大花紅景天抗輻射活性成分的初步篩選

曲功霖，王春燕，齊雪松，佟鵬

（中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所 輻射防護(hù)與核應(yīng)急中國疾病預(yù)防控制中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088）

紅景天為景天科紅景天屬多年生草本或亞灌木植物，具有治療心血管疾病、抗輻射、抗應(yīng)激反應(yīng)、抗衰老、增加機(jī)體免疫力等功效[1]，中國藥典規(guī)定紅景天藥用來源為景天科植物大花紅景天Rhodiolacrenulata（Hook. f. et Thoms）H. Ohba的干燥根和根莖[2]。本研究主要考察大花紅景天對小鼠體重及外周血象的影響，以探討大花紅景天對電離輻射所致造血功能下降的治療作用，并初步篩選出大花紅景天的抗輻射活性成分。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、材料及試劑

POCH-100iv Diff型血球儀（日本SYSMEX公司），725型紫外分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠），DZF-6030A型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），TP-214型分析天平（北京丹佛儀器有限公司），Milli-Q A10型純水儀（美國Millipore公司），D101型大孔吸附樹脂（北京慧德易科技有限責(zé)任公司），乙醇為分析純（北京化工廠）。

1.2 試藥

山柰素對照品（110861～200808）（中國食品藥品檢定研究院）。紅景天生藥購自昆明中藥材市場，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院張潔副教授鑒定，來源為景天科植物大花紅景天Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms）H.Ohba。將生藥粉碎后置于回流加熱裝置中，第1次加入約10倍量70%乙醇，浸泡30 min，大火煮沸后，文火（保持微沸狀態(tài)）煎2 h。采用60目篩網(wǎng)濾過，藥材中再加入約10倍量70%乙醇，大火煮沸后，文火煎2 h。合并2次提取液，水浴濃縮后60℃真空干燥為粉末，作為大花紅景天乙醇提取物，提取率為52%。

同法另置大花紅景天乙醇提取液，濃縮至生藥與濃縮藥液體積比約為1∶1，以離心半徑17.8 cm，10 000 r/min離心10 min，參照文獻(xiàn)[3]的提取方法，取上清液過D-101大孔吸附樹脂柱，以95%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮后60℃真空干燥為粉末，作為大花紅景天乙醇提取物大孔樹脂吸附部分，即大花紅景天總黃酮，提取率為24%。以山柰素為對照品，采用紫外分光光度法檢測提取物中總黃酮含量為43.6%。

所有未吸附部分水浴濃縮后60℃真空干燥為粉末，為乙醇提取物大孔樹脂未吸附部分，即大花紅景天乙醇提取其余成分，提取率為28%。

1.3 照射條件

采用北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院鈷源60Coγ射線照射，小鼠單次全身照射的吸收劑量為3.5 Gy，劑量率為1.0 Gy/min，源靶距1.15 m。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方案

BALB/c小鼠60只，SPF級，雌雄各半，6～8周齡，體重（20±2）g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0002。在中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證號：SYXK（京）2014-0043，飼養(yǎng)條件為光照12 h，飼養(yǎng)溫度23～26℃，濕度40%。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后按體重編號，按隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，設(shè)正常組、對照組、乙醇提取物組、總黃酮組、乙醇提取其余成分組，每組12只。按臨床人用劑量推算大花紅景天生藥小鼠給藥劑量為0.9 g/kg，因此按提取率計(jì)算給藥劑量：乙醇提取物組為0.468 g/kg，總黃酮組為0.216 g/kg，乙醇提取其余成分組為0.252 g/kg。模型復(fù)制后立即灌胃給藥，20 ml/kg，1次/d，連續(xù)給藥7 d。正常組和對照組給予等體積的純水。

1.5 小鼠體重觀察

取照射前1 d，以及照射后1、4、7、10、13和16 d，共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對各組小鼠稱重，觀察體重變化。

1.6 小鼠外周血象觀察

小鼠接受全身一次性3.5 Gyγ射線照射，在照射前1 d，以及照射后1、4、7、10、13和16 d，共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每只小鼠尾靜脈取血20μl，使用SYSMEX POCH-100iv Diff型血球儀檢測外周血象。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重比較

照射前，各組小鼠毛色及活動(dòng)正常。受照射后，正常組小鼠保持正常，對照組和給藥組小鼠出現(xiàn)不同程度的皮毛光澤度下降，精神萎靡，飲食及飲水量下降。

正常組、對照組、大花紅景天各成分組在照射前1 d，以及照射后1、4、7、10、13和16d的體重比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)小鼠體重有差別（F=52.725，P=0.000）；②各組小鼠體重?zé)o差別（F=0.878，P=0.483），正常組、乙醇提取物組、總黃酮組、乙醇提取其余成分組小鼠體重與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；③各組小鼠體重變化趨勢有差別（F=2.324，P=0.006）。見表1和圖1。

