氨溴索對α-突觸核蛋白寡聚體誘導(dǎo)鼠多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞株MES23.5損傷的預(yù)防作用觀察

鄭淑榮，楊巍巍，高華，杜婷婷

1 北京市神經(jīng)外科研究所中心實驗室，北京 100070；2 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室；3 北京市神經(jīng)外科研究所細(xì)胞生物室；4 北京市神經(jīng)外科研究所功能神經(jīng)外科研究室

帕金森?。≒arkinson's disease， PD）是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，伴有僵直、運動遲緩及震顫等主要癥狀，全球患者超過600萬人，迄今為止尚無可改善疾病的藥物治療方案［1］。當(dāng)前針對PD進(jìn)展的主要治療策略之一是靶向α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn），防止其寡聚體形成、釋放以及在神經(jīng)系統(tǒng)擴(kuò)散［2］。研究［3-5］顯示，α-syn寡聚體水平升高會損傷神經(jīng)元軸突的完整性，導(dǎo)致神經(jīng)元變性，抑制α-syn寡聚體可以改善脂多糖引起的老年小鼠線粒體損傷和神經(jīng)元的凋亡情況。自噬-溶酶體途徑是降解長壽命蛋白質(zhì)α-syn和亨廷頓蛋白的主要途徑，也是清除受損細(xì)胞器的唯一途徑［6］。編碼溶酶體酶β-葡萄糖腦苷脂酶（Glucocerebrosidase，GCase）的GBA1基因突變是PD的最常見危險因素［7］。氨溴索（Ambroxol， AMB）是一種抑制性分子伴侶藥物，自1970年開始作為止咳藥應(yīng)用，不良反應(yīng)小。高通量化合物評估表明，AMB呈pH依賴性增加GCase活性，體內(nèi)外實驗［8-9］顯示AMB可增加GCase活性，并降低α-syn蛋白水平。2022年1—10月，我們觀察了AMB對α-syn寡聚體誘導(dǎo)鼠多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞株MES23.5（帕金森病模型細(xì)胞）損傷的預(yù)防作用，以期為GCase活性降低的家族性和散發(fā)性PD提供潛在的治療策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞分組及藥物給與 PD模型細(xì)胞MES23.5多巴胺能細(xì)胞株由拜爾醫(yī)學(xué)部的Le Weidong教授贈送，使用F12培養(yǎng)基 + 5%胎牛血清在37 ℃條件下、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的MES23.5細(xì)胞分為A、B、C、D組4組，A組細(xì)胞加入二甲基亞砜，B組細(xì)胞加入終濃度為5 μmol/L的α-syn寡聚體，C組細(xì)胞加入終濃度為100 μmol/L的AMB，D組細(xì)胞先加入終濃度為100 μmol/L的AMB預(yù)處理12 h后再加入終濃度為5 μmol/L的α-syn寡聚體。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h用于后續(xù)實驗。

1.2 各組細(xì)胞GCase活性測算 采用ELISA法。取各組細(xì)胞，以2×106個/孔種入6孔板，吸棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞3遍后，胰酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀。在細(xì)胞沉淀內(nèi)加入200 μL裂解液，勻漿后在4 ℃條件下1200×g離心15 min后取上清，繼續(xù)1200×g離心15 min后棄上清，基質(zhì)（0.1 mol/L Na2HPO4·12H2O，0.1 mol/L NaH2PO4·2H2O，pH 7.0）重懸沉淀，即為富含溶酶體溶液。按照GCase活性檢測試劑盒要求的方法操作。準(zhǔn)備一個96孔板，根據(jù)GCase活性檢測試劑盒需要準(zhǔn)備相應(yīng)體積的工作液：200 μL檢測緩沖液 + 8 μL底物液/孔。在96孔板中分別加入超純水、校準(zhǔn)液、樣品和準(zhǔn)備好的工作液，使用酶標(biāo)儀測定405 nm處反應(yīng)前（0 min）的光密度值（OD值），50 ℃水浴30 min后再次測定405 nm處OD值，計算GCase活性。GCase活性=［（OD30min-OD0min）/（OD標(biāo)準(zhǔn)液-OD水）］×250（U/L）。

