農(nóng)村有機(jī)生活垃圾干發(fā)酵氨脅迫下中試工藝

劉洋，葉小梅，苗曉，王成成，賈昭炎，曹春暉，奚永蘭，3

（1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 南京 210014；2 江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014；4 徐州市環(huán)能生態(tài)技術(shù)有限公司，江蘇 徐州 221000）

我國(guó)提出“碳達(dá)峰碳中和”（雙碳）目標(biāo)為我國(guó)農(nóng)村生活垃圾處理提出了新的要求。在對(duì)農(nóng)村生活垃圾進(jìn)行處理時(shí)，還需考慮碳排放和碳減排問(wèn)題，為早日實(shí)現(xiàn)“雙碳”目標(biāo)做出貢獻(xiàn)。農(nóng)村生活垃圾是制約我國(guó)農(nóng)村環(huán)境改善的重要因素，每年約2.94 億噸的農(nóng)村生活垃圾需要處理[1]。厭氧發(fā)酵是處理農(nóng)村生活垃圾有機(jī)部分極具潛力的技術(shù)[2]，在處理固廢的同時(shí)生產(chǎn)清潔能源沼氣，對(duì)碳減排的貢獻(xiàn)同樣潛力巨大[3]。因此進(jìn)一步提高厭氧發(fā)酵效率，深挖厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷潛力是必要的。

提高厭氧發(fā)酵罐內(nèi)總固體（total solid，TS）含量可以提高池容產(chǎn)氣率，降低沼液產(chǎn)出，具有加熱能耗低和沼渣后處理容易等優(yōu)點(diǎn)，因此近年來(lái)TS含量較高的干式厭氧發(fā)酵技術(shù)受到更多關(guān)注[4-6]。干式厭氧發(fā)酵一般指TS≥20%（樣品烘干后重量/樣品重量）的厭氧發(fā)酵[7]，農(nóng)村有機(jī)生活垃圾的含水率在80%（樣品水分重量/樣品重量）左右[8]，可直接用于干式厭氧發(fā)酵而不需加水調(diào)節(jié)TS。提高發(fā)酵罐內(nèi)TS 含量會(huì)直接導(dǎo)致系統(tǒng)內(nèi)部揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs）和氨氮快速積累，對(duì)產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制，破壞發(fā)酵系統(tǒng)平衡[9-12]。本文作者課題組先前的研究表明農(nóng)村有機(jī)生活垃圾厭氧發(fā)酵TS含量達(dá)到8%已經(jīng)出現(xiàn)氨氮抑制[13]，TS達(dá)到20%時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重氨氮抑制[14]。解決氨氮抑制包括接種物馴化、共發(fā)酵和氨氮吸附材料等方法，均對(duì)高濃度氨氮抑制有顯著效果[8,15-16]，其中共發(fā)酵是增加農(nóng)業(yè)廢棄物厭氧發(fā)酵甲烷產(chǎn)量的最常用方法[17]。畜禽糞便作為農(nóng)業(yè)碳排放的主要來(lái)源之一，直接對(duì)其進(jìn)行厭氧發(fā)酵由于其產(chǎn)沼氣潛力低而不具有經(jīng)濟(jì)性。其中牛糞具有提高厭氧發(fā)酵系統(tǒng)緩沖能力，緩解氨氮抑制的作用[18]，同時(shí)其高碳含量可以作為生活垃圾等富氮原料干式厭氧發(fā)酵的共發(fā)酵底物[19]。因而將農(nóng)村有機(jī)生活垃圾與牛糞進(jìn)行干式厭氧共發(fā)酵的研究是有意義的，可以通過(guò)兩種原料的性質(zhì)互補(bǔ)，提高產(chǎn)甲烷效率。同時(shí)對(duì)農(nóng)村有機(jī)生活垃圾的研究多集中在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，其工程化應(yīng)用研究尚少。