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重比較 （n =12，g，±s）

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重比較 （n =12，g，±s）

組別 照射前1 d 照射后1 d 照射后4 d 照射后7 d 照射后10 d 照射后13 d 照射后16 d正常組 20.24±0.98 20.48±1.15 19.83±1.08 19.93±1.29 20.16±1.57 20.38±1.63 20.90±1.69對照組 20.60±0.81 20.22±0.91 18.42±1.03 19.38±0.92 20.17±0.94 20.35±0.96 20.94±1.06乙醇提取物組 19.89±0.90 19.72±0.95 18.47±1.08 19.06±1.60 19.57±1.69 20.17±1.56 20.30±1.33總黃酮組 20.45±1.17 20.75±1.01 19.80±1.13 19.73±1.69 20.05±1.61 20.73±1.39 20.82±1.61乙醇提取其余成分組 20.14±0.82 20.28±0.93 19.06±1.11 19.45±0.84 19.77±0.85 20.65±0.95 20.53±0.91

圖1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重變化趨勢

2.2 各組小鼠外周血象比較

2.2.1 白細(xì)胞數(shù) 正常組、對照組、大花紅景天各成分組在照射前1 d，以及照射后1、4、7、10、13和16 d測量的白細(xì)胞數(shù)比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)小鼠白細(xì)胞數(shù)有差別（F=68.131，P=0.000）。②各組小鼠白細(xì)胞數(shù)有差別（F=215.402，P=0.000），正常組、乙醇提取物組、總黃酮組、乙醇提取其余成分組小鼠白細(xì)胞數(shù)高于對照組（P＜0.05）；乙醇提取物組、乙醇提取其余成分組小鼠白細(xì)胞數(shù)與總黃酮組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。③各組小鼠白細(xì)胞數(shù)變化趨勢有差別（F=7.013，P=0.000）。見表2和圖2。

表2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血白細(xì)胞數(shù)比較 （n =12，×109/L，±s）

表2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血白細(xì)胞數(shù)比較 （n =12，×109/L，±s）

組別 照射前1 d 照射后1 d 照射后4 d 照射后7 d 照射后10 d 照射后13 d 照射后16 d正常組 9.80±2.62 10.37±2.72 11.51±1.85 10.67±3.27 10.50±2.07 10.40±1.69 10.53±1.18對照組 9.00±0.98 2.09±1.13 1.48±0.56 3.08±1.60 2.62±0.93 2.55±0.47 3.82±1.25乙醇提取物組 8.80±2.45 2.49±0.83 1.98±1.03 3.03±1.21 4.88±1.51 3.10±1.14 4.42±1.05總黃酮組 9.38±3.47 2.59±0.60 1.83±0.62 3.33±1.76 5.02±1.37 3.93±1.25 4.43±1.33乙醇提取其余成分組 9.56±3.57 3.38±1.35 1.93±1.29 4.01±2.53 3.89±1.01 3.61±1.33 4.04±0.86

圖2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)白細(xì)胞數(shù)變化趨勢

2.2.2 紅細(xì)胞數(shù) 正常組、對照組、大花紅景天各成分組在照射前1 d，以及照射后1、4、7、10、13和16 d測量的紅細(xì)胞數(shù)比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)小鼠紅細(xì)胞數(shù)有差別（F=13.401，P=0.000）。②各組小鼠紅細(xì)胞數(shù)有差別（F=7.907，P=0.000），正常組、乙醇提取物組、總黃酮組、乙醇提取其余成分組小鼠紅細(xì)胞數(shù)高于對照組（P＜0.05）；總黃酮組紅細(xì)胞數(shù)高于乙醇提取物組、乙醇提取其余成分組（P＜0.05）。③各組小鼠紅細(xì)胞數(shù)變化趨勢有差別（F=2.543，P=0.001）。見表3和圖3。2.2.3 血紅蛋白 正常組、對照組、大花紅景天各成分組在照射前1 d，以及照射后1、4、7、10、13和16 d測量的血紅蛋白含量比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血紅蛋白含量有差別（F=18.265，P=0.000）。②各組小鼠血紅蛋白含量有差別（F=10.299，P=0.000），正常組、乙醇提取物組、總黃酮組、乙醇提取其余成分組小鼠血紅蛋白含量高于對照組（P＜0.05）；總黃酮組血紅蛋白含量高于乙醇提取物組、乙醇提取其余成分組（P＜0.05）。③各組小鼠血紅蛋白含量變化趨勢有差別（F=2.957，P=0.000）。見表4和圖4。