1.3 各組細(xì)胞α-syn寡聚體水平檢測 采用ELISA法。取各組細(xì)胞，以2×106個/孔種入6孔板，吸棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞3遍后，胰酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀。放入含有200 μL裂解液的1.5 mL離心管中，冰上勻漿30 s，4 ℃條件下12000×g離心30 min，留取上清。用3D5小鼠抗人α-syn單克隆抗體（1 μg/mL）包被酶標(biāo)板，4 ℃過夜，然后用2%牛血清白蛋白封閉，37 ℃孵育2 h，加入事先準(zhǔn)備好的不同質(zhì)量濃度α-syn寡聚體及待檢測樣品，100 μL/孔，于37 ℃孵育2 h。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素抗體（1/20000），37 ℃孵育1 h。以上每次反應(yīng)結(jié)束后用PBST洗4次，每次5 min。最后加入對硝基酚磷酸顯色液（pNpp），37 ℃孵育30 min。使用酶標(biāo)儀測定405 nm處OD值，以吸光度值表示α-syn寡聚體水平。

1.4 各組細(xì)胞增殖能力檢測 采用MTT法。取各組細(xì)胞，以1×104個/孔種入96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，分別加入20 μL的3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（噻唑藍(lán)，5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜100 μL，震蕩10 min后，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測OD450值，實驗重復(fù)3次，取平均值。以O(shè)D450值表示細(xì)胞增殖能力。

1.5 各組細(xì)胞線粒體膜電位檢測 取各組細(xì)胞，以1×106個/孔種入6孔板，胰酶消化細(xì)胞，1000 r/min離心收集細(xì)胞；加入0.5 mL JC-1工作液，培養(yǎng)箱孵育20 min，結(jié)合緩沖液洗細(xì)胞2次，加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度，以紅綠熒光強(qiáng)度比值表示線粒體膜電位。

1.6 各組細(xì)胞酪氨酸羥化酶（TH）磷酸化水平檢測 采用Western Blotting法。取各組細(xì)胞，以PBS沖洗3次，加入非變性裂解液冰上孵育2 h，4 ℃條件下12000×g離心15 min，吸取上清液，采用BCA法檢測蛋白濃度。蛋白電泳后，以濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，采用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入p-TH一抗（1∶1000），TH一抗（1∶8000），4 ℃過夜。用TBST洗膜3次，加入相應(yīng)的二抗孵育1 h，洗膜3次。加入ECL化學(xué)發(fā)光液，檢測條帶，分析灰度值，以磷酸化TH的灰度值/TH的灰度值的比值表示TH磷酸化水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料呈正態(tài)分布時以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞GCase活性比較 A、B、C、D組細(xì)胞GCase活性分別為19.570 ± 0.536、7.767 ± 0.090、29.970 ± 1.770、16.730 ± 1.114，其中B組細(xì)胞GCase活性均低于其余三組（P均＜0.05），C組細(xì)胞GCase活性均高于其余三組（P均＜0.05）。

2.2 各組細(xì)胞α-syn寡聚體水平比較 A、B、C、D組細(xì)胞中α-syn寡聚體水平分別為0.920 ± 0.029、1.663 ± 0.085、0.752 ± 0.047、1.007 ± 0.088，其中B組細(xì)胞中α-syn寡聚體水平均高于其余三組（P均＜0.05），C組細(xì)胞中α-syn寡聚體水平均低于其余三組（P均＜0.05）。

2.3 各組細(xì)胞增殖能力比較 各組細(xì)胞增殖能力比較見表1。由表1可知，與A組相比，B組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h的OD450值均降低（P均＜0.05），D組細(xì)胞培養(yǎng)72 h的OD450值降低（P＜0.05）；與B組相比，C、D組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h的OD450值均升高（P均＜0.05）；與C組相比，D組細(xì)胞培養(yǎng)24、72 h的OD450值均降低（P均＜0.05）。

表1 各組細(xì)胞增殖能力比較（±s）

表1 各組細(xì)胞增殖能力比較（±s）

注：與A組相比，*P＜0.05；與B組相比，#P＜0.05；與C組相比，△P＜0.05。

組別A組B組C組D組OD450值24 h 0.423 ± 0.0180.337 ± 0.018*0.443 ± 0.015#0.390 ± 0.012#△48 h 0.613 ± 0.0200.400 ± 0.025*0.647 ± 0.038#0.527 ± 0.03572 h 0.940 ± 0.0400.450 ± 0.038*0.967 ± 0.041#0.750 ± 0.035*#△

