創(chuàng)傷性腦損傷合并肢體骨折后骨折愈合加速機(jī)制的研究進(jìn)展

陸安靜,王庭剛,王瑞烈,楊 光,郭國寧,潘均偉,陸元蘭

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診科,貴州 遵義 563003

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)合并骨折是嚴(yán)重多發(fā)傷的常見類型之一,是目前重要的公共衛(wèi)生問題,而TBI合并骨折患者出現(xiàn)骨折愈合加速的現(xiàn)象已在臨床中被廣泛認(rèn)識。最早于20世紀(jì)60年代,由Gibson和Robert發(fā)現(xiàn)相較于單純肢體骨折患者,TBI合并肢體骨折患者的骨折端有大量骨痂形成,肌肉內(nèi)也有異位骨化現(xiàn)象,證實(shí)TBI可縮短骨折愈合時間。通過骨折斷端生物力學(xué)和影像學(xué)檢查也說明了骨折合并TBI較單純骨折的骨痂密度增加,骨間隙橋接率增高,骨折愈合加速進(jìn)展到重塑階段。因此闡明TBI和骨折之間的關(guān)系具有重要意義,但其具體機(jī)制仍然不明。本文就TBI導(dǎo)致骨折愈合加速的研究進(jìn)展進(jìn)行回顧分析,旨在為更加深入了解該現(xiàn)象背后的機(jī)制,為臨床治療骨折提供參考。

1 TBI后非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)對骨折愈合的影響

1.1微小RNA(microRNA,miRNA) miRNA是一種無編碼蛋白質(zhì)功能,長18～22個核苷酸的單鏈小分子ncRNA,它可以與信使RNA(message ribonucleic acid,mRNA)上的3’非翻譯區(qū)(3’untranslated region,3’UTR)結(jié)合,降解mRNA或直接抑制其翻譯,影響細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化和凋亡[1]。研究發(fā)現(xiàn)TBI合并股骨骨折患者血清及骨痂中的miRNA-26a-5p含量較單純股骨骨折患者明顯增加[2]。高表達(dá)的miRNA-26a-5p直接靶向作用于磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)基因mRNA的3’UTR,下調(diào)PTEN mRNA表達(dá),通過激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)/絲蘇氨酸蛋白激酶(serine protein kinase,AKT)信號通路,促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,加速骨折愈合[2]。另外有研究發(fā)現(xiàn)TBI合并股骨骨折小鼠中,miRNA-92a-3p與整合素結(jié)合唾液酸蛋白mRNA的3’UTR結(jié)合,同樣激活PI3K/AKT信號通路,導(dǎo)致成骨細(xì)胞特異性靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加[3]。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)在多種細(xì)胞系統(tǒng)作為抗凋亡分子,其過表達(dá)與成骨細(xì)胞凋亡減少和成骨基因表達(dá)增加相關(guān)。細(xì)胞周期蛋白(cyclin)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的活性,調(diào)控成骨細(xì)胞周期的進(jìn)行,促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。而Bcl-2和細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)下調(diào)抑制了成骨細(xì)胞分化。有研究發(fā)現(xiàn)TBI合并股骨骨折患者血清內(nèi)miRNA-16-5p的含量明顯低于單純股骨骨折患者,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-16-5p的過表達(dá)顯著抑制小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖,負(fù)向調(diào)控骨折的愈合[4]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miRNA-16-5p通過負(fù)向調(diào)控Bcl-2 mRNA、cyclin D1 mRNA的表達(dá),促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡和抑制成骨細(xì)胞增殖[4]。在TBI合并脛骨骨折患者血清中miRNA-433的表達(dá)低于單純脛骨骨折患者,分泌性磷蛋白1(secretory phosphoprotein 1,SPP1)mRNA和蛋白表達(dá)增加,SPP1可由成骨細(xì)胞分泌,并能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增值[5]。證明是miRNA-433與SPP1mRNA的3’UTR結(jié)合,上調(diào)SPP1 mRNA和蛋白表達(dá),進(jìn)而影響骨折處骨痂的形成[5]。綜上,TBI合并骨折后,通過上調(diào)或下調(diào)miRNA的表達(dá),并與下游相應(yīng)靶點(diǎn)的3’UTR結(jié)合后調(diào)控成骨相關(guān)分子的表達(dá),促進(jìn)骨折愈合。

