幾種提取方法制備的糙刺參體壁膠原蛋白的特性分析

鄭清瑤,曹文紅,2*,韓昱梁,張峰寧,陳忠琴,2,林海生,2,鄭惠娜,2

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院,國(guó)家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江),廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心,廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室,水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江,524088)2(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,大連工業(yè)大學(xué),遼寧 大連,116034)

膠原蛋白由3條相互纏繞的多肽α鏈組成,形成三螺旋結(jié)構(gòu),分子質(zhì)量為105 kDa[1]。因其具備良好的低抗原性、生物降解性和生物相容性等特性,在食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用[2]。牛、豬等陸生動(dòng)物是膠原蛋白的主要來(lái)源,但由于牛海綿狀腦病和口蹄疫等人畜共患疾病及宗教約束,限制了陸生動(dòng)物膠原蛋白的使用[3],因此迫切需要尋找膠原蛋白替代來(lái)源。水產(chǎn)來(lái)源的膠原蛋白因其不存在傳染性疾病和宗教倫理問題而備受關(guān)注,目前已開發(fā)應(yīng)用且研究較多的水產(chǎn)源膠原蛋白主要是魚皮、魚鱗和魚骨膠原蛋白,如云南鯛魚骨膠原蛋白[4]、大眼金槍魚皮和魚骨膠原蛋白[5]。

海參屬于棘皮動(dòng)物門、海參綱,是重要的海洋生物資源,主要分布于印度洋、西太平洋海區(qū),全球有900多種,我國(guó)約140種[6]。我國(guó)海參分布在溫帶區(qū)和熱帶區(qū),其中西沙群島、南沙群島和海南島是我國(guó)熱帶海參的主要產(chǎn)地。海參在各類山珍海味中位尊“八珍”,具有補(bǔ)益養(yǎng)生功效,藥用價(jià)值較高;此外海參具有“吐臟、再生”等特性,再生和創(chuàng)傷修復(fù)能力強(qiáng),可能與其體壁富含膠原蛋白有關(guān)[7]。糙刺參(Stichopushorrens),俗稱黃肉、方參,是一種廣泛分布于我國(guó)南海海域的野生熱帶海參,資源量大,但目前對(duì)其加工利用甚少。關(guān)于糙刺參食品化學(xué)特性特別是膠原蛋白組成及其特性分析方面尚未見報(bào)道。

膠原蛋白傳統(tǒng)提取方法有酸法、酶法、熱水提取等。近年來(lái),超聲波輔助提取技術(shù)因高效節(jié)能、經(jīng)濟(jì)可行、綠色環(huán)保等特點(diǎn)應(yīng)用廣泛[8]。熱水提取時(shí)的高溫會(huì)破壞膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu),此法不具備應(yīng)用價(jià)值;酸法提取的優(yōu)點(diǎn)是純度高,缺點(diǎn)是提取時(shí)間長(zhǎng)、污染環(huán)境;酶法提取雖具備提取過程無(wú)污染、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn),但成本較高是限制其發(fā)展的一個(gè)因素;而超聲波輔助提取作為一種新興的膠原蛋白提取方法,具有產(chǎn)率高、提取時(shí)間短、不破壞結(jié)構(gòu)等諸多優(yōu)點(diǎn),但使用時(shí)應(yīng)控制超聲波時(shí)間和頻率。本研究以糙刺參為原料,采用酸法、酶法、超聲波輔助酸法、超聲波輔助酶法等提取糙刺參體壁膠原蛋白,比較分析不同方法提取的膠原蛋白提取率、結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì),以期為后續(xù)糙刺參體壁膠原蛋白的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

糙刺參購(gòu)于海南省瓊海市潭門海鮮市場(chǎng),去除內(nèi)臟和內(nèi)壁肌肉后于-20 ℃凍藏。

胃蛋白酶(豬胃黏膜)(高純,1∶10 000),上海源葉生物科技有限公司;EDTA、NaOH、NaCl、乙酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純,西隴科學(xué)股份有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、羥脯氨酸含量檢測(cè)試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、考馬斯亮藍(lán)超快染色液,上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HJ-6AS六聯(lián)恒速恒溫磁力攪拌器,常州金壇良友儀器有限公司;Thermo Lynx 6000高速落地離心機(jī),賽默飛世爾科技有限公司;FS-1200N超聲波處理器,上海生析超聲儀器有限公司;Cary 60紫外可見分光光度計(jì),上海精科實(shí)業(yè)有限公司;TENSOR 27傅里葉紅外光譜儀,德國(guó)Bruker公司;GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng),美國(guó)伯樂公司;Chirascan V100圓二色光譜儀,英國(guó)應(yīng)用光物理公司;DSC-300C差示掃描量熱儀,南京大展檢測(cè)儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 糙刺參體壁預(yù)處理