本文通過(guò)對(duì)農(nóng)村有機(jī)生活垃圾和牛糞進(jìn)行1m3規(guī)模的中溫干式厭氧共發(fā)酵中試試驗(yàn)，考察了農(nóng)村有機(jī)生活垃圾在中試規(guī)模下的產(chǎn)甲烷、氨氮、VFAs 和微生物群落的特征，以期獲得農(nóng)村有機(jī)生活垃圾氨脅迫下中試規(guī)模的發(fā)酵特征和潛力，給農(nóng)村有機(jī)生活垃圾沼氣工程建設(shè)提供技術(shù)支持，為農(nóng)村有機(jī)生活垃圾無(wú)害化處理和“雙碳”目標(biāo)實(shí)現(xiàn)做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參考江蘇省徐州市沛縣大屯街道大王莊生活垃圾分類(lèi)處置中心的組分[20]，農(nóng)村有機(jī)生活垃圾由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食堂的餐廚垃圾尾菜、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物科學(xué)試驗(yàn)基地的蔬菜秸稈和農(nóng)作物秸稈粉碎混合而成，混合后采用粉碎機(jī)粉碎在-20℃保存。執(zhí)行試驗(yàn)時(shí)至南京優(yōu)然牧業(yè)有限責(zé)任公司獲取鮮牛糞。農(nóng)村有機(jī)生活垃圾和牛糞的理化性質(zhì)見(jiàn)表1。接種物取自徐州市環(huán)能生態(tài)技術(shù)有限公司，在發(fā)酵罐中使用農(nóng)村有機(jī)生活垃圾37℃±1℃馴化后使用。

表1 底物理化性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置發(fā)酵罐內(nèi)TS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，生活垃圾與牛糞濕重比為3∶1，生活垃圾共進(jìn)料330kg，牛糞進(jìn)料110kg，揮發(fā)性固體含量（volatile solid，VS）為56.354kg。進(jìn)料完成后將農(nóng)村有機(jī)生活垃圾、牛糞與接種物攪拌均勻，取樣測(cè)得發(fā)酵罐內(nèi)TS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.94%。厭氧發(fā)酵裝置為太陽(yáng)能厭氧罐系統(tǒng)（徐州市環(huán)能生態(tài)技術(shù)有限公司，徐州），容積為1m3，臥式發(fā)酵罐，初始pH 7.5，37℃±1℃中溫發(fā)酵，發(fā)酵周期為130天。發(fā)酵裝置配置有甲烷含量檢測(cè)器，實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)可自動(dòng)上傳至云端，沼氣產(chǎn)量采用燃?xì)獗碛?jì)量，通過(guò)監(jiān)控實(shí)時(shí)傳輸數(shù)據(jù)。每10天取樣測(cè)VFAs濃度和氨氮濃度，在發(fā)酵第0 天（B20_1）、第65 天（B20_2）和第130 天（B20_3）取樣進(jìn)行微生物群落分析。

1.3 分析方法

TS 和VS 采用APHA 的方法[21]。試驗(yàn)樣品有機(jī)碳測(cè)定采用稀釋熱法，全氮測(cè)定采用凱氏定氮法[22]。pH 使用pH 計(jì)（LAQ UAtwin-pH-22，日本）直接測(cè)定。VFAs 由氣相色譜儀測(cè)定（島津GC-2014，日本），色譜柱為：DB-FFAP 30m×0.25mm 0.25μm，F(xiàn)ID檢測(cè)器，氮?dú)鉃檩d氣，進(jìn)樣口溫度為250℃，F(xiàn)ID溫度為300℃，分流比為1∶10，柱箱升溫程序?yàn)椋合仍?00℃下保持5min，然后以10℃/min速度升到250℃，保持312min，進(jìn)樣量為1μL[13]。氨氮的測(cè)定采用氨氮快速測(cè)定儀（5B-6D，連華）。微生物群落分析取樣時(shí)在發(fā)酵罐出料口直接出料取發(fā)酵混合物，后離心取樣品固體部分，采用干冰保溫箱寄送至上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序系列工作。微生物群落分析包括DNA 抽提、設(shè)計(jì)合成引物接頭、PCR 擴(kuò)增、構(gòu)建文庫(kù)和Ⅰllumina 測(cè)序。分析完成后在美吉生物云平臺(tái)進(jìn)行分析（https://cloud.majorbio.com）。古菌的引物名稱(chēng)為524F10extF_Arch958RmodR，細(xì)菌的引物名稱(chēng)為338F_806R。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)氣量分析

本批次中試試驗(yàn)共進(jìn)行130天，發(fā)酵過(guò)程中日沼氣產(chǎn)量和累積沼氣產(chǎn)量變化如圖1所示。發(fā)酵系統(tǒng)啟動(dòng)迅速，第2天出現(xiàn)最大峰值。同時(shí)由于發(fā)酵時(shí)間持續(xù)較長(zhǎng)，發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)多次峰值，可能是由于發(fā)酵過(guò)程中季節(jié)跨度較大，環(huán)境溫度變化導(dǎo)致發(fā)酵罐內(nèi)溫度出現(xiàn)波動(dòng)。本試驗(yàn)采用的接種物為中溫發(fā)酵所用，因此溫度變化可能導(dǎo)致不同時(shí)間微生物生命活動(dòng)水平不同，造成沼氣產(chǎn)量的波動(dòng)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)累積沼氣產(chǎn)量為70.585m3，單位VS 沼氣產(chǎn)量達(dá)到了1.253m3/kg，其沼氣產(chǎn)率遠(yuǎn)超實(shí)驗(yàn)室小試的最大值（0.509m3/kg和0.633m3/kg）[2,8]。