1.2長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA) lncRNA是一種長度超過200個核苷酸,且不能翻譯蛋白質(zhì)的ncRNA。lncRNA在細(xì)胞中的定位決定它發(fā)揮怎樣的功能,在胞質(zhì)中可通過與mRNA的結(jié)合來調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯和降解;定位在細(xì)胞核中則與DNA的修飾、染色質(zhì)修飾、DNA甲基化等有關(guān)。研究表明lncRNA在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化上有著關(guān)鍵的作用。Wnt/β-catenin信號通路能促進(jìn)骨細(xì)胞增殖和分化、阻止細(xì)胞凋亡,還能促進(jìn)成骨細(xì)胞的前體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的分化和礦化[6]。Jiang等[7]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-抗分化非編碼RNA(lncRNA-differentiation antagonizing nonprotein coding RNA,lncRNA-DANCR)通過激活Wnt/β-catenin信號通路來促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。miR-138和miR-145通過靶向E盒結(jié)合鋅指蛋白2(zinc finger E-box-binding protein 2,ZEB2)抑制Wnt/β-catenin信號通路,負(fù)調(diào)控人BMSCs的成骨分化,而lncRNA-linc-ROR能直接結(jié)合于miR-138和miR-145,抑制它們的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)BMSCs成骨分化[8]。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)在破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化中起著至關(guān)重要的作用,還是BMSCs成骨分化的早期標(biāo)志物。在家兔脛骨骨折中,通過下調(diào)lncRNA-ANCR并觸發(fā)Runx2的表達(dá),能促進(jìn)脛骨骨折愈合[9]。Guo等[10]通過對單純肢體骨折患者以及TBI合并肢體骨折患者的血清進(jìn)行了lncRNA測序,共篩選出了4種高表達(dá)的lncRNA,通過構(gòu)建lncRNA-細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,發(fā)現(xiàn)lncRNA可能通過調(diào)節(jié)嗜堿性粒細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、B細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為,參與TBI加速骨折愈合,但這4種lncRNA在骨折愈合中的具體作用機(jī)制尚未闡明。綜上,lncRNA具有促成骨作用,而TBI后骨折愈合加速可能是通過lncRNA實(shí)現(xiàn)的。

2 TBI后信號素3A(semaphorin 3A,SEMA3A)對骨折愈合的影響

SEMA3A屬于信號素家族中的Ⅲ型分泌型蛋白,具有促進(jìn)樹突分支、軸突生長和引導(dǎo)神經(jīng)元遷移的作用,有研究發(fā)現(xiàn)SEMA3A在免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及骨骼系統(tǒng)中有調(diào)節(jié)作用[11]。研究發(fā)現(xiàn),SEMA3A可能是TBI后骨折愈合加速的重要原因。Yang等[12]證實(shí)小鼠TBI后SEMA3A的表達(dá)上調(diào),并在第3天時達(dá)到峰值。Hayashi等[13]研究證明SEMA3A通過與其功能性受體神經(jīng)氈蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1)結(jié)合后,阻斷下游的免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)和Ras同源基因家族蛋白A(Ras homolog gene family member A,Rho A)信號通路,抑制受體激活核因子-κ配體(receptor activator of nuclear factor κBligand,RANKL)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化,通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路刺激成骨細(xì)胞分化。因此SEMA3A可通過刺激成骨細(xì)胞分化并同時抑制破骨細(xì)胞分化來發(fā)揮成骨作用。由于SEMA3A及其受體也在交感神經(jīng)及感覺神經(jīng)元中表達(dá),因此有研究認(rèn)為SEMA3A是通過調(diào)節(jié)感覺神經(jīng)在骨小梁的分布間接調(diào)節(jié)骨發(fā)育,而不是直接作用于成骨細(xì)胞[14]。此外,在脛骨骨折小鼠骨折處局部注射SEMA3A可以增加骨折處骨痂密度及體積,加速骨的重塑[15]。研究發(fā)現(xiàn)TBI合并脛骨骨折大鼠軟骨痂中軟骨細(xì)胞SEMA3A和NRP-1高表達(dá),而在新生骨小梁周圍成骨細(xì)胞中低表達(dá),推測SEMA3A/NRP-1信號系統(tǒng)通過影響軟骨細(xì)胞分化和增殖,而未能及時調(diào)控成骨細(xì)胞分化,是導(dǎo)致骨折合并TBI后軟骨痂生成較多的原因之一[16]。綜上,SEMA3A與TBI后成骨作用增強(qiáng)密切相關(guān),表明SEMA3A是促進(jìn)骨折愈合的潛在治療靶點(diǎn)。