解凍后的糙刺參體壁切成碎塊,稱取40 g碎塊,以1∶10(g∶mL)的料液比加入蒸餾水磁力攪拌30 min,清洗糙刺參,紗布過濾,取糙刺參碎塊,按料液比1∶10(g∶mL)加入0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0,4 mmol/L EDTA),攪拌24 h。紗布過濾,糙刺參碎塊清洗2遍后于蒸餾水中攪拌24 h,糙刺參溶解于溶液中,13 000 r/min離心30 min,所得膠原沉淀按料液比1∶20(g∶mL)加入0.1 mol/L NaOH,去除色素和非膠原蛋白,攪拌72 h,沉淀反復(fù)水洗至中性備用。所有操作步驟均在4 ℃下進(jìn)行。

2.2 糙刺參體壁膠原蛋白的提取

2.2.1 酸法提取

參考AHMED等[9]的方法,稍作修改。預(yù)處理后的膠原沉淀按料液比1∶25(g∶mL)加入0.5 mol/L乙酸溶液,攪拌48 h。13 000 r/min離心45 min,取上清液,加入NaCl至終濃度為0.9 mol/L,攪拌2 h,靜置過夜。離心收集沉淀,加入少量0.5 mol/L乙酸復(fù)溶后裝入透析袋,用0.1 mol/L乙酸透析1 d、蒸餾水透析2 d,直至1% AgNO3檢驗(yàn)不出現(xiàn)白色沉淀即表示透析結(jié)束,冷凍干燥后制得酸溶性膠原蛋白(acid-soluble collagen, ASC)。

2.2.2 酶法提取

參考ABEDIN等[10]的方法,稍作修改。預(yù)處理后的膠原沉淀按料液比1∶20(g∶mL)加入含有2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胃蛋白酶的0.5 mol/L乙酸溶液,攪拌48 h。13 000 r/min離心45 min,取上清液,加入NaCl至終濃度為0.9 mol/L,攪拌2 h,靜置過夜。離心取沉淀復(fù)溶于少量0.5 mol/L乙酸,裝入透析袋內(nèi)于0.02 mol/L Na2HPO4(pH 8.0)中透析2 d使胃蛋白酶失活,再分別用0.1 mol/L乙酸和蒸餾水透析1 d和2 d,透析檢驗(yàn)方法同2.2.1節(jié),冷凍干燥后制得酶溶性膠原蛋白(pepsin-solubilized collagen, PSC)。

2.2.3 超聲波輔助酸法提取

參考ALI等[11]的方法,稍作修改。預(yù)處理后的膠原沉淀按料液比1∶15(g∶mL)加入0.5 mol/L乙酸溶液,360 W超聲波處理20 min。超聲波處理過程中利用低溫恒溫槽將樣品的溫度保持在4 ℃,使用溫度傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溫度。為避免過熱,采取脈沖模式,即超聲波10 s,暫停5 s。處理結(jié)束后,連續(xù)攪拌48 h進(jìn)行提取。鹽析、透析操作過程同2.2.1節(jié),冷凍干燥后制得超聲波輔助酸溶性膠原蛋白(ultrasound-assisted extraction of acid-soluble collagen, UASC)。

2.2.4 超聲波輔助酶法提取

參考ALI等[11]的方法,稍作修改。預(yù)處理后的膠原沉淀按料液比1∶15(g∶mL)加入0.5 mol/L乙酸溶液,480 W超聲波處理20 min,并使用如2.2.3節(jié)所述的脈沖模式。超聲波處理結(jié)束后,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的胃蛋白酶,攪拌48 h進(jìn)一步提取。鹽析、透析操作過程同2.2.2節(jié),冷凍干燥后制得超聲波輔助酶溶性膠原蛋白(ultrasound-assisted extraction of pepsin-solubilized collagen, UPSC)。

