瘤胃源牛鏈球菌提高紫花苜蓿的青貯品質

■ 蔣 慧 胡光輝 劉曉芳 林 淼*

（1.揚州大學動物科技學院，江蘇揚州 225009；2.江蘇省興化市畜牧獸醫(yī)站，江蘇興化 225700）

苜蓿（Medicago sativa）是奶牛的主要飼料原料之一，由于紫花苜蓿中水溶性碳水化合物（WSCs）含量低、緩沖能力強、附著乳酸菌含量低，導致紫花苜蓿青貯效果往往不理想，乳酸菌因其對健康有益、成本低、能耗低、產量高、具有“公認安全”(GRAS)等優(yōu)點，而被用于解決苜蓿青貯的問題[1-2]。乳酸菌作為苜蓿青貯飼料中的添加劑，可將苜蓿中的WSCs 轉化為乳酸和少量乙酸，從而降低青貯飼料的pH，抑制丁酸梭菌（Clostridium butyricum）等有害微生物的增殖，減少對飼料營養(yǎng)物質的消耗[3]。對于青貯來說，理想的發(fā)酵方式是乳酸菌產生足夠的乳酸，因為在發(fā)酵過程中乳酸含量高意味著氣體等次生代謝產物的減少。此外，還需要一定量的乙酸來保證飼料的好氧穩(wěn)定性。然而，并不是所有的乳酸菌都能產生足夠的乳酸來保證青貯飼料的質量，這通常與飼料與乳酸菌的相容性有關[4]。因此，篩選產乳酸能力強、能提高青貯苜蓿好氧穩(wěn)定性的乳酸菌菌株是很有必要的。

牛鏈球菌（S.equinus）被認為是青貯的乳酸菌接種劑，特點是來自瘤胃而不是飼料，另一個特點是在20 min 內數(shù)量可翻倍，比青貯中使用的乳酸菌要快，是潛在的優(yōu)良青貯菌株[5]。前期研究表明，添加牛鏈球菌能顯著降低象草的pH 和氨態(tài)氮（NH3-N）含量（P<0.05），顯著提高粗蛋白（CP）和干物質（DM）含量（P<0.05）[6]。坦桑尼亞草中添加牛鏈球菌也顯著降低了pH、NH3-N、霉菌含量和腸桿菌含量（P<0.05），顯著提高了干物質含量（P<0.05）[7]。

Streptococcus bovis 實驗室前期研究從奶牛瘤胃中分離出6 株牛鏈球菌，并對其生物學特性進行了測定(https://doi.org/10.3390/fermentation8080385)。將菌株的16S rRNA 序列提交給NCBI（National Center for Biotechnology Information），獲得登錄編號。從獲得的菌株中選擇菌株ON182139、ON182142 和 ON221850作為乳酸青貯菌進行添加。

本研究旨在評價苜蓿中添加牛鏈球菌對紫花苜蓿青貯品質的影響，填補奶牛主要飼料原料中添加牛鏈球菌研究的空白。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株的獲取

從揚州大學高郵實驗農場選取3 頭健康中國荷斯坦奶牛，分離到3株牛鏈球菌。3頭健康中國荷斯坦奶牛均帶有永久性瘤胃瘺管，體重[（625±25）kg]和生理狀態(tài)相似。植物乳桿菌（L.plantarum）FE-1 購自寧夏大北農科技實業(yè)有限公司。

1.2 紫花苜蓿的獲得

紫花苜蓿采自揚州大學江都實驗農場，在現(xiàn)蕾期至初花期，第一茬收獲。

1.3 青貯的處理

苜蓿收獲后，在田間晾至表面無水分，然后運回實驗室。用鍘刀切成1～2 cm的小段后，均勻分成5部分，其中1 組不接種乳酸菌為對照組（CON），其余4 組按106CFU/g 的標準分別添加植物乳桿菌FE-1（CB 組）、牛鏈球菌ON182156（S1 組）、牛鏈球菌ON182157（S2組）、牛鏈球菌ON221872（S3 組）[8]?；旌暇鶆蚝螅疵總€青貯袋（Hiryu KN 型，240 mm×360 mm；Asahika‐sei，東京，日本）1 kg的標準裝袋進行青貯，每組設3個平行。5組分別在第3、6、12、30、60天開袋。用封口機（得力集團有限公司）密封后，置于室內通風陰暗處。