3 TBI后神經(jīng)肽對骨折愈合的影響

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)是一種由37個氨基酸組成的神經(jīng)肽,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中以脊髓分布最多,大腦皮質(zhì)次之。研究發(fā)現(xiàn)CGRP可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性,對骨折的愈合起調(diào)節(jié)作用。用CGRP培養(yǎng)人成骨細(xì)胞,能上調(diào)人成骨細(xì)胞的β-catenin mRNA表達(dá)量,同時伴隨成骨標(biāo)志基因表達(dá),包括:堿性磷酸酶(alkaline phospatase,ALP)、Ⅰ型膠原、骨鈣素(osteocalcin,OC)、Runx2,進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的分化與成熟,這種上調(diào)作用能被CGRP受體拮抗劑所阻斷[17-18]。Wang等[19]將CGRP加入到體外培養(yǎng)的BMSCs培養(yǎng)液中,應(yīng)用Western Blot檢測培養(yǎng)液中哺乳動物不育系20樣激酶(mammalian sterile 20-like kinase 1/2,Mst1/2)的表達(dá),Mst1/2是Hippo通路的核心分子;又用Hippo通路抑制劑維替泊芬阻斷下游信號,結(jié)果顯示CGRP能有效促進(jìn)Ⅰ型膠原、ALP、Runx2等成骨相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá),Mst1/2的表達(dá)水平也增加;在加入維替泊芬后成骨相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)下降,且Mst1/2表達(dá)也受到抑制,說明CGRP能夠促進(jìn)BMSCs的成骨分化,且Hippo信號通路介導(dǎo)了CGRP作用于小鼠BMSCs的成骨分化過程。進(jìn)一步研究證實(shí)了Hippo/Yap信號通路可能參與了CGRP介導(dǎo)的BMSCs的遷移和成骨[19]。RANKL誘導(dǎo)的核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的激活是破骨細(xì)胞活化和促進(jìn)骨吸收的關(guān)鍵通路,CGRP可抑制該通路的表達(dá),進(jìn)而間接促進(jìn)骨折愈合[20]。Xu等[21]研究發(fā)現(xiàn)TBI合并脛骨骨折家兔血清和腦脊液中的CGRP含量均較單純脛骨骨折明顯增加,推測TBI合并骨折并加速骨折愈合與血清中CGRP的快速增加有關(guān)。

骨折處血運(yùn)重建是骨折愈合的另一個有利條件,這一過程取決于血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的作用,它是公認(rèn)的最有力血管生成因子。Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)CGRP能激活VEGF/VEGFR信號通路的下游信號分子局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK),該物質(zhì)參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和成熟,證實(shí)了CGRP-FAK-VEGF信號通路的成血管作用。Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)TBI合并鎖骨骨折組愈傷組織中的VEGF表達(dá)明顯高于單純鎖骨骨折組,且骨折愈合時間較單純鎖骨骨折組短。

在骨折愈合過程中其他神經(jīng)肽也參與其中,如血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide-Y,NPY)、P物質(zhì)(substance-P,SP)等。VIP和SP均有明顯的擴(kuò)血管作用,通過調(diào)節(jié)血管的功能而加速骨折愈合。破骨細(xì)胞含有神經(jīng)激肽-1受體,SP通過與神經(jīng)激肽-1受體結(jié)合,激活RANK-RANKL信號通路,調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的骨吸收作用[24]。也有研究表明,SP能劑量依賴性地刺激成骨,低濃度SP可刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)ALP、OC以及上調(diào)Runx2蛋白的表達(dá);高濃度SP能促進(jìn)骨細(xì)胞的礦化同時還能促進(jìn)骨吸收,其作用強(qiáng)度比CGRP弱[25]。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后骨痂內(nèi)神經(jīng)肽分泌增加,推測可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,上行系統(tǒng)對周圍神經(jīng)抑制減弱,使骨折處感覺神經(jīng)纖維釋放神經(jīng)肽增加,從而刺激骨痂和軟骨痂大量形成[26]。綜上,TBI后神經(jīng)肽可通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡以及血管的生成來加速骨折愈合。