2.3 膠原蛋白提取率的測(cè)定

參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測(cè)定》測(cè)定樣品中羥脯氨酸含量。糙刺參膠原蛋白提取率計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:X,膠原蛋白提取率,%;ω,樣品的羥脯氨酸質(zhì)量濃度,μg/mL;V,樣品體積,mL;D,稀釋倍數(shù);11.1,羥脯氨酸與膠原蛋白的換算系數(shù);m,糙刺參體壁的膠原蛋白含量,g。

2.4 SDS-PAGE分析

參考SONG等[12]的方法,稍作修改。采用8%分離膠和5%濃縮膠,并用6.5～270 kDa的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算蛋白質(zhì)條帶分子質(zhì)量。取膠原蛋白凍干品2 mg溶于0.5 mol/L乙酸溶液,配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的膠原蛋白溶液,與2×上樣緩沖液以1∶1的體積比例混勻,100 ℃加熱8 min,5 000 r/min離心5 min,取15 μL上清液上樣。采用直流恒壓電源進(jìn)行電泳,電流40 mA,電壓100 V。電泳結(jié)束后進(jìn)行染色和脫色,直至背景顏色為無(wú)色后進(jìn)行凝膠成像系統(tǒng)分析。

2.5 紫外光譜分析

參考LI等[13]的方法,稍作修改。稱取10 mg膠原蛋白凍干品溶于0.5 mol/L乙酸溶液,配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的膠原蛋白溶液,12 000 r/min離心15 min,取上清液進(jìn)行掃描分析。掃描波段為200～400 nm,速度為2 nm/s,波長(zhǎng)間隔1 nm。以0.5 mol/L乙酸溶液作為空白對(duì)照。

2.6 傅里葉變換紅外光譜分析

取1 mg膠原蛋白凍干品與100 mg干燥的KBr混合,置于瑪瑙研缽中研磨均勻,使用壓片機(jī)壓片。掃描區(qū)間400～4 000 cm-1,掃描次數(shù)32次,速度0.2 cm/s,分辨率4 cm-1。以KBr作為測(cè)量時(shí)的背景光譜。

采用PeakFit v4.12軟件對(duì)紅外光譜的酰胺I帶(1 600～1 700 cm-1)進(jìn)行基線校正,Gaussian去卷積,利用二階導(dǎo)數(shù)進(jìn)行多次擬合將最小殘差重疊的不同譜帶分開,并根據(jù)各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系,計(jì)算各子峰面積占比,從而得到各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

2.7 熱穩(wěn)定性分析

膠原蛋白凍干品以料液比1∶40(g∶mL)溶于0.5 mol/L乙酸溶液,在4 ℃下靜置2 d后測(cè)定熱變性溫度(Td)和熔融溫度(Tm)。稱取10 mg膠原蛋白溶液置于鋁坩堝中,以空坩堝為參比,掃描溫度范圍為20～150 ℃,升溫速率3 ℃/min,所有測(cè)定均在N2氣氛下進(jìn)行。

2.8 圓二色光譜分析

取適量膠原蛋白凍干品溶于0.5 mol/L乙酸溶液,配制質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的膠原蛋白溶液,10 000 r/min離心15 min,取200 μL上清液于光程為0.5 mm的比色皿中進(jìn)行掃描測(cè)定。N2壓力為0.4 MPa,掃描波長(zhǎng)范圍為190～260 nm,寬帶1 nm,響應(yīng)時(shí)間0.5 s。以0.5 mol/L乙酸溶液作為空白對(duì)照。

2.9 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果使用JMP 14.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05),應(yīng)用Origin 9.8軟件繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 糙刺參膠原蛋白提取率

如圖1所示,與膠原蛋白傳統(tǒng)提取方法相比,超聲波輔助提取方法的提取率更高,即UASC和UPSC的提取率顯著高于ASC和PSC(P<0.05)(以濕重計(jì)),推測(cè)是由于超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)在一定程度上增大了膠原蛋白的孔隙度,促進(jìn)了膠原蛋白的溶出。