1.4 營養(yǎng)成分分析

1.4.1 青貯常規(guī)養(yǎng)分的測定

青貯料在65 ℃的烘箱（愛思瑞儀器科技有限公司）中烘烤48 h，測定干物質（DM）含量；青貯料在馬弗爐（上海立辰儀器科技有限公司）以550 ℃灼燒3 h，測定飼料粗灰分（Ash）含量；粗蛋白（CP）含量采用凱氏定氮法測定；粗脂肪（EE）含量采用AOAC 法檢測（1990）[9]；中性洗滌纖維（NDF）含量和酸性洗滌纖維（ADF）含量按照Van Soest的方法測定；蒽酮法測定可溶性碳水化合物（WSC）含量。

1.4.2 青貯發(fā)酵品質的測定

取20 g 青貯料放入180 mL 純化水中，輕輕搖晃混合1 min，然后用四層紗布過濾，并用pH 計（儀電科學儀器有限公司）測定濾液的pH；氣相色譜法測定VFAs（華夏科創(chuàng)儀器有限公司），使用CP-WAX 毛細管柱(30 mm×0.53 mm×1 μm)，氣化室溫度為200 ℃，F(xiàn)ID 檢測器溫度為200 ℃，柱溫升溫速率為3 ℃/min，最終達到150 ℃；使用LD-乳酸試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）測定乳酸含量；NH3-N 的含量采用次氯酸苯酚比色法測定。

1.4.3 青貯微生物數(shù)量測定

將上一步所得濾液連續(xù)稀釋至原濾液的1/107，取100 μL 涂布在De Man Rogosa Sharp 培養(yǎng)基（MRS）上（青島海波生物技術有限公司），在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育72 h，測定青貯飼料中的乳酸菌含量，同樣取100 μL 涂布在孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基（青島海波生物技術有限公司）和伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）上，分別在28 ℃和37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，測定霉菌含量和腸球菌含量。

1.4.4 青貯有氧穩(wěn)定性的測定

在青貯60 d結束時打開青貯袋，將每個青貯袋中的青貯飼料倒入一個5 L的玻璃瓶中，松散地放置，將溫度計插入青貯飼料的中心，記錄青貯飼料的發(fā)酵溫度，同時將三個溫度計放置在外部環(huán)境中，記錄環(huán)境溫度，記錄的好氧穩(wěn)定性為青貯飼料內部溫度高于環(huán)境溫度2 ℃的時間[10]。

1.5 數(shù)據分析

試驗數(shù)據用SPSS 24.0 進行雙因素方差分析（Tway ANOVA），使用LSD法進行多次比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 苜蓿青貯常規(guī)營養(yǎng)成分

如表1所示，各組DM 隨時間變化均有所下降，各組干物質在第60 天均顯著低于第0 天(P<0.05)，在第60 天時，試驗組DM 含量顯著高于CON 組（P<0.05），但各試驗組之間差異不顯著（P>0.05）；時間和處理對各組Ash 含量影響較小，各組第60 天和第0 天相比差異不顯著（P>0.05），第60天時各處理間差異同樣不顯著（P>0.05）；各組的CP 含量隨時間變化均有所降低，在第60 天時均顯著低于第0 天（P<0.05），在第60 天時，CB 組和S3組顯著高于其他組（P<0.05）；各組的無氮浸出物受時間和處理的影響較小，第60天和第0天相比差異不顯著（P>0.05），第60天時各組之間差異不顯著（P>0.05）；各組的NDF 和ADF 隨時間變化均顯著下降（P<0.05），在第60 天時各組NDF 之間無顯著差異（P>0.05），試驗組ADF顯著低于對照組（P<0.05）。各組的WSC 隨時間變化均有所下降，在第60 天均顯著低于第0 天(P<0.05)，在第60 天時CB、S2、S3 組均顯著高于對照組（P<0.05）。

