是熟豬肚質(zhì)構(gòu)改善的主要原因，可能對(duì)肌肉嫩度產(chǎn)生影響。在肉的蒸煮過(guò)程中，研究者也通過(guò)提高烹飪溫度、延長(zhǎng)加熱時(shí)間、真空低溫烹調(diào)等方法改變膠原蛋白溶解程度和結(jié)締組織強(qiáng)度，以提高肉品食用品質(zhì)，改善肉嫩度[103-104]。

3 結(jié) 語(yǔ)

嫩度作為評(píng)價(jià)肉品食用品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，會(huì)影響消費(fèi)者的選擇。在宰后成熟過(guò)程中，肌肉蛋白質(zhì)的一系列變化會(huì)對(duì)肉的結(jié)構(gòu)及品質(zhì)產(chǎn)生較大影響。嫩度可以通過(guò)感官評(píng)定和儀器分析的方式進(jìn)行檢測(cè)，在研究中將感官評(píng)定和儀器分析相結(jié)合進(jìn)行相關(guān)性分析可以使檢測(cè)結(jié)果更加全面、客觀。在進(jìn)行嫩度測(cè)定時(shí)，使用多樣化的檢測(cè)技術(shù)，如質(zhì)構(gòu)測(cè)定、NIRS分析、免疫印跡技術(shù)等，對(duì)肌肉的品質(zhì)變化、組成結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)特性進(jìn)行分析，能夠找到影響肉嫩度的關(guān)鍵因素并進(jìn)行肉質(zhì)判定。不過(guò)目前現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)也存在一定的局限性，如操作復(fù)雜、可重復(fù)性低、破壞性檢測(cè)等。因此，有必要在現(xiàn)有嫩度檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)完善，開發(fā)新型肉品嫩度無(wú)損檢測(cè)技術(shù)，并結(jié)合數(shù)學(xué)模型及統(tǒng)計(jì)學(xué)模型進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)智能化、精確化檢測(cè)。

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收稿日期：2023-05-09

基金項(xiàng)目：江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)單項(xiàng)技術(shù)開發(fā)項(xiàng)目（CX（22）3071）

第一作者簡(jiǎn)介：狄雨晗（2002—）（ORCID： 0009-0003-3342-3392），女，本科生，研究方向?yàn)槿馄芳庸づc質(zhì)量控制。

E-mail： 1533027262@qq.com

*通信作者簡(jiǎn)介：張雅瑋（1986—）（ORCID： 0000-0001-7353-7771），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槿馄芳庸づc質(zhì)量控制。

E-mail： zhangyawei@njau.edu.cn