4 TBI后巨噬細(xì)胞對骨折愈合的影響

以往的研究認(rèn)為骨的愈合只涉及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞,但是目前許多研究表明免疫細(xì)胞對骨的形成、修復(fù)和重塑至關(guān)重要,成骨與破骨過程會和免疫細(xì)胞通過兩者共有的通路來相互調(diào)節(jié),其中巨噬細(xì)胞成為骨免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。在炎癥反應(yīng)中,巨噬細(xì)胞具有吞噬壞死組織和異物的功能,對促進(jìn)組織愈合起重要作用。巨噬細(xì)胞分為兩種表型,促炎型(M1)和抗炎型(M2),M1巨噬細(xì)胞可分泌白細(xì)胞介素3(interleukin-3,IL-3)、IL-4、腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)等促炎因子來促進(jìn)炎癥,同時也增強(qiáng)了M1巨噬細(xì)胞的吞噬功能,加速壞死組織清除,但若巨噬細(xì)胞長期處于M1,會加重組織損傷[27];M2巨噬細(xì)胞分泌抗炎因子,還能促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、組織重塑、生長因子的分泌以及間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的成骨作用[28]。Schlundt等[27]研究發(fā)現(xiàn)骨折愈合對巨噬細(xì)胞有獨(dú)特依賴作用,依賴于M1向M2的轉(zhuǎn)化,M1巨噬細(xì)胞可抑制成骨細(xì)胞分化,而M2巨噬細(xì)胞可表達(dá)轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β,TGF-β)和細(xì)胞介素10(interleukin-10,IL-10),抑制破骨細(xì)胞形成,支持骨沉淀;他們還發(fā)現(xiàn)IL-4和IL-13浸在膠原蛋白支架處,可以使截骨部位骨痂生成及骨再生能力增強(qiáng),同時發(fā)現(xiàn)IL-4和IL-13使巨噬細(xì)胞向M2極化[27]。Zhang等[29]的研究證實(shí)了TBI合并鎖骨骨折組較單純鎖骨骨折組能加速骨折愈合,其骨痂組織的M1巨噬細(xì)胞百分比隨骨折時間延長呈下降趨勢,且該組M2巨噬細(xì)胞的百分比隨時間延長顯著高于單純鎖骨骨折組,同時伴有較大的骨痂體積,認(rèn)為M2巨噬細(xì)胞可能與TBI加速骨折愈合有關(guān)。綜上,M1與M2巨噬細(xì)胞的比例可能是TBI后骨折愈合加速的因素,且早期以M1巨噬細(xì)胞為主,逐漸向M2巨噬細(xì)胞極化。

5 TBI后激素水平對骨折愈合的影響

TBI后由于內(nèi)分泌應(yīng)激反應(yīng),機(jī)體的激素水平會發(fā)生一系列變化,這種變化可能對骨折的愈合產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)TBI中血清瘦素的濃度與骨折處骨痂的體積呈正相關(guān)[30]。瘦素可以從兩個途徑影響骨的代謝過程,一是為瘦素通過調(diào)控由下丘腦控制的交感神經(jīng)沖動來發(fā)揮其抑制成骨的作用,二是存在于血清中的瘦素具有促進(jìn)骨礦化和成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞分化的作用。因此TBI后下丘腦的損傷可能會導(dǎo)致瘦素成骨作用的去抑制,而血腦屏障的破壞使血清中瘦素濃度增加,二者協(xié)同使骨折愈合加快[31]。另外在早期TBI合并四肢骨折患者血清中,生長激素、甲狀旁腺激素水平會出現(xiàn)明顯升高,受傷5周后催乳素水平也會出現(xiàn)顯著升高,認(rèn)為TBI后的這些激素變化與骨折處骨痂形成顯著相關(guān)[32]。在將TBI大鼠的血清轉(zhuǎn)移到肢體骨折大鼠體內(nèi)后,發(fā)現(xiàn)骨折處骨痂形成增加,骨折愈合加速[33]。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與單純TBI和單純肢體骨折患者血清相比,伴有TBI的肢體骨折患者的血清對人成骨細(xì)胞增殖作用更大,推測可能是TBI后大腦產(chǎn)生成骨誘導(dǎo)因子,而血腦屏障的破壞導(dǎo)致成骨誘導(dǎo)因子被釋放入血液循環(huán),從而在局部加速骨折愈合[34]。

6 結(jié)論與展望

骨折愈合過程復(fù)雜、連續(xù)和互相重疊,受到許多病理生理機(jī)制的調(diào)節(jié)。而肢體骨折合并TBI后成骨反應(yīng)增強(qiáng),骨折愈合速度加快的機(jī)制更加復(fù)雜,該結(jié)果受到ncRNA、SEMA3A、神經(jīng)肽、免疫細(xì)胞和激素等因素的調(diào)節(jié)。目前研究較為局限,缺乏整體性的研究以及其中相互作用機(jī)制的探索。如何構(gòu)建一個TBI加速骨折愈合的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制圖,闡明各種作用機(jī)制在其中所發(fā)揮的作用,成為未來研究的關(guān)鍵問題。目前對于骨折的治療方法很多,仍有約10%的患者存在骨折愈合不良或骨不連等情況,探索加速骨折愈合的機(jī)制可為骨折尤其是骨不連的治療提供新的理論依據(jù)并作為臨床指導(dǎo)。

作者貢獻(xiàn)聲明：陸安靜:文獻(xiàn)收集及文章撰寫;王庭剛、王瑞烈:寫作指導(dǎo);楊光:文獻(xiàn)收集;潘均偉:文章校對;郭國寧:寫作指導(dǎo)、文章修改;陸元蘭:文章設(shè)計和審校、文章修改、經(jīng)費(fèi)支持