表1 青貯苜蓿化學成分的動態(tài)變化

2.2 青貯苜蓿的發(fā)酵品質

如表2 所示，CON、S1、S2 組和S3 組的pH 隨時間變化先升高后降低，除CON 組和S1 組外，其他組的pH 在第60 天顯著下降（P<0.05），CB 組和S3 組的pH顯著低于其他組（P<0.05）；各組乳酸含量均隨時間的變化而先升高后降低，第60 天顯著高于第0 天（P<0.05），其中S3 組顯著高于其他各組（P<0.05）；各組乙酸含量隨時間變化逐漸升高，第60天顯著高于第0天（P<0.05），且在第60 天時,試驗組顯著高于CON 組（P<0.05）；各組的NH3-N 含量隨時間變化均有所升高，在第60天時均顯著高于第0天（P<0.05），在第60天時，CB、S2和S3組顯著低于CON組（P<0.05）。

表2 青貯苜蓿發(fā)酵品質的動態(tài)變化

2.3 苜蓿青貯的微生物數(shù)量

由表3可知，添加乳酸菌后，第3天各組乳酸菌含量達到1×106CFU/g以上，在第12天時達到1×1010CFU/g以上，并且CB、S2、S3組乳酸菌含量顯著高于其他組（P<0.05），在第30 天開始下降，在第60天降至1×106CFU/g左右，各組乳酸菌含量在第60天時均顯著高于第0 天（P<0.05），各組的乳酸菌含量顯著高于CON 組（P<0.05）；腸球菌在0～6 d 持續(xù)增加，在第12 天開始減少，第60 天腸球菌數(shù)量降至最低濃度1×105CFU/g 左右，各組均顯著低于第0 天（P<0.05），CON 組的腸球菌濃度顯著高于其他組（P<0.05）。

表3 添加乳酸菌后苜蓿青貯飼料中乳酸菌、腸球菌和霉菌數(shù)量的變化(lg CFU/g FM)

2.4 添加不同乳酸菌對苜蓿青貯有氧穩(wěn)定性的影響

由圖1 可知，青貯苜蓿開袋60 d 后，CON 組的溫度在126 h 時比環(huán)境溫度高出2 ℃，S1 組的溫度在162 h時比環(huán)境溫度高出2 ℃，而CB、S2組和S3組的添加量沒有達到高于環(huán)境溫度2 ℃，直到開袋后200 h。

圖1 苜蓿青貯過程中溫度的動態(tài)變化

3 討論

青貯飼料是一種相對簡單有效的飼料資源保存方法。青貯飼料的發(fā)酵分為四個階段：①飼料收獲后發(fā)酵筒倉中的初始好氧階段；②乳酸菌生長的發(fā)酵階段；③發(fā)酵穩(wěn)定性階段；④開倉階段。減少飼料干物質損失是青貯飼料的必要條件，在本研究中，盡管第60天時苜蓿的干物質含量與初始值相比有所下降，但牛鏈球菌和植物乳桿菌的添加顯著降低了苜蓿的干物損失?？赡艿脑蚴翘砑又参锶闂U菌和牛鏈球菌可以降低青貯飼料中不良微生物的含量[1]。這一結果與Whiter 等[11]的研究結果一致。從本研究結果來看，青貯苜蓿的好氧細菌明顯減少，但差異不顯著（P>0.05）。