圖2為農(nóng)村有機(jī)生活垃圾干式厭氧共發(fā)酵過(guò)程中甲烷含量及甲烷產(chǎn)量變化。甲烷含量的高低可以直觀判斷厭氧發(fā)酵系統(tǒng)運(yùn)行狀況[23]，一般認(rèn)為甲烷體積分?jǐn)?shù)大于50%發(fā)酵系統(tǒng)處于正常運(yùn)行狀態(tài)[23-24]。發(fā)酵開(kāi)始后甲烷含量迅速上升，隨后維持在70%小幅度波動(dòng)。發(fā)酵第63 天甲烷含量出現(xiàn)了降低，在57%穩(wěn)定3天后又上升至70%左右。此次波動(dòng)與該時(shí)間段內(nèi)氣溫降低有關(guān)，較低的氣溫影響太陽(yáng)能系統(tǒng)傳熱效率，需要更長(zhǎng)的時(shí)間維持發(fā)酵罐內(nèi)溫度，造成罐內(nèi)溫度較低。高甲烷含量可能與發(fā)酵過(guò)程中較高的氨氮濃度有關(guān)，在未達(dá)到氨氮抑制濃度之前，更高的氨氮濃度會(huì)導(dǎo)致更高的甲烷含量[7]。發(fā)酵結(jié)束時(shí)單位VS 甲烷產(chǎn)量達(dá)到了0.815m3/kg，對(duì) 比 已 有 文 獻(xiàn)[25-26]報(bào) 道（0.490～0.737m3/kg、0.633m3/kg）的生活垃圾均處于領(lǐng)先水平。這與本次中試試驗(yàn)采用的厭氧發(fā)酵設(shè)備有關(guān)，發(fā)酵罐為臥式厭氧發(fā)酵罐，罐內(nèi)的攪拌裝置可以提供更加充分的攪拌效果，增強(qiáng)發(fā)酵罐內(nèi)傳質(zhì)效率，最終提高甲烷產(chǎn)量。

2.2 氨氮濃度變化分析

氨氮可用作細(xì)胞生長(zhǎng)所需氮源，但過(guò)多的氨氮在發(fā)酵過(guò)程中積累會(huì)對(duì)甲烷合成產(chǎn)生抑制作用[27-29]。分析農(nóng)村有機(jī)生活垃圾干式厭氧共發(fā)酵過(guò)程中氨氮濃度變化，結(jié)合甲烷產(chǎn)生情況可以判斷發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定性。圖3為厭氧發(fā)酵過(guò)程中氨氮濃度變化。發(fā)酵過(guò)程氨氮濃度整體在4200～5200mg/L范圍內(nèi)變化，氨氮濃度顯著高于已有報(bào)道厭氧發(fā)酵過(guò)程中的抑制閾值[30-31]。

圖3 氨氮濃度變化

而穩(wěn)定于70%的甲烷含量和累積0.815m3/kg的甲烷產(chǎn)量說(shuō)明發(fā)酵系統(tǒng)在高效運(yùn)行，該氨氮濃度并未對(duì)系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用。本試驗(yàn)發(fā)酵系統(tǒng)始終處于較高的氨氮環(huán)境中，其甲烷產(chǎn)量說(shuō)明系統(tǒng)是具有高氨氮耐受能力的，產(chǎn)甲烷菌沒(méi)有因?yàn)楦甙钡獫舛榷罅克劳?，這可能與本次發(fā)酵所采用的優(yōu)質(zhì)接種物有關(guān)。接種物使用農(nóng)村有機(jī)生活垃圾進(jìn)行馴化后具有較強(qiáng)的氨氮耐受能力，較高的氨氮濃度為細(xì)菌生命活動(dòng)提供充足的氮源，使得產(chǎn)甲烷菌始終保持較高的活性和數(shù)量，為生產(chǎn)甲烷提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2.3 VFAs濃度變化分析