表3 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血紅細(xì)胞數(shù)比較 （n =12，×1012/L，±s）

表3 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血紅細(xì)胞數(shù)比較 （n =12，×1012/L，±s）

組別 照射前1 d 照射后1 d 照射后4 d 照射后7 d 照射后10 d 照射后13 d 照射后16 d正常組 5.11±1.36 4.99±2.30 5.63±1.47 4.84±1.12 4.66±1.75 5.11±1.82 4.45±1.38對照組 4.40±0.91 4.41±2.17 3.69±1.53 2.95±1.60 2.65±1.32 2.73±0.77 4.15±1.38乙醇提取物組 4.86±1.03 4.38±1.03 5.74±1.89 3.03±1.26 3.19±0.96 3.55±1.14 5.31±2.06總黃酮組 5.17±0.32 5.66±1.20 7.40±2.16 4.90±1.32 4.02±1.12 5.21±1.61 4.97±1.41乙醇提取其余成分組 5.33±0.46 5.28±1.82 4.17±1.33 4.10±1.95 3.60±1.20 3.96±1.35 5.42±2.21

圖3 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)紅細(xì)胞數(shù)變化趨勢

表4 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血血紅蛋白含量比較 （n =12，g/dl，±s）

表4 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血血紅蛋白含量比較 （n =12，g/dl，±s）

組別 照射前1 d 照射后1 d 照射后4 d 照射后7 d 照射后10 d 照射后13 d 照射后16 d正常組 7.38±2.43 7.28±2.25 7.79±1.39 7.10±1.52 6.49±0.77 7.34±1.75 7.07±1.80對照組 7.46±0.79 7.04±1.54 4. 77±1.44 4.71±1.81 3.37±0.53 4.50±1.01 6.36±1.98乙醇提取物組 7.58±1.58 6.58±1.55 7.26±1.71 4.90±1.53 4.96±1.49 5.21±1.60 7.06±1.89總黃酮組 7.66±0.80 8.80±1.37 7.92±1.26 7.70±1.49 6.43±1.42 7.91±1.73 7.08±1.75乙醇提取其余成分組 7.73±0.98 7.57±2.53 5.84±1.97 5.66±1.37 5.58±1.73 5.44±1.80 7.48±2.65

圖4 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)血紅蛋白含量變化趨勢

2.2.4 血小板數(shù) 正常組、對照組、大花紅景天各成分組在照射前1 d，以及照射后1、4、7、10、13和16 d測量的血小板數(shù)比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血小板數(shù)有差別（F=54.470，P=0.000）。②各組小鼠血小板數(shù)有差別（F=9.906，P=0.000），正常組、乙醇提取物組、總黃酮組、乙醇提取其余成分組小鼠血小板數(shù)高于對照組（P＜0.05）；總黃酮組血小板數(shù)與乙醇提取物組、乙醇提取其余成分組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。③各組小鼠血小板數(shù)變化趨勢有差別（F=3.571，P=0.009）。見表5和圖5。

表5 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血血小板數(shù)比較 （n =12，×109/L，±s）

表5 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血血小板數(shù)比較 （n =12，×109/L，±s）

組別 照射前1 d 照射后1 d 照射后4 d 照射后7 d 照射后10 d 照射后13 d 照射后16 d正常組 641.83±201.71 725.58±259.21 777.00±150.29 653.75±209.14 584.67±105.15 708.75±227.57 724.83±253.91對照組 621.92±173.69 471.92±117.63 545.50±177.65 273.67±129.33 249.58±115.29 402.92±133.95 723.92±241.80乙醇提取物組 686.42±186.13 568.67±162.50 759.17±215.70 278.75±110.42 334.67±62.54 510.08±142.26 810.75±151.37總黃酮組 702.58±139.14 681.25±164.89 789.83±260.23 386.83±106.04 340.50±90.84 624.92±91.82 688.33±138.83乙醇提取其余成分組 758.75±185.96 683.67±253.49 545.58±189.78 323.75±108.09 312.33±86.89 491.83±88.30 837.58±253.44