圖1 不同提取方法下糙刺參體壁膠原蛋白的提取率

由圖1可知,ASC的提取率僅為0.15%,其原因可能是膠原蛋白端肽區(qū)域的交聯(lián)導(dǎo)致膠原蛋白在酸性條件下較難溶解,PSC的提取率為2.14%,加入胃蛋白酶后,裂解了端肽區(qū)域的交聯(lián)分子,促使膠原蛋白在酸性條件下的溶解度提高,進(jìn)而導(dǎo)致PSC的提取率高于ASC[10]。該結(jié)果與大紅海參皮ASC(3.4%)和PSC(20.8%)(以干重計(jì))[14]、黃鰭金槍魚魚囊ASC(1.07%)和PSC(12.10%)(以干重計(jì))[15]的結(jié)果類似。以上結(jié)果表明,胃蛋白酶通過裂解膠原的端肽區(qū)域促進(jìn)膠原蛋白的提取,超聲波的空化效應(yīng)也促進(jìn)了溶液的分子運(yùn)動(dòng)。這2種作用綜合在一起同時(shí)促進(jìn)了胃蛋白酶的滲透和基質(zhì)的傳遞,因此超聲波與胃蛋白酶的結(jié)合有效提高了膠原蛋白的提取率,與RAN等[16]的研究結(jié)果一致。由于糙刺參ASC提取率極低,未作為后續(xù)研究對(duì)象。

3.2 膠原蛋白的SDS-PAGE分析

如圖2所示,3種方法提取的膠原蛋白的亞基組成及分子質(zhì)量分布趨勢(shì)基本一致,均由α1、α2、β、γ等4條鏈組成,與海蜇膠原蛋白[2]、斑點(diǎn)叉尾鮰魚皮膠原蛋白[17]的電泳結(jié)果一致。α1鏈的分子質(zhì)量為135 kDa,α2鏈的分子質(zhì)量為116 kDa,并且α1的條帶光密度是α2的2倍,因此3種膠原蛋白亞基組成可能為(α1)2α2,符合I型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征[18]。β鏈的出現(xiàn)說明膠原蛋白存在分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)作用[19]。圖2顯示PSC和UPSC存在一些低分子條帶,推測(cè)是因?yàn)樘崛∵^程中胃蛋白酶使部分膠原蛋白降解成小分子組分所致[19],UASC的低分子條帶則可能是由于超聲波產(chǎn)生的剪切力使一部分膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生降解。綜上,3種膠原蛋白的基本組成類似,說明超聲波不會(huì)破壞膠原蛋白的亞基組成[20]。

1-PSC;2-UPSC;3-UASC

3.3 膠原蛋白的紫外光譜分析

圖3 糙刺參體壁膠原蛋白的紫外吸收光譜圖

3.4 膠原蛋白的傅里葉變換紅外光譜分析

圖4 糙刺參體壁膠原蛋白的紅外吸收光譜圖

通過對(duì)酰胺Ⅰ帶進(jìn)行去卷積處理,可以反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)。1 600～1 640、1 640～1 650、1 650～1 660、1 660～1 670 cm-1分別表示β折疊、無(wú)規(guī)則卷曲、α螺旋、β轉(zhuǎn)角。圖5為糙刺參膠原蛋白酰胺I帶的高斯曲線擬合圖,結(jié)合圖6可發(fā)現(xiàn),3種膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量有所不同。與PSC相比,UPSC、UASC的α螺旋含量降低,β折疊和β轉(zhuǎn)角含量增加,并且經(jīng)過超聲波處理后,膠原蛋白不存在無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu),這與黃丹丹等[26]的研究結(jié)果相似。以上結(jié)果說明超聲波處理破壞了維持膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分子間作用力,使氫鍵斷裂,促使α螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B和β轉(zhuǎn)角,超聲波處理的過程中暴露了更多的三螺旋區(qū)位點(diǎn),促進(jìn)了膠原蛋白的溶出。

a-PSC;b-UPSC;c-UASC

圖6 糙刺參體壁膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量

3.5 膠原蛋白的熱穩(wěn)定性分析

膠原蛋白的熱穩(wěn)定性通常由熱變性溫度(Td)和熔融溫度(Tm)描述。熱變性溫度指的是膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞,分解成無(wú)規(guī)則卷曲的溫度。熔融溫度定義為膠原蛋白的物理形態(tài)由固體轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w的溫度。膠原蛋白的熱穩(wěn)定性與亞氨基酸含量、棲息地環(huán)境溫度和生物體體溫有關(guān)[9]。