2.4 各組細(xì)胞線粒體膜電位比較 A、B、C、D組細(xì)胞線粒體膜電位分別為3.033 ± 0.262、0.690 ± 0.081、3.523 ± 0.238、2.237 ± 0.086，其中B組細(xì)胞線粒體膜電位均低于其余三組（P均＜0.05），D組細(xì)胞線粒體膜電位均低于A、C組（P均＜0.05）。

2.5 各組細(xì)胞TH磷酸化水平比較 A、B、C、D組細(xì)胞TH磷酸化水平分別為0.697 ± 0.024、0.237 ± 0.023、0.940 ± 0.064、0.573 ± 0.069，其中B組細(xì)胞TH磷酸化水平均低于其余三組（P均＜0.05），C組細(xì)胞TH磷酸化水平均高于其余三組（P均＜0.05）。

3 討論

PD是全球第二大最常見的神經(jīng)退行性疾病，主要發(fā)病人群是老年人，該疾病呈進(jìn)行性加重，表現(xiàn)為運動障礙和多種非運動障礙。迄今為止，PD的確切發(fā)病機(jī)理尚不清楚，但是遺傳學(xué)研究已經(jīng)揭示了在疾病發(fā)病機(jī)理中涉及線粒體功能、α-syn聚集和溶酶體系統(tǒng)失常［10］。最近的遺傳研究［11］表明，幾個溶酶體基因中的變體之間存在明顯的關(guān)聯(lián)。動物和細(xì)胞模型［4］表明，增加GCase活性可以降低α-syn水平。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用GCase激動劑AMB能減輕外源性寡聚體對MES23.5細(xì)胞的損傷，恢復(fù)線粒體膜電位，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

PD的最常見危險因素是GBA1基因突變，該基因編碼GCase蛋白。GCase是一種溶酶體水解酶，可催化葡萄糖基神經(jīng)酰胺水解為葡萄糖和神經(jīng)酰胺。GBA1的純合突變導(dǎo)致功能喪失，引起溶酶體貯積病，稱為高雪氏病。一項包括5691例PD患者和4898例對照的多中心研究表明，PD患者與對照組之間GBA1突變（L444P和N370S）的比值比在整個中心為5.43，與未攜帶GBA1突變的患者相比，攜帶GBA1突變的患者發(fā)病年齡更早，家族性概率更高［12］。尸檢證實攜帶GBA1突變的PD患者腦組織中異常線粒體含量增加，線粒體氧化應(yīng)激和自噬受損［13］。GCase活性受LRRK2活性負(fù)調(diào)節(jié)，抑制LRRK2激酶活性能夠恢復(fù)攜帶LRRK2或GBA1突變的神經(jīng)元的GCase活性，從而挽救與PD相關(guān)的疾病表型［14］。因此，增加GCase活性可能是逆轉(zhuǎn)GBA1突變引起的PD癥狀的有效治療方法。

溶酶體是α-syn降解的主要部位，溶酶體質(zhì)量增加可能導(dǎo)致基礎(chǔ)α-syn降解速率增加［15］。AMB是一種祛痰劑，被發(fā)現(xiàn)可以保護(hù)GCase免于熱變性。AMB處理后，成纖維細(xì)胞基因表達(dá)譜較未處理組溶酶體和自噬相關(guān)基因水平明顯上調(diào)［16］。本研究結(jié)果顯示，AMB處理MES23.5細(xì)胞后，GCase活性明顯上調(diào)，細(xì)胞內(nèi)寡聚體水平均顯著下降，同時受損的線粒體膜電位回升，體現(xiàn)多巴胺能細(xì)胞功能的TH磷酸化水平基本恢復(fù)?？紤]到AMB可以穿越血腦屏障，我們認(rèn)為它可以通過改善葡糖神經(jīng)酰胺酶缺乏細(xì)胞的溶酶體功能，通過充當(dāng)抗氧化劑和增加其清除率來靶向多巴胺能神經(jīng)退行性病變的多個過程［17］。

總之，AMB可通過升高GCase活性、降低α-syn寡聚體水平，恢復(fù)MES23.5細(xì)胞增殖能力、線粒體膜電位、TH磷酸化水平，對α-syn寡聚體誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷起預(yù)防作用，這一結(jié)果證實調(diào)控GCase活性和寡聚體水平可能對PD的治療具有潛在的應(yīng)用價值。