圖5 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)血小板數(shù)變化趨勢

3 討論

輻射損傷是一種病理、生理過程十分復(fù)雜的疾患，對人體的危害具有多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，1種或幾種化合物對輻射損傷的防治很難達(dá)到全面、高效和穩(wěn)定的效果。我國的傳統(tǒng)中藥含有多種成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和清除自由基等多種藥理活性，應(yīng)用在抗輻射作用方面可能起到綜合治療的作用。因此，許多具有活血、補(bǔ)血、抗氧化和增強(qiáng)免疫功能的中藥具有抗輻射作用潛力，可以作為輻射損傷防治候選藥物，具有廣闊的應(yīng)用前景。本課題組對多種中藥進(jìn)行了抗輻射藥效的評價(jià)，其中大花紅景天對小鼠具有較好的輻射防護(hù)作用。為深入探討大花紅景天的輻射防護(hù)作用，采用化學(xué)分離方法針對大花紅景天的不同成分進(jìn)行抗輻射活性評價(jià)是十分必要的。已有對紅景天的化學(xué)成分研究結(jié)果表明，大花紅景天的化學(xué)成分主要包括醇苷類[4]、黃酮類[4-5]、多糖類[6]、揮發(fā)油類[7]等成分，其中對以紅景天苷為主的醇苷類成分研究較多，對黃酮等其他成分研究較少。而既往對紅景天屬植物的化學(xué)及藥理作用研究發(fā)現(xiàn)，總黃酮具有抗氧化[8-9]、抗病毒[10]、抗腫瘤[11]等多種藥理活性。并且有觀點(diǎn)認(rèn)為，紅景天抗氧化作用的主要藥理活性成分是山柰素等黃酮類成分，而非紅景天苷[8]。因此本課題組推測，大花紅景天中的總黃酮可能具有良好的抗輻射活性。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察大花紅景天的黃酮類成分對電離輻射損傷小鼠體重及外周血象的影響。

同時(shí)本課題組對大花紅景天的提取工藝研究表明，70%乙醇提取物的總黃酮含量遠(yuǎn)高于水提物，因此本實(shí)驗(yàn)采用乙醇提取大花紅景天，然后經(jīng)大孔樹脂吸附的方法制備總黃酮。測定結(jié)果表明，大花紅景天總黃酮以山柰素計(jì)，含量為43.6%。

為全面評價(jià)大花紅景天中不同成分的抗輻射活性，本研究還比較了乙醇提取物、乙醇提取其余成分的抗輻射作用。為確保各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性，本研究以人臨床使用劑量推算小鼠給藥生藥劑量，各組小鼠均以此劑量作為給藥生藥劑量，然后通過各成分的提取率計(jì)算給藥劑量。

機(jī)體造血系統(tǒng)是對輻射高度敏感的組織，電離輻射可以導(dǎo)致骨髓抑制、造血組織功能障礙、造血微環(huán)境損傷等[12-14]，同時(shí)造血免疫功能在輻射后也明顯受抑制[13，15]，所以造血系統(tǒng)的恢復(fù)是評價(jià)藥物抗輻射活性的重要因素[16]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)3.5 Gy照射后，外周血象中白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量和血小板數(shù)均下降；與對照組比較，乙醇提取物、總黃酮和乙醇提取其余成分對受照射小鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板均表現(xiàn)出促升高的作用；而與乙醇提取物、乙醇提取其余成分比較，總黃酮對紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量的促升高作用明顯增強(qiáng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，大花紅景天各成分具有明顯抑制γ射線輻射所致的小鼠外周血象降低的作用，其中總黃酮可能是主要的抗輻射活性成分。

大花紅景天總黃酮對外周血象各項(xiàng)指標(biāo)的影響表現(xiàn)出不同的特點(diǎn)；與對照組比較，抑制白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量和血小板數(shù)下降的作用最為顯著；而對紅細(xì)胞數(shù)降低的干預(yù)在受照射初期并不明顯。對于該現(xiàn)象的原因，有研究認(rèn)為，紅細(xì)胞存活時(shí)間比其他血細(xì)胞長，生存壽命120 d，并且對放射不敏感，所以照射早期紅細(xì)胞并不出現(xiàn)明顯的數(shù)量、形態(tài)、血紅蛋白和血球容積等變化，而且在放射病早期，由于晚幼紅細(xì)胞繼續(xù)成熟，可能有網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的一時(shí)增多[16-17]。

照射劑量的選擇也是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵問題，劑量過小達(dá)不到模型復(fù)制的要求，劑量過大，小鼠輻射損傷嚴(yán)重甚至死亡，藥物治療難以逆轉(zhuǎn)。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，本研究選擇3.5 Gy照射劑量復(fù)制模型小鼠，結(jié)果表明，模型小鼠可用于有效評價(jià)大花紅景天各提取成分的干預(yù)作用。

綜上所述，大花紅景天總黃酮有很好地抑制小鼠電離輻射損傷導(dǎo)致的外周血象下降的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為大花紅景天的抗輻射損傷物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了重要的參考依據(jù)。本課題組正在對大花紅景天總黃酮中的化學(xué)成分進(jìn)行分離，并采用更多的活性指標(biāo)進(jìn)行抗輻射活性篩選，以期為開發(fā)高效低毒、成分明確、質(zhì)控穩(wěn)定的新型輻射損傷防治中藥制劑產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。