糙刺參PSC、UPSC、UASC的熱穩(wěn)定性如圖7和表1所示,3種膠原蛋白均有2個(gè)吸熱峰,第1個(gè)吸熱峰為膠原蛋白的熱變性溫度,分別為21.3、25.9、27.0 ℃,與刺參(22.3 ℃)[6]相近,低于尖吻鱸魚鱗(37.54 ℃)和魚皮膠原蛋白(36.74 ℃)[27]、小牛皮膠原蛋白(40.07 ℃)[28],但高于大紅海參皮(18.5 ℃)和結(jié)締組織膠原蛋白(17.9 ℃)[14]。第2個(gè)吸熱峰為膠原蛋白的熔融溫度,與多肽鏈的斷裂有關(guān)[18],分別為92.4、91.3、90.1 ℃,低于鱘魚皮Ⅰ型(116.01 ℃)和Ⅴ型膠原蛋白(122.86 ℃)[18]、中華鱉酸溶性膠原蛋白(111.0 ℃)和UASC(120.66 ℃)[29]。綜上所述,與傳統(tǒng)提取方法相比,超聲波輔助提取顯示出更高的熱變性溫度,說明經(jīng)過超聲波處理后,膠原蛋白的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,熱穩(wěn)定性更好[8]。

表1 糙刺參體壁膠原蛋白的熱穩(wěn)定性

圖7 糙刺參體壁膠原蛋白的DSC曲線

3.6 膠原蛋白的圓二色光譜分析

蛋白質(zhì)的圓二色性可較直觀的反映蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)信息,因此常用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析。如圖8所示,橢圓度略有偏差,表明3種膠原蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了微小的變化。PSC、UPSC、UASC分別在223、222、223 nm存在較弱的正吸收峰,主要表現(xiàn)為β折疊及無(wú)規(guī)則卷曲的疊加吸收,是左旋聚脯氨酸構(gòu)型的圓二色譜典型特征[30]。PSC、UPSC、UASC分別在199、198、198 nm出現(xiàn)明顯的負(fù)吸收峰。正吸收峰與負(fù)吸收峰的比值(Rpn)是表征膠原三螺旋結(jié)構(gòu)完整性的參數(shù),其比值越大,說明膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)越完整。圖8結(jié)果顯示,UPSC的Rpn大于PSC和UASC,表明UPSC具有更完整的三螺旋結(jié)構(gòu),再次說明超聲波不會(huì)破壞膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu),與鯉魚皮膠原蛋白[11]的結(jié)果相似。

圖8 糙刺參體壁膠原蛋白的圓二色光譜圖

4 結(jié)論

本研究以糙刺參體壁為對(duì)象,采用酸法、酶法、超聲波輔助酸法和超聲波輔助酶法提取膠原蛋白,對(duì)比分析了不同方法提取的膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。結(jié)果表明,UASC和UPSC的提取率顯著高于ASC和PSC(P<0.05);SDS-PAGE圖譜顯示PSC、UPSC、UASC亞基組成均為(α1)2α2;紫外光譜表明,PSC、UPSC、UASC在280 nm處均無(wú)吸收峰;紅外光譜顯示,PSC、UPSC、UASC均含有典型的膠原蛋白特征吸收峰,酰胺Ⅰ帶去卷積結(jié)果顯示超聲波處理使膠原蛋白α螺旋含量降低,β折疊和β轉(zhuǎn)角含量增加;DSC曲線顯示,與傳統(tǒng)提取方法相比,超聲波輔助提取顯示出更好的熱穩(wěn)定性;圓二色光譜表明UPSC具有更完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。

綜上,糙刺參體壁膠原蛋白為I型膠原蛋白,3種提取方法均保持了膠原蛋白完整的三螺旋結(jié)構(gòu),且在不影響膠原蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的前提下,超聲波處理能有效提高膠原蛋白的提取率。本研究不僅為糙刺參體壁的精深加工提供基礎(chǔ)依據(jù),還為糙刺參體壁膠原蛋白在食品、化妝品和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用提供一定科學(xué)依據(jù)。