VFAs主要在厭氧發(fā)酵過(guò)程水解酸化階段產(chǎn)生，水解酸化階段產(chǎn)生更多的VFAs 說(shuō)明對(duì)發(fā)酵底物的分解更加徹底，當(dāng)VFAs 濃度超過(guò)發(fā)酵系統(tǒng)閾值后發(fā)酵系統(tǒng)失衡，產(chǎn)甲烷菌活性被抑制，系統(tǒng)發(fā)生酸化[32]。圖4為農(nóng)村有機(jī)生活垃圾干式厭氧共發(fā)酵過(guò)程中的VFAs濃度變化。圖中可以看出，發(fā)酵前10天VFAs 濃度處于上升階段，發(fā)酵主要處于快速水解和酸化階段，大量的有機(jī)物被細(xì)菌降解為VFAs。高濃度的VFAs 往往伴隨著酸化，本次試驗(yàn)中甲烷含量和產(chǎn)量都處于較高的范圍內(nèi)變化表明該濃度的VFAs并未對(duì)產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生脅迫作用。較高的VFAs濃度也說(shuō)明對(duì)農(nóng)村有機(jī)生活垃圾含有的難降解的纖維素類(lèi)物質(zhì)可能得到了更充分的降解，最終提高甲烷產(chǎn)量。達(dá)到峰值后VFAs 濃度開(kāi)始下降，甲烷含量也快速趨于穩(wěn)定，表明產(chǎn)甲烷菌在正常工作，將利用大量的VFAs生產(chǎn)甲烷。

圖4 VFAs濃度變化

2.4 微生物群落變化

厭氧發(fā)酵過(guò)程中3 個(gè)階段分別由特定的水解菌、產(chǎn)酸菌和產(chǎn)甲烷菌群介導(dǎo)，如果3個(gè)階段失衡則會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的酸化和氨氮抑制等問(wèn)題，最終導(dǎo)致無(wú)法正常產(chǎn)甲烷[33-34]。農(nóng)村有機(jī)生活垃圾干式厭氧共發(fā)酵中試各階段微生物群落組成變化如圖5所示。

圖5 微生物群落結(jié)構(gòu)變化

古菌在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)顯示，干式厭氧發(fā)酵過(guò)程中甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）的相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于其他菌屬，在發(fā)酵的3個(gè)階段其相對(duì)豐度均超過(guò)80%。啟動(dòng)階段Methanosarcina的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位說(shuō)明馴化的接種物具有良好的產(chǎn)甲烷微生物環(huán)境，且為馴化過(guò)程中成長(zhǎng)起來(lái)的適宜進(jìn)行農(nóng)村有機(jī)生活垃圾厭氧發(fā)酵的菌。運(yùn)行階段和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)相對(duì)豐度仍超過(guò)80%，說(shuō)明馴化的接種物完美適配農(nóng)村有機(jī)生活垃圾干式厭氧共發(fā)酵中試。

細(xì)菌的門(mén)分類(lèi)水平顯示厚壁菌門(mén)（Firmicutes）的相對(duì)豐度3個(gè)階段均超過(guò)77%，最高為啟動(dòng)階段的85.39%，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)為83.58%。發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)了輕微波動(dòng)，但在發(fā)酵系統(tǒng)中仍處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，可以保證有充足的細(xì)菌環(huán)境將有機(jī)物代謝成酸，供產(chǎn)甲烷菌利用生產(chǎn)甲烷。擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）從啟動(dòng)階段的3.87%增長(zhǎng)至運(yùn)行階段的13.44%，發(fā)酵過(guò)程中Firmicutes 相對(duì)豐度的輕微降低與Bacteroidota 的增長(zhǎng)有關(guān)。Bacteroidota 可以分泌多種細(xì)胞外水解酶，將葡萄糖、淀粉等轉(zhuǎn)化為乙酸、丁酸、H2和CO2等[35]，同樣利于水解酸化階段的充分進(jìn)行。