青貯發(fā)酵過程中的CP 損失是由于青貯飼料和青貯飼料中的微生物（如梭菌）的CP 降解過程，產生小肽和氨基酸，進一步降解為NH3-N[12]。在Ding 等[13]的研究中，添加商業(yè)植物乳桿菌、產生阿魏酯酶的植物乳桿菌和生產阿魏酯酶的細菌可以減少粗蛋白的損失，添加植物乳桿菌組的NH3-N顯著低于對照組。在本試驗中，CB 組和S3 組的粗蛋白含量顯著高于對照組（P<0.05），可能的原因是青貯飼料的pH 影響了粗蛋白的降解，當pH 較低時，它會抑制蛋白酶的活性和蛋白質的水解。由于低WSC 含量和高緩沖能力，苜蓿青貯飼料一直具有挑戰(zhàn)性[14]。在之前的報道中，苜蓿青貯發(fā)酵的pH 為4.29～5.01[15]。本研究中，青貯苜蓿中pH較低的S3組粗蛋白含量較高。

中性洗滌纖維是測定飼料中碳水化合物結構的重要指標。NDF 和ADF 含量過高會減少動物的采食量。Lynch 等[16]在苜蓿青貯飼料中添加乳酸菌，對NDF 的降解率沒有顯著影響。在本研究中，各組的ADF隨著青貯時間的變化而逐漸降低，并且在60 d時ADF 含量顯著低于初始ADF 含量，這與Bai 等[17]的研究結果一致。

當膳食脂質為動物提供能量時，它們的熱量獲得和消耗是最低的。將脂質的可消化能量或代謝能量轉化為凈能量的效率高于碳水化合物和蛋白質。因此，飼料中經常添加一定量的脂肪來代替碳水化合物和蛋白質，從而減少消化過程中的能量，減少熱量的獲得和消耗，并增加凈能量，提高飼料的動物消化率[18]。在本試驗中，將乳酸菌添加到苜蓿中，各組的粗脂肪含量均有所增加趨勢，可能原因是青貯苜蓿中前期生長繁殖的微生物在死亡分解后，含有磷脂的雙層細胞膜被釋放，增加了青貯苜蓿的粗脂肪含量。

青貯飼料pH的降低是由于乳酸和乙酸的積累[1]，青貯過程中的乙酸含量是一個消極的指標，代表干物質的消耗[12]，然而，乙酸同樣被認為是提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性的唯一物質，而乳酸是青貯飼料中濃度最高的酸，對pH 的降低也貢獻最大[20]。傳統(tǒng)青貯飼料的pH 應低于4.2，乳酸含量應為4%～6%[19]。由于苜蓿自身WSC的限制，苜蓿不能達到這一標準。在Zhao等[1]的研究中，苜蓿青貯中植物乳桿菌ZZU203 的最低pH不超過5.0，但乳酸含量可以達到干物質的6%，這與本試驗的結果一致。

青貯過程中微生物區(qū)系在不斷變化[21]，腸球菌是發(fā)酵青貯飼料中的常見菌，腸球菌會與青貯飼料中的乳酸菌競爭WSC，導致青貯飼料氣體的產生和營養(yǎng)價值的下降[22]。青貯苜蓿中的腸球菌在第12 天開始減少。這也是由于乳酸菌數(shù)量的增加，導致pH 下降，腸球菌數(shù)量減少。

乙酸可以提高青貯飼料的需氧穩(wěn)定性。能夠提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性最常見的乳酸菌是布魯氏菌（Lactobacillus brucelli,L.brucelli）[23]。然而，L.brucelli在青貯飼料的后期產生乳酸，生產商希望在青貯飼料的前30 d生產足夠的乙酸，以解決因打開筒倉而導致的需氧腐敗問題[24]。研究表明，當乙酸含量為青貯玉米干物質的2.62%時，青貯的好氧穩(wěn)定性可以顯著提高[25]。在本試驗中，苜蓿在第60天的乳酸菌添加量可以達到相同的水平，但在第30天，乙酸含量不足。

4 結論

添加牛鏈球菌后，苜蓿的青貯品質得到了改善，尤其是減少了DM 和WSC 的消耗，降低了青貯pH 和NH3-N 的含量，提高了LA 的含量，同時也顯著降低了牧草中不利于發(fā)酵的腸球菌含量，提高了苜蓿的有氧穩(wěn)定性，建議在苜蓿中添加牛鏈球菌作為一種新的青貯接種劑。