2.5 韋恩圖分析

韋恩圖可以直觀對(duì)比中試試驗(yàn)過(guò)程中不同階段共有物種和獨(dú)有物種，古菌和細(xì)菌在OTU 水平的韋恩圖分別如圖6 所示。3 個(gè)時(shí)間段的古菌在OTU水平上有87.50%的菌是共有的，表明古菌在發(fā)酵過(guò)程中保持較高的相似性，較高的相似性表明發(fā)酵系統(tǒng)比較穩(wěn)定，馴化的接種物發(fā)揮作用。啟動(dòng)階段和運(yùn)行階段有1種菌共有，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)有2種菌獨(dú)有。這表明發(fā)酵前后微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒(méi)有其他雜菌生長(zhǎng)影響與產(chǎn)甲烷菌形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，為厭氧發(fā)酵的高效進(jìn)行提供保障。細(xì)菌在OTU水平3個(gè)階段共有核心物種占51.57%，相似性較古菌降低，這是由于在該水平下細(xì)菌物種較多，3個(gè)階段均超過(guò)了800，更多的物種帶來(lái)更多的差異性。古菌的多樣性則較低，3個(gè)階段為22～23。這可能是在高氨環(huán)境下造成的，能正常進(jìn)行生命活動(dòng)的古菌種類(lèi)較少，但其適應(yīng)了高氨環(huán)境，可以正常生產(chǎn)甲烷。發(fā)酵過(guò)程中3個(gè)階段的菌種類(lèi)較接近，表明厭氧發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)細(xì)菌群落穩(wěn)定，厭氧發(fā)酵各階段功能菌群在適宜的環(huán)境發(fā)揮作用。

圖6 古菌和細(xì)菌在OTU水平韋恩圖

微生物群落分析表明，農(nóng)村有機(jī)生活垃圾干式厭氧共發(fā)酵中試試驗(yàn)中水解、酸化和產(chǎn)甲烷階段都有優(yōu)勢(shì)菌存在，生長(zhǎng)情況良好，Methanosarcina和Firmicutes 分別為古菌和細(xì)菌的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌。這為發(fā)酵生產(chǎn)甲烷提供了極佳的微生物環(huán)境，實(shí)現(xiàn)單位VS累積甲烷產(chǎn)量遠(yuǎn)高于已有報(bào)道。

綜上，農(nóng)村有機(jī)生活垃圾干式厭氧發(fā)酵中試試驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)氣情況、VFAs 濃度、氨氮濃度和微生物變化情況表明，此次發(fā)酵試驗(yàn)成功進(jìn)行。發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)部氨氮濃度處于高值，高于一般文獻(xiàn)所報(bào)道的產(chǎn)生抑制作用的閾值。在高氨環(huán)境中，發(fā)酵系統(tǒng)的甲烷體積分?jǐn)?shù)在70%作用，且累積甲烷產(chǎn)量達(dá)到了新的高度。說(shuō)明此次干式厭氧發(fā)酵試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)合理，通過(guò)共發(fā)酵，專(zhuān)用接種物馴化和傳質(zhì)效率較高的太陽(yáng)能發(fā)酵罐共同作用，使得發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)微生物比較契合農(nóng)村有機(jī)生活垃圾等高有機(jī)質(zhì)含量原料。共發(fā)酵使得發(fā)酵系統(tǒng)具有更高的緩沖能力；接種物馴化使得細(xì)菌保障水解更徹底，為產(chǎn)甲烷提供更充分底物，產(chǎn)甲烷古菌具有更高的耐氨能力，在高氨環(huán)境中保持生命活動(dòng)，持續(xù)利用前階段底物生產(chǎn)甲烷；傳質(zhì)效率更高的發(fā)酵罐攪拌更充分，保證發(fā)酵底物與微生物接觸更加充分，防止局部酸化。以上方式共同保障發(fā)酵系統(tǒng)平穩(wěn)運(yùn)行。同時(shí)此次中試試驗(yàn)持續(xù)130天，充分挖掘了農(nóng)村有機(jī)生活垃圾的產(chǎn)氣潛力，這也解釋了其最終產(chǎn)氣量領(lǐng)先于已有研究。

3 結(jié)論

對(duì)農(nóng)村有機(jī)生活垃圾進(jìn)行了干式厭氧共發(fā)酵中試試驗(yàn)，累積甲烷產(chǎn)量達(dá)到了0.815m3/kg，相較于已有文獻(xiàn)報(bào)道處于領(lǐng)先水平。發(fā)酵過(guò)程VFAs 濃度呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，氨氮濃度變化穩(wěn)定，未出現(xiàn)酸化和氨氮抑制現(xiàn)象。微生物群落結(jié)構(gòu)分析表明此次干式厭氧發(fā)酵中試系統(tǒng)的微生物生長(zhǎng)環(huán)境良好，Methanosarcina和Firmicutes分別為古菌和細(xì)菌的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，發(fā)酵各階段達(dá)到了平衡。甲烷產(chǎn)量較高中試規(guī)模的干式厭氧發(fā)酵試驗(yàn)為農(nóng)村有機(jī)生活垃圾沼氣工程建設(shè)提供了有效的數(shù)據(jù)支持。